癲癇與焦亡的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制研究現(xiàn)狀*

楊 虹，何 莉，席萌丹，賀細(xì)菊，史丹丹，馮 娜，盧 敏△

湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1組織胚胎學(xué)教研室 2人體解剖學(xué)教研室，十堰 442000

癲癇(epilepsy)是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其病因復(fù)雜，表現(xiàn)形式多樣，給家庭和社會(huì)帶來(lái)極大負(fù)擔(dān)。目前尚有較大比例的患者不能通過(guò)抗癲癇藥物治療得到有效緩解。癲癇發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制的研究將有助于人類(lèi)最終攻克這種疾病。已有研究表明：癲癇與焦亡(pyroptosis)關(guān)系密切，但其中機(jī)制不明。另外，在癲癇病灶中，炎性細(xì)胞因子增多、神經(jīng)元大量丟失、鈣離子通道異常同時(shí)存在。這三者共存是否提示癲癇與焦亡的某些內(nèi)在聯(lián)系，值得深入探討。本文將基于癲癇的典型病理變化，結(jié)合焦亡的激活途徑，梳理焦亡參與癲癇的過(guò)程及機(jī)制研究現(xiàn)狀，以期為進(jìn)一步研究癲癇的發(fā)病機(jī)制提供新的視角。

1 癲癇概述

癲癇是臨床上最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。全球約有7000萬(wàn)癲癇患者，其中90%以上在中、低收入國(guó)家[1]。通過(guò)合理的抗癲癇藥物(antiepileptic drugs，AEDs)治療，部分患者病情能夠得到較好的控制，但仍有30%的患者治療效果欠佳，對(duì)AEDs耐受或者反復(fù)發(fā)作，稱(chēng)為難治性癲癇(refractory epilepsy，RE)。癲癇不僅導(dǎo)致患者智能及身體機(jī)能受損，發(fā)生意外及受傷的風(fēng)險(xiǎn)增高，也是一種潛在的致死性疾病，給家庭和社會(huì)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)引發(fā)一系列的社會(huì)心理問(wèn)題。我國(guó)有近千萬(wàn)癲癇患者，每年新發(fā)病例40萬(wàn)～60萬(wàn)。雖然抗癲癇藥物在不斷地更新?lián)Q代，但目前癲癇的全球形勢(shì)不容樂(lè)觀[2-3]。

癲癇表現(xiàn)形式多樣，是一種以反復(fù)性、發(fā)作性、短暫性，通常也是刻板性的腦功能失調(diào)為特征的慢性腦部疾病[4]。癲癇的病因復(fù)雜，盡管有許多危險(xiǎn)因素可導(dǎo)致癲癇，如中風(fēng)、神經(jīng)退行性疾病、感染、腦部腫瘤、腦外傷、先天畸形等，但全球約50%癲癇病例尚未發(fā)現(xiàn)明確病因。癲癇發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，有學(xué)者認(rèn)為，癲癇的發(fā)病與神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失衡密切相關(guān)，以神經(jīng)機(jī)制為主，免疫和內(nèi)分泌分別在受體、信使和基因水平對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]。目前較一致的觀點(diǎn)是，癲癇發(fā)病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性系統(tǒng)與抑制性系統(tǒng)失衡所致。而這種不平衡主要與離子通道的異常改變有關(guān)。離子通道是體內(nèi)可興奮性組織興奮性調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)，其編碼基因突變可影響離子通道功能，從而導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。在癲癇病灶中，炎性細(xì)胞因子增多、鈣離子通道異常和神經(jīng)元大量丟失同時(shí)存在[6]。

2 癲癇與焦亡

2.1 癲癇與細(xì)胞死亡

細(xì)胞死亡對(duì)于胚胎發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)是重要的生物學(xué)過(guò)程。在神經(jīng)元中，細(xì)胞死亡的精細(xì)調(diào)節(jié)對(duì)神經(jīng)元正常的自我更新活動(dòng)至關(guān)重要。癲癇過(guò)程常伴隨神經(jīng)元的死亡。國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟認(rèn)為，癲癇最突出的病理生理特征是患者腦部存在著能導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作的易感性，而這種易感性存在的基礎(chǔ)是神經(jīng)元死亡，病灶內(nèi)殘存的神經(jīng)元、新生神經(jīng)元及增生的膠質(zhì)細(xì)胞形成異常網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致癲癇發(fā)生，繼而引起新的神經(jīng)元死亡，出現(xiàn)新的異常網(wǎng)絡(luò)，成為新癲癇發(fā)作的病因，形成惡性循環(huán)[7]。在癲癇過(guò)程中，神經(jīng)元的死亡方式有多種，包括凋亡、壞死性凋亡、自噬、鐵死亡、焦亡等。

