云南喙尾琵琶甲幼蟲提取物抗氧化活性的初步研究

楊建云，倪 俊，高玉婷，楊 旭2，，佘 容2，*，肖 文2，，4，5

(1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671003；2.大理大學(xué) 天然抗氧化劑與抗氧化炎癥研究院，云南 大理 671003；3.大理大學(xué) 東喜瑪拉雅研究院，云南 大理 671003；4.中國(guó)三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671003；5.大理大學(xué) 三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，云南 大理 671003)

昆蟲種類繁多，數(shù)量龐大，昆蟲資源是目前地球上最大的尚未被充分利用的自然資源[1-2]。喙尾琵琶甲(BlapsrynchopeteraFairmaire)屬于鞘翅目(Coleoptera)、擬步甲科(Tenebrionidae)、琵琶甲屬(Blapsfabiricus)，在我國(guó)西南地區(qū)云南、四川、貴州和廣西等省均有分布，其中以云南省分布較為集中，又稱為“云南琵琶甲”，是云南彝族和白族民間廣泛使用的一種藥用昆蟲[3]。喙尾琵琶甲成蟲繁殖能力強(qiáng)，日均產(chǎn)卵量為5.3粒，壽命超過18個(gè)月，終生產(chǎn)卵量在600粒以上[3]。喙尾琵琶甲是一種重要的可再生資源，其藥用價(jià)值及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都較高，含有16種游離氨基酸和16種蛋白氨基酸，其中8種是人體必需氨基酸[4-5]。喙尾琵琶甲成蟲提取物具有抑菌、抗腫瘤活性，喙尾琵琶甲幼蟲乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌具有抑菌活性[6-9]。

生物機(jī)體在有氧代謝過程中，活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。若打破抗氧化防御機(jī)制間的平衡，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激；過度的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引起機(jī)體應(yīng)激損傷，導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生[10-11]。昆蟲的生理結(jié)構(gòu)特殊，氣管系統(tǒng)所輸送的氧經(jīng)擴(kuò)散作用直抵組織，從而增加正常情況下機(jī)體的氧化脅迫，昆蟲也由此發(fā)展了一套高效的抗氧化系統(tǒng)[12-13]。崔文博等[14]研究發(fā)現(xiàn)，喙尾琵琶甲成蟲的氯仿和乙酸乙酯提取物具有較高的抗氧化活性；何釗等[15]研究了5種昆蟲多糖的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)喙尾琵琶甲多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果較明顯；馬嬌等[16]研究發(fā)現(xiàn)，7種云南可食用昆蟲的醇提物均對(duì)ABTS自由基具有不同程度的清除作用；另外，黃粉蟲黃酮提取物[17]、白蠟蟲多糖提取物[18]、黑水虻幼蟲蛋白質(zhì)[19]、碧偉蜓稚蟲的胃蛋白酶解液[20]以及金銀花尺蠖蛹粗多糖[21]等都具有體外抗氧化活性。

喙尾琵琶甲的幼蟲和蛹可以增加喙尾琵琶甲的食用性。但由于喙尾琵琶甲幼蟲飼養(yǎng)難度大、發(fā)育歷期長(zhǎng)，目前關(guān)于喙尾琵琶甲幼蟲及蛹的應(yīng)用價(jià)值的研究報(bào)道較少，涉及抗氧化活性的報(bào)道更少。為此，作者以喙尾琵琶甲幼蟲為研究對(duì)象，通過DPPH法、ABTS法、FRAP法評(píng)價(jià)喙尾琵琶甲幼蟲提取物的體外抗氧化活性，為云南藥食兩用昆蟲資源的合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

于大理大學(xué)內(nèi)野外環(huán)境中采集喙尾琵琶甲成蟲，室內(nèi)交配產(chǎn)卵后，收集卵，孵化，在人工飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)至高齡幼蟲，收集體長(zhǎng)29.25～30.85 mm、頭寬2.81～3.08 mm的鮮活蟲體(圖1)，冷凍干燥，備用。

圖1 喙尾琵琶甲幼蟲

1.2 試劑與儀器

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ABTS[2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽]、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸(VC)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己烷、乙酸乙酯，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；甲醇，太倉(cāng)滬試試劑有限公司；氯仿，利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司。

SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；LG10-2.4A型高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；722N型可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；PX224ZH型電子天平，奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗氧化活性成分的提取

稱取鮮活喙尾琵琶甲幼蟲200 g，冷凍干燥得到干蟲體83 g，用研缽將蟲體研碎，放入250 mL錐形瓶中。首先用250 mL正己烷浸提2次，每次超聲5 min；再用250 mL乙酸乙酯浸提2次，將提取后蟲體殘?jiān)械娜軇]發(fā)，干燥；最后用600 mL甲醇浸提3次，每次超聲10 min，浸泡30 min，合并甲醇提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到甲醇膏狀粗提物4.2 g。

