山莨菪堿緩解幼齡鼠缺氧缺血性腦組織形態(tài)和功能損傷

朱渝， 魏靜， 吳鵬程， 袁瀟， 周振華， 李敏

1.重慶市第七人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400054； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 402160；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400038

缺氧缺血性腦病于新生兒較多發(fā)，臨床表現(xiàn)主要有興奮或遲鈍，嚴(yán)重時(shí)會(huì)發(fā)生肌張力松軟甚至昏迷，該病常伴隨學(xué)習(xí)困難、癲癇、腦癱等后遺癥，嚴(yán)重影響人類生命健康和生活質(zhì)量[1～3]。研究表明，缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）發(fā)病機(jī)制主要有腦血流改變、腦血管自主調(diào)節(jié)功能障礙和腦組織代謝改變等[4]。目前，臨床治療以營(yíng)養(yǎng)腦細(xì)胞藥物配合康復(fù)訓(xùn)練為主，但治療效果不確切，因此，探尋新的治療藥物至關(guān)重要[5]。山茛菪堿是從茄科植物唐古特山茛菪中分離得出的生物堿，具有外周抗膽堿、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、血栓形成、腦梗死、癱瘓、腦血管痙攣、血管神經(jīng)性頭痛、閉塞性血栓性脈管炎等藥理作用[6～8]，但山茛菪堿在缺氧缺血性腦損傷中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立缺氧缺血性腦損傷幼鼠模型，探究山茛菪堿在幼鼠腦組織形態(tài)損傷和神經(jīng)元功能損傷中的調(diào)節(jié)作用，為其在缺氧缺血性腦病中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠50只，雌雄各半，1～2周齡，體質(zhì)量12～18 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0008，使用許可證號(hào)SYXK（京）2017-0033。

1.1.2 藥物、試劑及儀器 山茛菪堿（純度≥98%）購(gòu)自成都鈉鈳鋰生物公司（CAS17659-49-3），HE染色試劑盒、TUNEL試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，SOD、MDA、GSH-Px和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，TRIzol和RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，HRP標(biāo)記的二抗、cas-3、cas-9、Bax、Bcl-2、BDNF、NGF兔來(lái)源的單克隆抗體購(gòu) 自 美 國(guó) Abcam 公 司（ab184787、ab191468、ab182734、ab117115、ab226843、ab256584）。ABI 7500 Real-Time PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，脫 色 搖 床（Servicebio，TSY-B），掌 上 離 心 機(jī)（Servicebio，MX-F），組織攤片機(jī)（浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司），病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，RM2016），酶 標(biāo) 儀（Rayto，RT-6100），移 液 槍（Dragon，KE0003087／KA0056573），臺(tái)式高速離心機(jī)（DRAGONLAB，D3024R），光學(xué)顯微鏡（日本尼康，Eclipse E100）。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物分組、建模及取材 將50只幼齡鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組、模型組、模型+2.5 mg/kg山茛菪堿組、模型+5 mg/kg山茛菪堿組、模型+10 mg/kg山茛菪堿組共5組（n＝10）。飼養(yǎng)條件：每只大鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴(yán)格規(guī)范的卡片登記管理，24℃、濕度40%～70%條件下自由攝食飲水飼養(yǎng)，建模前24 h禁食不禁水。模型加藥組分別采用尾靜脈注射2.5、5、10 mg/kg山茛菪堿[9]，健康對(duì)照組和模型組注射等量的生理鹽水。6 h后采用Rice-Vannucci法建立HIBD幼齡鼠模型[10]：取模型組和模型加藥組大鼠，用10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后置于手術(shù)臺(tái)上固定，手術(shù)過(guò)程控制為無(wú)菌環(huán)境，頸部消毒，頸部正中切口，剝離頸總動(dòng)脈，右側(cè)頸總動(dòng)脈雙結(jié)扎后切斷，手術(shù)后將大鼠置于缺氧倉(cāng)內(nèi)（倉(cāng)內(nèi)環(huán)境：8%O2、92%N2、37℃），2 h后進(jìn)行自然通氣。健康對(duì)照組只切口并縫合，不結(jié)扎頸總動(dòng)脈和缺氧處理。參照Longa法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能損傷[11]，48 h后斷頭處死大鼠并取腦，部分腦組織用4%多聚甲醛固定，剩余腦組織凍存用于分子實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 檢測(cè)腦指數(shù)和腦含水率 采用干濕重法測(cè)定各組大鼠腦組織腦含水率和腦指數(shù)。斷頭法處死大鼠并取腦，剝?nèi)ツX膜、小腦和腦干，用0.1 mmol磷酸鹽緩沖清洗，濾紙吸干并稱取腦質(zhì)量[12]。取左腦并稱取濕質(zhì)量；隨后置于70℃烘箱中干燥24 h，取出并稱取其干質(zhì)量，計(jì)算腦含水率、腦指數(shù)。腦含水率（%）＝（左腦濕質(zhì)量-左腦干質(zhì)量）/左腦濕質(zhì)量×100%；腦指數(shù)（%）＝腦質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.3 HE染色觀察腦組織病理?yè)p傷 取4%多聚甲醛固定的大鼠腦組織，石蠟包埋切片，切片厚度為3 μm，將切片浸入二甲苯和濃度梯度無(wú)水乙醇中60 min進(jìn)行脫蠟水洗，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，再將切片放入無(wú)水乙醇和二甲苯中透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察組織病理?yè)p傷形態(tài)學(xué)變化并拍照記錄。細(xì)胞核被染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被染成淡紅色或紫色。