凋亡(apoptosis)早在1972年被發(fā)現(xiàn)，以細(xì)胞皺縮、DNA斷裂和染色質(zhì)凝結(jié)為特征。在體情況下，死亡信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞色素C(cytochrome C，cyt-C)的釋放，進(jìn)而產(chǎn)生凋亡復(fù)合體。凋亡與癲癇二者間的密切相關(guān)性是被普遍認(rèn)可的。凋亡信號(hào)的激活可加重癲癇腦損傷并導(dǎo)致持續(xù)的癲癇發(fā)作[8]，胞內(nèi)鈣聚集通過(guò)激活凋亡通路而介導(dǎo)神經(jīng)元的死亡[9]。

壞死性凋亡(necroptosis)是細(xì)胞中最具特征性的調(diào)節(jié)性壞死，由受體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3，RIP3)及其底物混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)介導(dǎo)，與癲癇關(guān)系密切。在癲癇中觀察到壞死性凋亡的現(xiàn)象，如RIP1，RIP3和MLKL的升高以及細(xì)胞膜破裂[10]。而通過(guò)化學(xué)物質(zhì)抑制壞死性凋亡則可保護(hù)神經(jīng)元，對(duì)抗癲癇所致海馬損傷[11]。

自噬(autophagy)是對(duì)過(guò)量或有缺陷的大分子和細(xì)胞器的溶酶體降解過(guò)程，發(fā)生在營(yíng)養(yǎng)刺激后，通過(guò)對(duì)大分子的再利用，對(duì)能量供應(yīng)和分子構(gòu)建模塊發(fā)揮重要作用。自噬對(duì)癲癇的作用尚不明確，但在戊四氮(pentetrazole，PTZ)、海人酸(kainic acid，KA)或匹羅卡品(pilocarpine)誘導(dǎo)的不同癲癇模型中均觀察到自噬的典型表現(xiàn)，如自噬相關(guān)蛋白膜型與胞質(zhì)型比值LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和自噬效應(yīng)蛋白Beclin-1升高[12-13]。

鐵死亡(ferroptosis)是鐵離子依賴的程序性細(xì)胞死亡方式，以致命的脂質(zhì)活性氧的積累為特征[14]。直接和間接的證據(jù)表明，在癲癇過(guò)程中有神經(jīng)元鐵死亡現(xiàn)象的出現(xiàn)[15]。而通過(guò)鐵離子螯合劑減少其濃度則可抑制癲癇發(fā)作[16]。

焦亡(pyroptosis)是近年發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種新型程序性細(xì)胞死亡方式，依賴天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteine aspartate-specific protease，Caspase-1)，以炎性體(inflammasomes)的激活為特征[17]。研究表明，細(xì)胞焦亡參與多種疾病過(guò)程，在癲癇中也有發(fā)生[18]，在難治性癲癇患者腦內(nèi)有炎性體的激活，而在杏仁核點(diǎn)燃動(dòng)物模型中，抑制NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein，NLRP3)型炎性體則可減輕癲癇發(fā)作所致的神經(jīng)元損傷[19]。新近研究發(fā)現(xiàn)，阿曼托黃素可通過(guò)抑制NLRP3炎性體影響癲癇發(fā)生,同時(shí)對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用[20]。

