轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白對子癇前期的診斷和治療作用研究

馬曉鵬，曹廣明，劉崇東

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院產(chǎn)科，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100020）

子癇前期是孕期常見的嚴重妊娠并發(fā)癥，是目前孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一[1]，有文獻報道其發(fā)病率約為12%[2]，在我國孕產(chǎn)婦發(fā)病率為2%～6%[3]。迄今為止，其發(fā)病機制尚未完全明確，任何單一的病因?qū)W說均不能解釋其病因和發(fā)病機制[4-5]。為改善母兒預后，子癇前期的診斷及治療是目前臨床研究的熱點問題。已有研究表明，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）是子癇前期孕婦重要的差異性表達蛋白之一[6]。本研究使用亞硝基左旋精氨酸甲酯（nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）法建立子癇前期小鼠模型，通過分析TTR對子癇前期孕鼠及其子代病理生理變化的影響，為子癇前期的診斷及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 試驗動物準備 選取健康無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級CD-1雌性小鼠37只，雄性小鼠10只，體質(zhì)量25～28 g，飼養(yǎng)于中國科學院生物物理研究所屏障系統(tǒng)內(nèi)。選用8周齡左右的雌鼠和9周齡左右的雄鼠，于每天17:00將小鼠按照雌鼠∶雄鼠2∶1合籠過夜，次日晨8:00檢查雌鼠有無陰道栓，發(fā)現(xiàn)陰道栓之日即認定為妊娠第1天。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核并批準。

1.2 實驗動物分組 按完全隨機分組法將孕鼠分為四 組：對 照 組9只，TTR組8只，L-NAME組11只，L-NAME+TTR組9只。處理方法如下：對照組在妊娠第7～11天皮下注射生理鹽水50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔注射生理鹽水100 μL；TTR組在妊娠第7～11天皮下注射生理鹽水50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔 注 射TTR 100 μg。L-NAME組 和L-NAME+TTR組用L-NAME法建立子癇前期小鼠模型：于妊娠第 7天開始行 L-NAME 50 mg/（kg·d）皮下注射，連續(xù)注射 5 d即妊娠第 11 天建立模型。L-NAME組在妊娠第7～11天皮下注射L-NAME 50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔注射生理鹽水100 μL；L-NAME+TTR組在妊娠第7～11天皮下注射L-NAME 50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔注射TTR 100 μg。

1.3 小鼠血壓及尿蛋白測定及血清中TTR的檢測 從妊娠第6天開始，隔日對孕鼠進行血壓測量，通過無創(chuàng)鼠尾血壓計，利用尾套法測量小鼠的收縮壓、舒張壓和平均動脈壓，每只小鼠采集6次血壓值，最終以平均值作為當天的血壓值。于妊娠第17天采用應激性排尿法收集小鼠尿液，將尿液常溫瞬時離心，保存于－80 ℃冰箱，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）進行尿蛋白檢測。小鼠妊娠第18天，用眼眶后靜脈叢采血法留取血標本，將血標本于離心機中以2 000 r/min、4 ℃離心15 min，吸取血清于－80 ℃冰箱保存，用ELISA進行血清TTR檢測。

1.4 子代發(fā)育情況比較 孕鼠妊娠第18天抽血成功后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，暴露子宮，見孕鼠子宮呈“Y”型、壁薄，兩側(cè)宮腔內(nèi)可見鼠胎及胎盤。自子宮遠端沿子宮血管網(wǎng)對側(cè)剪開子宮，依次取出胎仔及胎盤，計數(shù)正常形態(tài)胎仔和胎盤數(shù)量。并將胎仔及胎盤置于分析天平上稱取質(zhì)量，精確至0.001 g。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料滿足正態(tài)分布或近似正態(tài)分布且方差齊時行兩獨立樣本t檢驗，不滿足正態(tài)分布或方差不齊時行非參數(shù)秩和檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組孕鼠血壓情況比較 于小鼠妊娠第7天始皮下注射L-NAME后，子癇前期組（包括L-NAME組和L-NAME+TTR組）孕鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓與對照組比較，均出現(xiàn)了明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；妊娠第11天經(jīng)過腹腔注射TTR后，L-NAME+TTR組孕鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓較L-NAME組均明顯下降，以舒張壓下降幅度更為明顯，但各項血壓值仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；TTR組孕鼠的血壓與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 各組孕鼠的血壓變化

2.2 各組孕鼠尿蛋白水平比較 L-NAME組孕鼠的尿蛋白定量較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；注 射TTR后 的L-NAME+TTR組 孕 鼠的尿蛋白較L-NAME組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TTR組孕鼠尿蛋白與對照組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖2。

2.3 各組孕鼠血清TTR含量比較 應用ELISA方法對各組孕鼠血清內(nèi)TTR含量進行測定。結(jié)果顯示子癇前期組孕鼠血清內(nèi)TTR的含量較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。當用TTR干預治療后，L-NAME+TTR組孕鼠血清TTR水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結(jié)合孕鼠血壓以及尿蛋白的變化，表明TTR干預明顯改善了小鼠的子癇前期樣癥狀和尿蛋白異常。結(jié)果見圖3。