1.3.2 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.2.1 DPPH法

DPPH法是體外評(píng)價(jià)抗氧化劑抗氧化活性的一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏可行的方法。其原理為：DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈深紫色，能夠接受一個(gè)電子或是氧離子，在517 nm 處有吸收峰；而具有自由基清除能力的抗氧化劑可以和DPPH自由基的單電子配對(duì)，使得517 nm處的吸收峰強(qiáng)度減弱，據(jù)此可通過吸光度的變化來(lái)檢測(cè)DPPH自由基的清除情況。

DPPH自由基溶液的配制：稱取DPPH自由基粉末1 g，用無(wú)水乙醇溶解，轉(zhuǎn)入1 L棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，搖勻，得1 000 mg·L-1的DPPH自由基儲(chǔ)備液，置于冰箱中冷藏，備用。

DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取DPPH自由基儲(chǔ)備液1 mL，加入無(wú)水乙醇19 mL，配制50 mg·L-1的DPPH自由基工作液；用無(wú)水乙醇將工作液稀釋成梯度濃度40 mg·L-1、25 mg·L-1、12.5 mg·L-1、6.25 mg·L-1，測(cè)定各濃度溶液在517 nm處吸光度；以DPPH自由基濃度為橫坐標(biāo)、517 nm處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

DPPH自由基清除率的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物0.12 g，用15 mL甲醇溶解，4 000 r·min-1離心5 min，得到8 mg·mL-1粗提物母液；將粗提物母液稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為6、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125的待測(cè)溶液；吸取2 mL待測(cè)溶液，加入2 mL DPPH自由基工作液，混勻，30 ℃暗室放置30 min，測(cè)定517 nm處吸光度，按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。以等濃度VC為對(duì)照，同時(shí)設(shè)置試劑空白和樣品空白[22-23]。

(1)

式中：Ai為待測(cè)溶液+DPPH自由基溶液的吸光度；Aj為待測(cè)溶液+甲醇的吸光度；A0為甲醇+DPPH自由基溶液的吸光度。

清除DPPH自由基能力IC50值的測(cè)定：根據(jù)DPPH自由基清除率，通過SPSS軟件計(jì)算喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50值。

1.3.2.2 ABTS法

ABTS法[24]測(cè)定抗氧化活性原理：ABTS與K2S2O8反應(yīng)可以生成綠色的ABTS自由基，該自由基在734 nm處有最大吸收峰；當(dāng)具有自由基清除能力的抗氧化劑加入到ABTS自由基溶液后，會(huì)使734 nm處的吸收峰強(qiáng)度減弱，據(jù)此可通過吸光度的變化來(lái)檢測(cè)ABTS自由基的清除情況。

ABTS自由基工作液的配制：用蒸餾水分別配制7 mmol·L-1ABTS自由基溶液、2.45 mmol·L-1K2S2O8溶液；將兩種溶液按體積比1∶1混合，4 ℃避光靜置15 h，得到ABTS自由基母液；將ABTS自由基母液用無(wú)水乙醇稀釋成734 nm處吸光度為0.70±0.02的工作液。

ABTS自由基清除率的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物0.12 g，用15 mL甲醇溶解，4 000 r·min-1離心5 min，得到8 mg·mL-1粗提物母液；將粗提物母液稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為6、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25的待測(cè)溶液；吸取1 mL待測(cè)溶液，加入3 mL ABTS自由基工作液，混勻，25 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)定734 nm處吸光度[25]，按式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：Ai為待測(cè)溶液+ABTS自由基溶液的吸光度；Aj為待測(cè)溶液+甲醇的吸光度；A0為甲醇+ABTS自由基溶液的吸光度。

清除ABTS自由基能力IC50值的測(cè)定：根據(jù)ABTS自由基清除率，通過SPSS軟件計(jì)算喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對(duì)ABTS自由基清除能力的IC50值。

1.3.2.3 FRAP法

FRAP法測(cè)定抗氧化活性原理：在酸性條件下，F(xiàn)e3+-TPTZ可被抗氧化劑還原成Fe2+-TPTZ藍(lán)色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在593 nm處有最大吸收峰，可用來(lái)反映抗氧化劑的總抗氧化活性。