2.2 癲癇與焦亡

焦亡是一種炎癥性的程序性細(xì)胞死亡，是機(jī)體對(duì)多種因素刺激產(chǎn)生的固有免疫反應(yīng)。有害刺激因素通過(guò)依賴Caspase-1的方式誘導(dǎo)胞質(zhì)內(nèi)炎性體的形成，激活Caspase-1，進(jìn)一步促進(jìn)白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素-18(interleukin 18，IL-18)等細(xì)胞因子的成熟分泌，同時(shí)剪切促焦亡因子Gasdermin D(GSDMD)，使其N(xiāo)端解離并向細(xì)胞膜聚合形成功能性的孔道，胞膜完整性被破壞，細(xì)胞內(nèi)容物包括IL-1β和IL-18等經(jīng)由孔道流出，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[17]。細(xì)胞焦亡的典型特征是：細(xì)胞膜形成質(zhì)膜孔，細(xì)胞逐漸膨脹至質(zhì)膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，伴大量促炎癥因子(包括IL-1β、IL-18等)釋放。一般情況下，釋放的炎性因子可以清除病毒、細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞是一種保護(hù)機(jī)制。但焦亡的過(guò)度激活，也可對(duì)機(jī)體造成傷害[21]。

炎性體的激活是細(xì)胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵因素。經(jīng)典炎性體(canonical inflammasome)經(jīng)由Caspase-1途徑激活[22]，是胞質(zhì)內(nèi)一類(lèi)大分子蛋白復(fù)合物，主要由3部分構(gòu)成，即胞內(nèi)模式識(shí)別受體PRRs(patern-recognize-receptors)、促炎性半胱天冬氨酸酶Caspase(主要是Caspase-1)及凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein CARD domain，ASC)。三部分結(jié)構(gòu)在炎性體激活之前分散存在于胞質(zhì)中。PRRs包含多種類(lèi)型，NLRP3是目前研究最多的一種，當(dāng)NLRP3被活化，三部分結(jié)構(gòu)相互結(jié)合，裝配形成NLRP3-SAC-caspase-1復(fù)合體，在胞質(zhì)內(nèi)形成直徑約0.8～1 μm的炎性小斑(inflammasome speck)[23]。炎性小斑的出現(xiàn)是炎性體形成的重要特征。接著Caspase-1前體活化、水解、聚合成為具有活性的Caspase-1[24]，活化的Caspase-1進(jìn)一步剪切炎性因子IL-1β和IL-18的前體為其成熟體并釋放。同時(shí)，活化的Caspase-1也剪切GSDMD，其N(xiāo)末端游離下來(lái)并聚集于細(xì)胞膜形成質(zhì)膜孔，致使細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起細(xì)胞焦亡。從細(xì)胞中釋出的炎性小斑又可作為一種傷害性刺激擴(kuò)大炎性反應(yīng)[25-26]。多種致炎刺激可以激活NLRP3炎癥小體，如感染性刺激包括細(xì)菌、病毒、細(xì)菌毒素等，非感染性因素包括離子胞內(nèi)外流動(dòng)(如K+出胞)、核內(nèi)體破裂、活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生、線粒體損傷等。

NLRP3炎性體激活在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中被廣泛研究。在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)NLRP3炎性體激活和后續(xù)一系列反應(yīng)如Caspase-1激活、IL-1β活化等現(xiàn)象[27]。研究發(fā)現(xiàn)，在癲癇患者和KA致癇大鼠海馬組織中NLRP3水平升高，抑制NLRP3炎性體對(duì)大鼠杏仁核點(diǎn)燃所致癲癇持續(xù)狀態(tài)的神經(jīng)元是一種保護(hù)作用[28]。姜黃素抑制癲癇模型鼠NLRP3炎性體激活的同時(shí)減少神經(jīng)元的損失[29]。NLRP3炎癥體在顳葉內(nèi)側(cè)癲癇患者中表達(dá)上調(diào)[30]。

