LSD1在胚胎干細(xì)胞分化中的作用*

劉海港，孫立棟，宋檀婧

華中科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，武漢 430030

組蛋白賴氨酸去甲基化酶1A[lysine(K)-specific demethylase 1A，KDM1A或LSD1]是最早被發(fā)現(xiàn)的催化組蛋白賴氨酸去甲基化的酶類[1]。在此之前人們普遍對(duì)組蛋白賴氨酸是否存在去甲基化修飾存在爭(zhēng)議，該酶的發(fā)現(xiàn)揭示了組蛋白賴氨酸去甲基化修飾機(jī)制的存在，同時(shí)也佐證了組蛋白的甲基化修飾是動(dòng)態(tài)的，而非不可逆的。目前已經(jīng)有約20種組蛋白去甲基化酶被發(fā)現(xiàn)，能夠催化包括H3K4，H3K9，H3K27，H3K36和H4K20等多種位點(diǎn)在內(nèi)的組蛋白去甲基化。

1 LSD1的結(jié)構(gòu)和生理功能

Nagase等[2]于1998年最早克隆出了KDM1A基因，該基因位于1號(hào)染色體短臂上，全長(zhǎng)64249 bp，包含19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子，能夠編碼886個(gè)氨基酸。RT-PCR結(jié)果顯示，除了胰腺和脾臟外，LSD1在全身幾乎所有組織中均有表達(dá)，并且在腎臟和睪丸組織中表達(dá)最高。

LSD1是黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴的胺氧化酶家族的一員，可以通過輔基FAD催化氧化反應(yīng)特異性脫去組蛋白H3第4位的賴氨酸(H3K4)和H3第9位賴氨酸(H3K9)的一甲基化和二甲基化的甲基，但不能脫去三甲基化的甲基[1]。LSD1主要由3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，N端的SWIRM結(jié)構(gòu)域、C端的AOL結(jié)構(gòu)域以及中央伸出的Tower結(jié)構(gòu)域(圖1)。SWIRM有利于維持LSD1的穩(wěn)定性，并且和AOL結(jié)構(gòu)域存在廣泛的相互作用，形成大約1600 nm2的接觸面。Tower結(jié)構(gòu)域是從AOL結(jié)構(gòu)域中央伸出的兩個(gè)反向平行的α螺旋，將AOL結(jié)構(gòu)域分成兩個(gè)部分。AOL結(jié)構(gòu)域也包含兩個(gè)子域，分別是底物結(jié)合域和FAD結(jié)合域[3]。

圖1 LSD1的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：2HKO)Fig.1 The crystal structure of LSD1(PDB ID：2HKO)

LSD1在細(xì)胞內(nèi)通常和CoREST、BHC80以及HDAC1/2等LSD1相關(guān)蛋白構(gòu)成轉(zhuǎn)錄共抑制復(fù)合物。這些LSD1相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)LSD1的活性，其中CoREST的SANT2結(jié)構(gòu)域和LSD1的Tower結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合使得LSD1更穩(wěn)定，同時(shí)CoREST也能通過SANT2結(jié)構(gòu)域結(jié)合核小體上的DNA，從而使LSD1能夠催化以核小體為底物的去甲基化反應(yīng)[4]。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)LSD1還存在于核小體重塑和去乙酰化酶(NuRD)復(fù)合體內(nèi)。在復(fù)合體內(nèi)，LSD1的Tower結(jié)構(gòu)域可以與NuRD復(fù)合體內(nèi)的轉(zhuǎn)移性腫瘤抗原1-3(MTA1-3)直接結(jié)合，而MTA1-3上也存在SANT結(jié)構(gòu)域，可以協(xié)助LSD1錨定在核小體上，從而發(fā)揮與CoREST類似的作用。