1.2.4 TUNEL染色觀察腦海馬神經(jīng)元周圍組織細(xì)胞凋亡 取各組大鼠海馬神經(jīng)元周圍組織于4%多聚甲醛溶液中充分固定，48 h后進(jìn)行脫水、浸蠟和包埋,嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行染色。陽(yáng)性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞被染成棕黃色或褐色，非凋亡細(xì)胞呈藍(lán)色。1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取出預(yù)先凍存的大鼠腦組織，室溫自然解凍后用手術(shù)剪將組織剪切成小塊放入研磨儀中研磨均勻，4℃、10000 r/min離心10 min棄上清，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白總濃度，每孔上樣20μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入cas-3、cas-9、Bax、Bcl-2、BDNF、NGF兔來(lái)源的單克隆一抗（1：500），4℃搖床孵育過(guò)夜，次日加入HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗（1：4000），室溫下?lián)u床孵育2 h后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑于暗室下曝光顯影。將膠片整理去色并存檔，分析計(jì)算各組小鼠蛋白相對(duì)表達(dá)量。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取平均值。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)BDNF和NGF表達(dá)水平 取出預(yù)先凍存的大鼠腦組織約80 mg，溫室解凍組織后置于超聲研磨均勻。4℃、12000 r/min離心15 min，用TRlzol試劑盒提取總RNA并測(cè)定RNA濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按RT-PCR試劑盒操作說(shuō)明配制反應(yīng)體系。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：保持步驟96℃15 s，40個(gè)周期，95℃10 s和60℃30 s），以目的基因和內(nèi)參比值表示mRNA表達(dá)水平，采用2-△△CT法分析結(jié)果。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：BDNF（390bp）5'-CTTTCATGCAACTGAAGTATGAAA-3'，5'-CCGAC GTGGAGAGCTGAGCGTGTGT-3'。NGF（119bp）5'-CTCTGTCCCTGAAGCCCACTG-3'，5'-TGTTGCGG GTCTGCCCTGTC-3'。β-actin（76bp）5'-ACCCGCG AGTACAACCTTCTT-3'，5'-TATCGTCATCCATGGC GAACT-3'。

1.2.7 試劑盒檢測(cè)SOD、MDA和GSH含量 取4%多聚甲醛固定的大鼠腦組織，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定SOD、MDA和GSH-Px含量，4℃、3000 r/min離心15 min，取上清，在96孔板反應(yīng)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本100μl，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在空白對(duì)照孔中加入100μl稀釋液，然后在37℃孵育箱中孵育30 min，最后加入酶標(biāo)抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)，終止反應(yīng)后將96孔板放入酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)。空白孔調(diào)零，測(cè)定450 nm處各孔的OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 17.0和GraphPad prism 5.0軟件分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）。多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山茛菪堿對(duì)HIBD幼齡鼠腦指數(shù)和腦含水率的影響