3 焦亡參與癲癇的機(jī)制

3.1 癲癇與炎癥

越來(lái)越多的研究表明，炎癥在癲癇發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色[31-34]。炎癥細(xì)胞因子在腦內(nèi)發(fā)揮多重作用，包括神經(jīng)遞質(zhì)代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌功能、突觸可塑性、多巴胺能的傳遞、神經(jīng)發(fā)生以及情緒的神經(jīng)回路等[35]。過(guò)去幾十年積累的臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，腦內(nèi)的炎性病變?cè)诎d癇病理過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，炎癥和癲癇之間存在著互為因果的關(guān)系，形成惡性循環(huán)。約30%癲癇患者耐藥，其病理機(jī)制之一就是神經(jīng)炎癥(neuroinflammation)，神經(jīng)炎癥擴(kuò)大神經(jīng)病變，過(guò)度的神經(jīng)免疫反應(yīng)最終使病情不斷惡化[36-37]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，炎性介質(zhì)如環(huán)氧酶2(cyclooxygenase2，COX-2)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等的激活，以及下游炎性因子如白介素IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α、前列腺素PGE2等的過(guò)度釋放參與了癲癇發(fā)作的持續(xù)進(jìn)展[38]。促炎介質(zhì)如COX-2/PGE2、IL-1β、TGF-β、Toll樣受體TLR4，以及TNF-α在癲癇灶內(nèi)表達(dá)升高[39]。IL-1β在正常大鼠海馬幾乎檢測(cè)不到，但在電刺激癲癇大鼠海馬內(nèi)表達(dá)顯著增高，而阻斷IL-1β通路則顯著降低動(dòng)物癲癇發(fā)作頻率，采用IL-1β抑制劑治療難治性癲癇患者能有效改善患者臨床發(fā)作的情況，提高患者生活質(zhì)量和社會(huì)功能[40]。

3.2 癲癇與鈣離子通道及鈣動(dòng)員

作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，鈣離子(calcium ion，Ca2+)在細(xì)胞生理、病理過(guò)程中發(fā)揮廣泛的作用，在癲癇發(fā)病過(guò)程中也扮演重要角色。早在2001年，Badea等[41]用Ca2+成像的方法觀察了神經(jīng)元參與癲癇發(fā)作的情況，證實(shí)Ca2+快速內(nèi)流和細(xì)胞去極化有關(guān)。當(dāng)這種去極化達(dá)到一定程度時(shí)就觸發(fā)Na+內(nèi)流，從而引發(fā)一系列迅速的去極化過(guò)程，導(dǎo)致神經(jīng)元過(guò)度激活。Ca2+/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)可改變谷氨酸(glutamic acid，Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和膽堿能受體等的基因轉(zhuǎn)錄水平，而這些蛋白都是調(diào)控神經(jīng)元興奮性的重要分子[42]。

分布于細(xì)胞膜或胞內(nèi)鈣庫(kù)(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng))膜上的Ca2+通道是調(diào)控胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Ca2+通道種類(lèi)繁多，傳統(tǒng)的通道包括受體依賴性Ca2+通道、第二信使激活的Ca2+通道、機(jī)械激活的Ca2+通道、漏電流Ca2+通道等。其中電壓門(mén)控Ca2+通道與癲癇的關(guān)系研究較多[43-44]。近年來(lái)，一種新型的Ca2+通道——瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)通道被發(fā)現(xiàn)，其中經(jīng)典型TRP(canonical or classical TRP，TRPC)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用被廣泛研究。在哺乳動(dòng)物中，TRPC包括7個(gè)亞型(TRPC1～7)，其中TRPC2在人細(xì)胞中不表達(dá)，其它類(lèi)型在各組織中廣泛表達(dá)。TRPC在癲癇中的作用備受關(guān)注。已有文獻(xiàn)報(bào)道，TRPC1在局部皮質(zhì)發(fā)育不良所致癲癇患者腦組織中過(guò)度表達(dá)[45]。TRPC3在顳葉癲癇患者腦內(nèi)表達(dá)上調(diào)[46]，在KA致癇大鼠腦組織中TRPC3在mRNA及蛋白水平均較對(duì)照組明顯升高[47]。在匹魯卡品誘發(fā)的癲癇持續(xù)狀態(tài)中，TRPC3對(duì)θ波的形成至關(guān)重要[48]。TRPC3介導(dǎo)了未成熟皮質(zhì)和實(shí)驗(yàn)性皮質(zhì)發(fā)育不良情況下神經(jīng)元的過(guò)度興奮和癲癇樣活動(dòng)[49]，還參與了癲癇持續(xù)狀態(tài)下血管性水腫形成[50]，以及熱性驚厥時(shí)神經(jīng)元的死亡和神經(jīng)炎癥[51]。在特異性抑制TRPC3通道后，海人酸所致大鼠癲癇發(fā)作程度減輕[52]。TRPC4基因與癲癇大發(fā)作有明顯相關(guān)性，在皮質(zhì)功能失調(diào)合并結(jié)節(jié)硬化的病人皮質(zhì)中表達(dá)升高[53]。TRPC5在局部皮質(zhì)功能失調(diào)的皮質(zhì)損傷中表達(dá)升高[54]。TRPC6在顳葉癲癇病人腦內(nèi)表達(dá)上調(diào)但其作用與TRPC3相反[55]。在腦片研究中，TRPC7在細(xì)胞水平對(duì)CA3區(qū)錐體神經(jīng)元自發(fā)性癲癇發(fā)生發(fā)揮關(guān)鍵作用，在突觸水平對(duì)神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)至關(guān)重要[56]。