作為特異性催化H3K4me1/2和H3K9me1/2的組蛋白賴氨酸去甲基化酶，LSD1對(duì)組蛋白H3去甲基化修飾后引起的下游生物學(xué)效應(yīng)取決于組蛋白賴氨酸的甲基化修飾對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的作用是激活還是抑制，其中H3K4甲基化多數(shù)情況下會(huì)激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，而H3K9的甲基化修飾則一般會(huì)抑制基因轉(zhuǎn)錄[6]。例如，使用胺氧化酶抑制劑Pargyline抑制LSD1的去甲基化酶活性，可以觀察到前列腺特異抗原(prostate-specific antigen，PSA)基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K9甲基化水平升高以及PSA表達(dá)量降低[7]。對(duì)秀麗隱桿線蟲的研究也表明，H3K4去甲基化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衰老的相關(guān)基因沉默[8]。

LSD1還能與雄激素受體(androgen receptor，AR)結(jié)合，促進(jìn)雄激素受體依賴的基因表達(dá)。首先，雄激素(配體)和AR的結(jié)合導(dǎo)致AR發(fā)生細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，定位到AR靶基因的雄激素反應(yīng)元件上。在細(xì)胞核內(nèi)，LSD1與AR共同構(gòu)成染色質(zhì)相關(guān)功能復(fù)合物來(lái)催化位于靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K9一甲基化和二甲基化的脫甲基化反應(yīng)[9]。

此外，LSD1能使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，Dnmt)去甲基化，同時(shí)起到穩(wěn)定Dnmt1的作用[10]。Dnmt1是一種重要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，具有催化DNA甲基化的作用。因而LSD1有利于DNA的甲基化，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄抑制。

2 人體胚胎干細(xì)胞介紹

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)分離于囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有多潛能性和自我更新的能力。在一定條件下，人ESC能分化為體內(nèi)三胚層來(lái)源的任何細(xì)胞。ESC自我更新能力和多能性的維持依賴于復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中Oct4、Sox2和Nanog等轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位[11]。研究表明，表觀遺傳調(diào)控在胚胎干細(xì)胞的自我更新和分化過程中也發(fā)揮著重要的功能，胚胎干細(xì)胞分化過程中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制已成為干細(xì)胞領(lǐng)域一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[12]。

3 表觀遺傳修飾與胚胎干細(xì)胞分化

表觀遺傳修飾是指DNA序列保持不變而基因表達(dá)發(fā)生可遺傳的變異的現(xiàn)象。表觀遺傳變化主要包括DNA的修飾、組蛋白的修飾、非編碼RNA作用和染色質(zhì)重塑等。表觀遺傳變化的產(chǎn)生是環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)相互作用的結(jié)果，最終體現(xiàn)在基因表達(dá)的變化上，產(chǎn)生基因沉默、休眠轉(zhuǎn)座子激活、基因印記和核仁顯性等生物學(xué)效應(yīng)[13]。眾多研究表明，腫瘤發(fā)生發(fā)展、衰老以及胚胎發(fā)育等生命過程都受到表觀遺傳的調(diào)控[14-16]。

3.1 DNA甲基化與胚胎干細(xì)胞分化

DNA甲基化是目前研究得最深入的DNA共價(jià)修飾類型。DNA甲基化是在Dnmt的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基共價(jià)結(jié)合到DNA胞嘧啶的第5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的過程，常于CpG島處發(fā)生。DNA甲基化能直接遏制轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄；除此之外甲基化結(jié)合蛋白會(huì)通過甲基化DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合在DNA上，這些蛋白同時(shí)是轉(zhuǎn)錄抑制因子，能誘導(dǎo)染色體狀態(tài)的改變，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄[17]。

DNA甲基化在胚胎干細(xì)胞分化中起重要的調(diào)控作用，基因組甲基化的異常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的胚胎發(fā)育障礙[18]。在生殖細(xì)胞形成和早期胚胎形成期，生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞基因組分別發(fā)生一次整體水平的去甲基化后重新甲基化，稱為DNA甲基化重編程。發(fā)生于配子形成期的DNA甲基化重編程的目的是使親代印跡基因被去除再重新確立；發(fā)生于早期胚胎形成時(shí)期的DNA甲基化重編程對(duì)受精卵獲得全能性并產(chǎn)生新個(gè)體是至關(guān)重要的[19]。Shen等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)祖細(xì)胞分化的過程中，大約有1.4%的CpG島區(qū)域發(fā)生了顯著的DNA重新甲基化過程。胚胎干細(xì)胞的定向分化過程也受到DNA甲基化水平的調(diào)控。Singh等[21]在造血干細(xì)胞分化過程中檢測(cè)到珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生去甲基化。Yoon等[22]發(fā)現(xiàn)用具有強(qiáng)烈甲基化酶抑制效應(yīng)的試劑可以誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。