2.4 各組子代發(fā)育情況比較 四組孕鼠均于妊娠第18天處死，見孕鼠子宮呈“Y”型，壁薄，兩側(cè)宮腔內(nèi)可見胎仔及胎盤，見圖4。記錄各組孕鼠的妊娠數(shù)量，分離出胎仔與胎盤，見圖5。結(jié)果顯示：子癇前期組孕鼠的胎仔質(zhì)量及胎盤質(zhì)量均明顯低于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），L-NAME組可見死胎1例；應用TTR后的L-NAME+TTR組，其胎盤與胎仔質(zhì)量較L-NAME組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明TTR可逆轉(zhuǎn)子癇前期胎盤與胎仔質(zhì)量的下調(diào)改變，見圖6。

圖4 待分離的胎仔與胎盤

圖5 已分離的胎仔與胎盤

圖6 各組孕鼠間胎盤質(zhì)量（左）及胎仔質(zhì)量（右）比較結(jié)果

3 討論

子癇前期是妊娠期特有的一種嚴重并發(fā)癥，其主要的病理、生理變化是全身小動脈痙攣，可導致母兒嚴重的并發(fā)癥，目前仍是導致孕婦及圍產(chǎn)兒患病及死亡的主要病因之一[7]。另有研究表明，子癇前期與產(chǎn)后成人心血管疾病的發(fā)生有關聯(lián)[8]；暴露于子癇前期的子代，成年后血壓及體質(zhì)量指數(shù)增高的風險增加，發(fā)生腦卒中的風險增高[9]。因此，如何有效地預防和治療子癇前期已成為目前全世界共同關注的熱點問題。

子癇前期的發(fā)病學說眾多，但任何一個病因?qū)W說都不能解釋所有子癇前期的病因和發(fā)病機制，我們對子癇前期的發(fā)病機制還需進一步的研究。動物模型可以再現(xiàn)疾病的發(fā)生發(fā)展過程，為疾病的治療及預防提供思路，是目前進行疾病發(fā)病機制、治療研究的主要方法之一。L-NAME是一氧化氮合酶抑制劑，可使一氧化氮的合成減少，引起小鼠全身血管收縮，從而模擬子癇前期的主要病理生理改變[10]。本研究中應用L-NAME后，可見子癇前期模型組的孕鼠出現(xiàn)了明顯的血壓升高、尿蛋白增多、胎仔體質(zhì)量減低等表現(xiàn)，有效地模擬了子癇前期的主要病理、生理表現(xiàn)。因此，無論是從孕鼠或是從其子代方面分析，這種建模方法是成功可行的，而且此法操作簡單、重復性好，造模成功率高，故而可予以廣泛應 用。

TTR最初被稱作前白蛋白，于1942年首次在血清及腦脊液中被發(fā)現(xiàn)[11-12]。蛋白質(zhì)組學研究中發(fā)現(xiàn)，TTR在子癇前期患者血清中的表達濃度明顯下調(diào)[6]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，TTR在監(jiān)測病情變化及對治療反應方面也可能具有一定的意義：子癇前期病情越重，TTR下降的趨勢越明顯[13]，在診斷重度或輕度子癇期具有明確的意義[14-15]。

既往Nakashima等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期動物模型中血漿TTR值明顯低于對照組，TTR以聚集的形式沉積在胎盤組織，并導致胎盤組織壞死、誘發(fā)胎盤功能障礙。本研究中，TTR在子癇前期孕鼠血清中的表達均明顯低于正常孕鼠，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。這可能是由于子癇前期的病理過程中，TTR蛋白四聚體變性轉(zhuǎn)化為無活性的TTR單體而沉積于胎盤組織，不能行使其正常的生物學功能，導致細胞凋亡，加重胎盤功能減退，進一步導致胎盤分泌TTR水平、血活性TTR水平均下降[17-19]。另有學者通過小鼠實驗也證實TTR可以抑制類似子癇前期的臨床表現(xiàn)和（或）病理改變，包括新發(fā)病的蛋白尿、高血壓、腎小球內(nèi)皮增生及抗血管生成因子的生成等[20]。本研究結(jié)果還表明應用TTR干預后，可改善其血壓及尿蛋白升高的變化，并可使胎盤及胎仔質(zhì)量增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。這說明外源性TTR對于子癇前期病理過程的逆轉(zhuǎn)、改善母胎結(jié)局可能有積極作用。

綜上所述，本研究提示TTR的表達下調(diào)對子癇前期可能具有一定的診斷作用，TTR在一定程度上可以逆轉(zhuǎn)子癇前期導致的血壓升高、尿蛋白升高等病理改變。另外，本研究還初步評價了TTR對改善母胎結(jié)局的療效。這些有助于更深入地了解子癇前期的發(fā)病機制，從而為臨床防治該病拓展新的思路。我們期待TTR作為新型的子癇前期的預測因子及治療靶點在子癇前期的診斷和治療中發(fā)揮重要的作用。