鈣動(dòng)員(calcium mobilization)對(duì)激活NLRP3炎性體有積極作用[57]。線粒體在鈣動(dòng)員過(guò)程中扮演重要角色，在線粒體膜上已知存在3種與線粒體Ca2+攝入相關(guān)的通道蛋白，即線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondral calcium uniporter，MCU)、線粒體鈣氫交換體(mitochondrial Ca2+/H+antiporter，Letm1)、經(jīng)典型瞬時(shí)受體電位通道3(canonical transient receptor potential 3，TRPC3)。經(jīng)其介導(dǎo)，線粒體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或胞外攝入Ca2+，從而調(diào)節(jié)鈣的時(shí)空分布模式(spatiotemporal patterns)。生理情況下，線粒體攝入鈣能夠維持線粒體正常代謝，而過(guò)度或持續(xù)的鈣內(nèi)流則引起線粒體鈣超載，產(chǎn)生高水平線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species，mROS)和線粒體通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrial permeability transition，MPT)，致使線粒體損傷和細(xì)胞死亡。在這個(gè)過(guò)程中，鈣信號(hào)調(diào)節(jié)線粒體的運(yùn)動(dòng)、融合、分裂，進(jìn)而調(diào)節(jié)NLRP3炎性體的激活[58]。

癲癇患者腦部存在鈣信號(hào)紊亂，而鈣穩(wěn)態(tài)(calcium homeostasis)對(duì)于調(diào)控神經(jīng)元興奮性和癇性發(fā)作敏感性起關(guān)鍵性作用。通過(guò)激活不同的鈣信號(hào)途徑所導(dǎo)致的神經(jīng)元過(guò)度同步放電是癲癇的典型特征[59]，而通過(guò)調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)則可改善癲癇發(fā)作[60]。在特異性阻斷TRPC3通道后，海人酸所致癲癇大鼠海馬內(nèi)NLRP3水平降低[52]。

4 總結(jié)

基于以上文獻(xiàn)分析，總結(jié)得出：①癲癇過(guò)程中伴隨炎性反應(yīng)，炎癥因子大量釋放；②癲癇的發(fā)生發(fā)展與Ca2+通道如TRPC的結(jié)構(gòu)或功能異常密切相關(guān)；③癲癇灶內(nèi)有大量神經(jīng)元死亡，包括炎癥性細(xì)胞死亡，即焦亡；④焦亡的激活有賴于細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員過(guò)程，而線粒體膜上的鈣通道如TRPC3在此過(guò)程中扮演重要角色。

由此推測(cè)，在癲癇過(guò)程中，鈣通道如TRPC3在神經(jīng)元線粒體膜上表達(dá)升高，啟動(dòng)鈣動(dòng)員，導(dǎo)致線粒體鈣超載繼而損傷，激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD途徑啟動(dòng)神經(jīng)元焦亡，病區(qū)腦組織神經(jīng)元大量丟失，同時(shí)炎性介質(zhì)的釋放又加重癲癇的發(fā)生發(fā)展，形成惡性循環(huán)(機(jī)制假說(shuō)如圖1)。這便解釋了在癲癇灶內(nèi)炎性細(xì)胞因子增多、神經(jīng)元大量丟失、鈣離子通道異常同時(shí)存在的原因。當(dāng)然，這一假說(shuō)還存在許多疑問(wèn)，尚需進(jìn)一步研究。

圖1 焦亡參與癲癇的機(jī)制假說(shuō)圖Fig.1 Hypothesis diagram：the mechanism of pyroptosis involved in epilepsy