3.2 組蛋白甲基化與胚胎干細(xì)胞分化

組蛋白修飾常發(fā)生在組蛋白尾部的賴氨酸和精氨酸殘基上，包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化等多種共價(jià)修飾類型。乙酰化和甲基化是最主要、最常見的組蛋白修飾類型，參與組蛋白甲基化和乙?；揎椀拿阜謩e是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferase，HMT)和組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)。組蛋白N端特異性殘基的乙?；梢韵魅鮀NA和組蛋白之間的相互作用，使?jié)饪s的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。組蛋白甲基化主要發(fā)生在組蛋白H3、H4的N端賴氨酸和精氨酸殘基上，其中組蛋白賴氨酸的甲基化殘基總共有6種(H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79、H4K20)，且均能被單甲基化、二甲基化和三甲基化。組蛋白賴氨酸甲基化的生物學(xué)效應(yīng)比較復(fù)雜，取決于發(fā)生甲基化的位點(diǎn)和甲基化的程度，可以是轉(zhuǎn)錄激活，也可以是轉(zhuǎn)錄抑制。

目前已有較多的研究表明組蛋白的甲基化在胚胎干細(xì)胞多潛能特性的維持中發(fā)揮著重要的作用[23]。ESC為了維持其多潛能性必須抑制分化基因表達(dá)，二價(jià)染色體區(qū)域的建立有助于這一過程。胚胎干細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)的二價(jià)染色體區(qū)域是指抑制基因表達(dá)的H3K27me3修飾和激活基因表達(dá)的H3K4me3共同存在的區(qū)域。分化相關(guān)基因的H3K27me3修飾丟失和H3K4me3修飾保留會(huì)促進(jìn)分化基因轉(zhuǎn)錄激活從而導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞沿一定方向分化。當(dāng)分化方向確定后，其他分化基因H3K27me3修飾的保留和H3K4me3修飾丟失則會(huì)抑制這些基因表達(dá)，胚胎干細(xì)胞向其他方向的分化也被關(guān)閉[24-25]。通常情況下，在二價(jià)染色體區(qū)域H3K27me3的抑制效應(yīng)要強(qiáng)于H3K4me3的激活效應(yīng)，所以二價(jià)染色體區(qū)域的作用是沉默分化相關(guān)基因[24]。

4 LSD1在胚胎干細(xì)胞分化中的作用

胚胎干細(xì)胞的分化過程依賴于兩類基因表達(dá)的協(xié)同調(diào)節(jié)，分別是譜系特異基因表達(dá)的激活和多潛能性基因(pluripotency genes，PpGs)表達(dá)的抑制。Lsd1-Mi2/NuRD復(fù)合物能沉默PpGs的增強(qiáng)子從而抑制多潛能性基因的表達(dá)、調(diào)控胚胎干細(xì)胞的分化過程。Petell等[26]深入研究了Lsd1-Mi2/NuRD復(fù)合物作為胚胎干細(xì)胞分化的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)開關(guān)在誘導(dǎo)組蛋白尾部和Dnmt3的ADD結(jié)構(gòu)域局部相互作用導(dǎo)致PpGs啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化的機(jī)制。組蛋白尾部未甲基化的H3K4與Dnmt3a ADD結(jié)構(gòu)域的相互作用能激活Dnmt3a的催化活性，引起PpGs增強(qiáng)子區(qū)域DNA的甲基化。這種相互作用能夠被H3K4一甲基化和組蛋白乙?；钄郲27]。因此，LSD1與Mi2/NuRD去乙酰化復(fù)合物的相互作用導(dǎo)致了H3K4me1的去甲基化和H3K27ac的去乙?；?，引起Dnmt3a的激活，從而提高了PpG基因增強(qiáng)子區(qū)域的DNA甲基化水平，抑制PpG基因的增強(qiáng)子活化和轉(zhuǎn)錄激活。