與健康對(duì)照組比較，模型組幼齡鼠腦指數(shù)和腦含水率升高（P<0.05）。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠腦指數(shù)和腦含水率均無(wú)明顯差異（P＞0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪堿組腦指數(shù)和腦含水率降低（P<0.05），見(jiàn)圖1。說(shuō)明山茛菪堿能夠緩解HIBD幼齡鼠腦損傷。

圖1 腦指數(shù)（I）和腦含水率（II）檢測(cè)統(tǒng)計(jì)圖A：健康對(duì)照組B：模型組C：模型+2.5 mg/kg山茛菪堿組D：模型+5 mg/kg山茛菪堿組E：模型+10 mg/kg山茛菪堿組（圖2～5為相同分組）*P<0.05，與健康對(duì)照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.1 Statistical diagram of brain index(I)and brain water content(II)A:healthy control group;B:model group;C:model+2.5 mg/kg anisodamine group;D:model+5 mg/kg anisodamine group; E: model + 10 mg/kg anisodamine group；(Thesamegroup A,B,C,D asin Fig.2～Fig.5)*P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vs model group

2.2 山茛菪堿對(duì)HIBD幼齡鼠腦組織病理?yè)p傷的影響

HE染色觀察各組幼齡鼠腦組織病理?yè)p傷程度，健康對(duì)照組腦組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)病理改變。與健康對(duì)照組比較，模型組幼齡鼠腦組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)胞質(zhì)空泡化，胞核固縮破裂以及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠腦組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，5 mg/kg山茛菪堿組腦組織結(jié)構(gòu)明顯改善，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，10 mg/kg山茛菪堿組腦組織結(jié)構(gòu)趨于正常，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2。結(jié)果說(shuō)明，山茛菪堿能改善HIBD幼齡鼠腦組織病理?yè)p傷。

圖2 HE染色觀察各組幼齡鼠腦組織病理?yè)p傷程度Fig.2 HEstaining wasused to observethedegreeof pathological damageto thebrain tissueof young ratsin each group

2.3 山茛菪堿對(duì)HIBD幼齡鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)影響

TUNEL染色觀察各組幼齡鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況及定量分析，健康對(duì)照組海馬神經(jīng)元周圍組織中未見(jiàn)凋亡細(xì)胞。與健康對(duì)照組比較，模型組幼齡鼠腦海馬神經(jīng)元周圍組織中可見(jiàn)大量褐色或棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞，即細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠海馬神經(jīng)元周圍組織中仍可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞且細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異，5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪堿組海馬神經(jīng)元周圍組織中僅見(jiàn)極少細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞率顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖3。說(shuō)明山茛菪堿能緩解HIBD幼齡鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

圖3 TUNEL染色觀察各組幼齡鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡Ⅰ:TUNEL染色檢測(cè)各組幼齡鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況Ⅱ:半定量分析各組幼齡鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞凋亡率*P<0.05，與健康對(duì)照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.3 TUNEL staining was used to observe the neuronal apoptosis of young rats in each groupⅠ:TUNEL staining was used to detect the apoptosis of brain neurons of young rats in each group；Ⅱ:Semi-quantitative analysis of apoptosis rate of brain neuron cellsof young ratsin each group *P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vsmodel group

2.4山茛菪堿對(duì)HIBD幼齡鼠腦組織中凋亡蛋白表達(dá)水平的影響

與健康對(duì)照組比較，模型組幼齡鼠腦組織中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P<0.05）。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠腦組織中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠腦組織中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05），見(jiàn)圖4。說(shuō)明山茛菪堿能緩解HIBD幼齡鼠腦組織細(xì)胞凋亡。