FRAP工作液的配制：將pH值為3.6的醋酸鹽緩沖液、10 mmol·L-1TPTZ溶液、20 mmol·L-1FeCl3溶液按體積比10∶1∶1混合，即得。

FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取2 mmol·L-1、1 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.25 mmol·L-1、0.125 mmol·L-1、0.062 5 mmol·L-1的FeSO4·7H2O溶液各0.15 mL，加入3.6 mL FRAP工作液，混勻，于37 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)定各濃度溶液在593 nm處吸光度；以FeSO4·7H2O溶液濃度為橫坐標(biāo)、593 nm處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

FRAP值的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物0.12 g，用15 mL甲醇溶解，4 000 r·min-1離心5 min，得到8 mg·mL-1粗提物母液；將粗提物母液稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為6、4、2、1、0.5的待測(cè)溶液；吸取0.15 mL待測(cè)溶液，加入3.6 mL FRAP工作液，混勻，37 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)定593 nm處吸光度。以FRAP值表征總抗氧化活性，以1 mmol·L-1FeSO4·7H2O為標(biāo)準(zhǔn)，總抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度時(shí)為一個(gè)FRAP值[24-25]。

2 結(jié)果與討論

2.1 DPPH法測(cè)定喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物抗氧化活性結(jié)果

從DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)可以看出：DPPH自由基溶液濃度在6.25～50 mg·mL-1范圍內(nèi)，與517 nm處吸光度線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.0226x+0.0162，R2=0.9994。

圖2 DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線

喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對(duì)DPPH自由基的清除率如圖3所示。

圖3 喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對(duì)DPPH自由基的清除率

從圖3可以看出，喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物具有清除DPPH自由基的能力。粗提物對(duì)DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加逐漸升高，當(dāng)粗提物濃度增至3 mg·mL-1時(shí)，DPPH自由基清除率升至(92.53±2.26)%；之后，繼續(xù)增加粗提物濃度，清除率基本無(wú)變化；粗提物對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50值為1.086 mg·mL-1(VC的IC50值為1.470 mg·L-1)。

2.2 ABTS法測(cè)定喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物抗氧化活性結(jié)果

喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對(duì)ABTS自由基的清除率如圖4所示。

圖4 喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對(duì)ABTS自由基的清除率

從圖4可以看出，喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物具有清除ABTS自由基的能力。在0.031 25～1 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，粗提物對(duì)ABTS自由基的清除率隨著濃度的增加迅速升高，在粗提物濃度為1 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到(99.60±0.49)%；之后，繼續(xù)增加粗提物濃度，清除率基本無(wú)變化；粗提物對(duì)ABTS自由基清除能力的IC50值為0.177 mg·mL-1(VC的IC50值為7.822 mg·L-1)。

與DPPH自由基清除率相比，喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對(duì)ABTS自由基的清除率更高。與文獻(xiàn)[14,16]報(bào)道結(jié)果比較，喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物對(duì)ABTS自由基的清除作用低于7種云南可食用昆蟲生樣和熟樣醇提液對(duì)ABTS自由基的清除作用，但是高于喙尾琵琶甲成蟲醇提物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取的提取物。

2.3 FRAP法測(cè)定喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物抗氧化活性結(jié)果

從FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)可以看出：FeSO4·7H2O溶液濃度在0.062 5～2 mmol·L-1范圍內(nèi)，與593 nm處吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.9057x+0.0638，R2=0.9972。

圖5 FeSO4·7H2O的標(biāo)準(zhǔn)曲線

喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物的總抗氧化活性隨著濃度的增加而升高，在0.5～8 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)RAP值從0.12增至0.70(圖6)。

圖6 喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物的總抗氧化活性

3 結(jié)論

DPPH法、ABTS法、FRAP法等3種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法都表明喙尾琵琶甲幼蟲提取物具有體外抗氧化活性。在喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物濃度為3 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率為(92.53±2.26)%；在喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物濃度為1 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)ABTS自由基的清除率為(99.60±0.49)%；在喙尾琵琶甲幼蟲甲醇粗提物濃度為8 mg·mL-1時(shí)，其總抗氧化活性的FRAP值為0.70。在低濃度下，粗提物的抗氧化活性雖然低于VC，但隨著濃度的增加，其抗氧化活性逐漸升高，甚至可以達(dá)到VC的抗氧化效果。本研究?jī)H對(duì)喙尾琵琶甲幼蟲粗提物進(jìn)行了抗氧化活性分析，其幼蟲蟲態(tài)是否具有成蟲一樣的藥用功效還有待進(jìn)一步研究。未來(lái)將進(jìn)一步對(duì)喙尾琵琶甲幼蟲粗提物進(jìn)行分離純化，提高其抗氧化活性，并對(duì)有效成分進(jìn)行鑒定以促進(jìn)其開發(fā)利用。