除此之外，一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Mll4能夠被特異性募集到目標(biāo)染色質(zhì)的增強(qiáng)子區(qū)域，這種募集過程在胚胎干細(xì)胞由原始態(tài)多能性向始發(fā)態(tài)多能性的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著必不可少的作用[28]。研究表明，LSD1與Mll4共定位于染色質(zhì)上相同的增強(qiáng)子區(qū)域，并且在Mll4敲除的胚胎干細(xì)胞內(nèi)，LSD1能夠結(jié)合到基因的增強(qiáng)子上，引起H3K4me1去甲基化，解除增強(qiáng)子的功能，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄抑制和胚胎干細(xì)胞多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)換失敗[28]。而靶向LSD1的基因敲低在很大程度上恢復(fù)了Mll4敲除的胚胎干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)，表明Mll4缺失引起的多能性轉(zhuǎn)變中的轉(zhuǎn)錄缺陷依賴于LSD1的組蛋白表觀遺傳修飾功能。

Guo等[29]研究發(fā)現(xiàn)LSD1通過介導(dǎo)GATA-2轉(zhuǎn)錄因子的抑制在胚胎干細(xì)胞和造血干(祖)細(xì)胞紅系分化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。GATA-1和GATA-2是調(diào)節(jié)造血譜系分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，尤其是在紅系分化中起關(guān)鍵性的作用。在干細(xì)胞紅系分化過程中，LSD1被TAL1募集到GATA-2基因座位上并發(fā)揮去甲基化酶活性引起GATA-2基因座附近H3K4me2水平降低，從而抑制了GATA-2基因的轉(zhuǎn)錄。研究者們?cè)谂咛ジ杉?xì)胞內(nèi)用shRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)敲低LSD1，然后用促紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)其分化。隨后的檢測(cè)結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，LSD1敲低的胚胎干細(xì)胞出現(xiàn)了紅系造血分化被抑制的現(xiàn)象。

曾經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道LSD1在干細(xì)胞發(fā)育的多個(gè)階段的表型轉(zhuǎn)換點(diǎn)都是不可或缺的，其中就包括脂肪組織的形成[30]。Xiong等[31]為了深入探究LSD1在人類胚胎干細(xì)胞向脂肪組織分化中的作用，用不同濃度的LSD1的抑制劑CBB1007處理人類胚胎干細(xì)胞，觀察胚胎干細(xì)胞被誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)向脂肪組織分化的情況。研究者在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到隨著LSD1抑制劑CBB1007濃度的增加，胚胎干細(xì)胞脂肪分化的效率也會(huì)提升。這說明在胚胎干細(xì)胞脂肪分化的過程中，LSD1的抑制能夠促進(jìn)脂肪組織的生成。研究者們還發(fā)現(xiàn)LSD1的抑制導(dǎo)致了組蛋白H3K4me2水平和PPARγ和C/EBPα表達(dá)水平的升高。PPARγ和C/EBPα是調(diào)控人類胚胎干細(xì)胞向脂肪組織分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，它們的啟動(dòng)子區(qū)域存在H3K4me2[32]。這些結(jié)果表明LSD1的抑制可能通過增加PPARγ和C/EBPα啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me2水平，促進(jìn)PPARγ和C/EBPα基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致脂肪組織形成。

有研究表明LSD1的減少會(huì)導(dǎo)致Sox2，Oct4等在胚胎干細(xì)胞自我更新和全能性的維持中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，從而抑制具有全能性的胚胎干細(xì)胞的自我更新[33-34]。在鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)，SET7甲基轉(zhuǎn)移酶催化Sox2第119位的賴氨酸的單甲基化修飾過程，引發(fā)了泛素依賴的Sox2蛋白水解作用[35]。Zhang等[36]研究表明LSD1作為去甲基化酶能夠去除Sox2蛋白上的多種甲基化基團(tuán)，從而抑制Sox2甲基化引起的泛素依賴的蛋白水解過程。研究者們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LSD1的下調(diào)會(huì)促進(jìn)Sox2蛋白水解，但是這種作用會(huì)被SET7的失活所阻斷。這項(xiàng)結(jié)果證實(shí)了SET7和LSD1可以通過催化Sox2蛋白特異位點(diǎn)發(fā)生甲基化或者去甲基化，從而影響Sox2的穩(wěn)定性，并進(jìn)而在胚胎干細(xì)胞自我更新和全能性的維持中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