圖4 Western blot檢測(cè)各組幼齡鼠腦組織中凋亡蛋白表達(dá)水平Ⅰ:Western blot檢測(cè)各組幼齡鼠腦組織中Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平 Ⅱ:半定量分析各組幼齡鼠腦組織中Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)水平*P＜0.05，與健康對(duì)照組比較，#P＜0.05，與模型組比較Fig.4 Western blot was used to detect the expression level of apoptotic protein in the brain tissue of young ratsin each groupⅠ:Western blot was used to detect the protein expression levelsof Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 in the brain tissuesof young ratsin each group；Ⅱ:Semi-quantitativeanalysisof theprotein expression levelsof Bax,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 in thebrain tissues of young ratsin each group

2.5 山茛菪堿對(duì)HIBD幼齡鼠神經(jīng)功能的影響

與健康對(duì)照組比較，模型組幼齡鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著增高[11]，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（nerve growth factor，NGF）蛋白及mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05）。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分、BDNF和NGF均無(wú)明顯差異（P>0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪堿組神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著降低，BDNF和NGF表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05），見(jiàn)圖5。結(jié)果說(shuō)明，山茛菪堿能夠緩解HIBD幼齡鼠神經(jīng)功能損傷。

圖5 各組幼齡鼠神經(jīng)功能檢測(cè)I：神經(jīng)功能損傷評(píng)分II：BDNF和NGFmRNA表達(dá)水平III、IV：BDNF和NGF蛋白表達(dá)水平*P<0.05，與健康對(duì)照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.5 Thenerve function of young ratswastested in each group I:Nerve function damage score;II:BDNF and NGF mRNA expression level;III、IV:BDNF and NGF protein expression level *P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vs model group

2.6 山茛菪堿對(duì)HIBD幼齡鼠氧化應(yīng)激水平的影響

與健康對(duì)照組比較，模型組幼齡鼠腦組織中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量顯著升高，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GSH-Px）含量降低，P<0.05。與模型組比較，2.5 mg/kg山茛菪堿組幼齡鼠腦組織中MDA、SOD和GSH-Px含量均無(wú)明顯差異（P>0.05），5 mg/kg和10 mg/kg山茛菪堿組腦組織中MDA含量降低，SOD和GSH-Px含量增高（P<0.05），見(jiàn)表1。說(shuō)明山茛菪堿能夠減輕HIBD幼齡鼠腦組織中氧化應(yīng)激水平。

表1 各組幼齡鼠腦組織中MDA、SOD和GSH-Px含量（±s，n=10）Tab.1 Contents of MDA,SOD and GSH-Px in brain tissue of young rats in each group(Mean±SD,n=10)

表1 各組幼齡鼠腦組織中MDA、SOD和GSH-Px含量（±s，n=10）Tab.1 Contents of MDA,SOD and GSH-Px in brain tissue of young rats in each group(Mean±SD,n=10)

*P<0.05，與健康對(duì)照組比較#P<0.05，與模型組比較*P<0.05 vs healthy control group;#P<0.05 vs model group

GSH-px（U/ml）97.18±9.75 40.21±5.43*50.32±6.57 69.06±8.19#96.84±10.26#組別Group Control HIBD HIBD+Anis藥物劑量（mg/kg）Dose(mg/kg)2.5 5.0 10.0 MDA（mmol/ml）2.21±0.34 5.37±0.46*5.33±0.51 3.59±0.38#2.66±0.34#SOD（U/ml）4.43±0.47 2.08±0.38*2.14±0.21 3.16±0.35#4.29±0.47#

3 討論

缺氧缺血性腦損傷發(fā)生時(shí)，會(huì)出現(xiàn)腦組織水腫、選擇性神經(jīng)元壞死、基底神經(jīng)節(jié)大理石樣變性、大腦矢狀旁區(qū)神經(jīng)元損傷和腦室周圍白質(zhì)轉(zhuǎn)化等[13～15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立缺氧缺血性腦損傷幼鼠模型，觀察各組幼鼠腦指數(shù)和腦含水率及病理?yè)p傷程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)山茛菪堿藥物治療后，幼鼠缺氧缺血性腦損傷程度明顯得到改善，腦指數(shù)和腦含水率顯著降低。結(jié)果提示，山茛菪堿在缺氧缺血性腦損傷幼鼠中具有調(diào)節(jié)作用。為明確山茛菪堿改善幼鼠缺氧缺血性腦損傷的作用機(jī)制，還檢測(cè)了各組幼鼠腦海馬神經(jīng)元周圍組織細(xì)胞凋亡水平、腦組織凋亡蛋白和氧化應(yīng)激水平及神經(jīng)功能。