Vinckier等[37]的研究表明，在胚胎干細(xì)胞向組織細(xì)胞分化發(fā)育的過程中會(huì)受到很多分化信號(hào)的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)，每一種分化信號(hào)作用一段時(shí)間后就必須終止，否則會(huì)影響細(xì)胞下一個(gè)階段的誘導(dǎo)分化。例如，在胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的過程中需要視黃酸這一信號(hào)的誘導(dǎo)，從而引起相關(guān)基因增強(qiáng)子激活和表達(dá)水平升高。而LSD1則能通過解除增強(qiáng)子的功能使得被視黃酸信號(hào)誘導(dǎo)激活的基因沉默，從而及時(shí)終止視黃酸信號(hào)對(duì)細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)換到下一個(gè)分化階段。研究者觀察到，當(dāng)LSD1活性被抑制后，被視黃酸誘導(dǎo)激活的基因不能被沉默，即使此時(shí)去除視黃酸這一誘導(dǎo)信號(hào)，細(xì)胞仍然不能過渡到下一個(gè)分化階段。這證明了LSD1在調(diào)控分化信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平改變中的重要作用。

He等[38]研究發(fā)現(xiàn)LSD1的抑制能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向胰島素生成細(xì)胞(insulin producing cell，IPC)分化并幫助IPC成熟。該研究采用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)技術(shù)從人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系中誘導(dǎo)產(chǎn)生IPC，并且通過慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA技術(shù)降低LSD1表達(dá)水平。接下來(lái)研究者們觀察到LSD1的mRNA水平降低以及LSD1蛋白表達(dá)量在干細(xì)胞向IPC分化的過程中逐漸減少。為了探究LSD1調(diào)控人胚胎干細(xì)胞向IPC分化的具體機(jī)制，研究者們用Western blot檢測(cè)了分化過程各時(shí)期關(guān)鍵的信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的改變。其中，ERK信號(hào)通路在分化過程中持續(xù)激活。并且在用shRNA敲低LSD1的分化細(xì)胞中，總的ERK表達(dá)水平被檢測(cè)到劇烈減少，而磷酸化ERK水平明顯升高。在用LSD1的抑制劑TCP處理的細(xì)胞中也觀察到了這樣的結(jié)果。許多文獻(xiàn)報(bào)道ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)胚胎干細(xì)胞的分化調(diào)控十分關(guān)鍵[39-40]。例如，Kim等[39]曾證明ERK介導(dǎo)的Nanog磷酸化通過影響Nanog蛋白的穩(wěn)定性在胚胎干細(xì)胞的自我更新中發(fā)揮著重要作用?？傊?，研究者還通過后續(xù)一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LSD1的抑制通過引起ERK信號(hào)通路激活促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向IPC分化的機(jī)制。

5 總結(jié)和展望

綜合以上所述不難發(fā)現(xiàn)，LSD1調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化的一般模式是通過影響分化關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，繼而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平，最終導(dǎo)致分化的增強(qiáng)或是抑制?？傊?，LSD1在胚胎發(fā)育尤其是胚胎干細(xì)胞的分化發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)的維持、分化方向的決定都有賴于LSD1的脫甲基化機(jī)制。對(duì)LSD1的研究，將有助于進(jìn)一步闡明表觀遺傳學(xué)在胚胎干細(xì)胞自我更新和分化中的調(diào)控機(jī)制，為胚胎干細(xì)胞臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

然而，目前的研究成果主要集中在LSD1通過催化H3K4的去甲基化調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化，對(duì)于LSD1催化H3K9去甲基化對(duì)胚胎干細(xì)胞發(fā)育的影響很少述及。除此之外，其他非組蛋白如p53等也能作為L(zhǎng)SD1的去甲基化底物。非組蛋白底物的甲基化水平改變是否會(huì)影響胚胎干細(xì)胞分化進(jìn)程仍有待進(jìn)一步的研究。