海馬神經(jīng)元周圍組織細(xì)胞凋亡和腦組織細(xì)胞凋亡是缺氧缺血性腦損傷的主要病因。Bax、Bcl-2、caspase-9和caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)蛋白，凋亡發(fā)生時(shí)，凋亡起始蛋白caspase-9誘導(dǎo)并激活下游的凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，活化的caspase-9和caspase-3進(jìn)一步啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞發(fā)生DNA裂解及凋亡過(guò)程。而Bax和Bcl-2分別為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白并在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用，Bax/Bcl-2比值通常決定著細(xì)胞凋亡水平[16～18]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)山茛菪堿藥物治療后，缺氧缺血性腦損傷幼鼠海馬神經(jīng)元周圍組織和腦組織中凋亡細(xì)胞顯著減少，Bax/Bcl-2、caspase-9和caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明，山茛菪堿通過(guò)抑制腦海馬神經(jīng)元周圍組織細(xì)胞和腦組織細(xì)胞凋亡緩解幼鼠缺血缺血性腦損傷。

神經(jīng)元細(xì)胞由細(xì)胞體和細(xì)胞突起構(gòu)成，主要功能是通過(guò)接受、整合、傳導(dǎo)和輸出信息實(shí)現(xiàn)信息交換。腦缺氧缺血時(shí)，腦神經(jīng)元受損，機(jī)體無(wú)法完成正常的信息交換導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷。神經(jīng)功能受損進(jìn)一步導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)不能對(duì)生理功能活動(dòng)進(jìn)行正常調(diào)節(jié)，促使繼發(fā)性腦損傷。腦前額葉腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）是一種具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，通過(guò)與酪氨酸激酶B結(jié)合而發(fā)揮作用，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生存和神經(jīng)發(fā)生。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，廣泛存在于各組織器官中，能促進(jìn)中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、成熟，能夠維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，加快神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)等[19]。研究表明，腦內(nèi)移植BDNF和NGF有利于改善缺氧缺血性腦損傷新生大鼠運(yùn)動(dòng)和行為記憶能力[20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)山茛菪堿治療后，缺氧缺血性腦損傷幼鼠神經(jīng)功能顯著好轉(zhuǎn)，BDNF和NGF表達(dá)水平顯著增高，提示山茛菪堿對(duì)缺氧缺血性腦損傷幼鼠腦神經(jīng)功能具有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激與多種生理病理過(guò)程密切聯(lián)系，正常情況下，機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化處于動(dòng)態(tài)平衡，缺氧缺血性腦損傷發(fā)生時(shí)，缺氧導(dǎo)致腦組織中產(chǎn)生的大量氧自由基不能被清除，氧化與抗氧化動(dòng)態(tài)平衡被打破，從而損壞腦組織正常功能，加重腦組織損傷。丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，過(guò)量的MDA能夠促進(jìn)膜損傷和氧化過(guò)程，通常MDA含量反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度及細(xì)胞損傷程度。超氧化物歧化酶（SOD）則與之相反，SOD是一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過(guò)氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）是一種重要的過(guò)氧化物分解酶，能夠保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受過(guò)氧化物的損害[21～23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)山茛菪堿治療后，缺氧缺血性腦損傷幼鼠腦組織中MDA含量顯著降低，SOD和GSH-Px含量顯著升高。結(jié)合前期結(jié)果可知，山茛菪堿通過(guò)調(diào)節(jié)缺氧缺血性腦損傷幼鼠腦組織氧化應(yīng)激緩解幼鼠腦損傷。

綜上所述，山茛菪堿能夠緩解缺氧缺血性腦損傷幼齡鼠腦組織形態(tài)和神經(jīng)功能損傷，其作用機(jī)制與抑制腦細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能因子表達(dá)，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平有關(guān)。