敗毒飲的高效液相指紋圖譜及4種成分的含量測定

韓曉珂，梁朝鋒，秦亞東，徐斌（. 蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 蕪湖 4000；. 安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽 蕪湖 400）

敗毒飲為本制劑中心與院內(nèi)內(nèi)科專家根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，由金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、黃芩、赤芍、天葵子7味中藥經(jīng)過現(xiàn)代工藝加工制成的中藥制劑（皖藥制字Z20050035），主要功效為清熱解毒，用于癤腫、癰疽以及感染性疾病的治療，效果顯著。方中金銀花、野菊花為君藥，均具有清熱解毒等功效[1-2]。

現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無法全面反映制劑的內(nèi)在特征[3]，而中藥指紋圖譜能較全面地反映出復(fù)雜中藥成分之間的相關(guān)性，可以監(jiān)測中藥質(zhì)量及穩(wěn)定性，并對其全過程進(jìn)行質(zhì)量控制[4]，對中藥及制劑具有十分重要的意義。本文采用HPLC法對敗毒飲指紋圖譜進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并對綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、蒙花苷4個(gè)成分的含量進(jìn)行了測定，為全面評價(jià)本制劑的質(zhì)量提供了參考。

1 材料

Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XP205電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；優(yōu)普系列超純水器（UPS-11-10T，成都優(yōu)普凈化科技有限公司）。

敗毒飲共11批（批號分別為190603、190617、190620、190708、190721、190814、190819、190910、190918、191012、191028，蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，編號為S1～S11）；飲片赤芍、蒲公英、紫花地丁、天葵子、金銀花、野菊花、黃芩均來源于蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院中藥房，經(jīng)徐斌副主任中藥師鑒定，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)；黃芩苷（批號：110715-201821，純度以95.4%計(jì)）、蒙花苷（批號：111528-201308，純度以95.1%計(jì)）、綠原酸（批號：110753-201415，純度以96.6%計(jì)）、咖啡酸（批號：110885-200102，純度以98.0%計(jì)）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（色譜純）；其他試劑（分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為安捷倫ZORBAX-SB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0～8 min，7%～11%A；8～13 min，11%～17%A；13～30 min，17%～28%A；30～32 min，28%A；32～40 min，28%～80%A；40～45 min，80%～90%A；體積流量1 mL·min－1；波長334 nm；柱溫30℃[5-7]，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 樣品溶液的制備

精密量取敗毒飲2 mL，置50 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，濾液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取敗毒飲（批號：190814），按“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測定，連續(xù)6次進(jìn)樣，以12號色譜峰（黃芩苷）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間RSD＜0.87%，相對峰面積RSD＜2.7%，表示精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取敗毒飲（批號：190814），按“2.2”項(xiàng)下方法制備，分別在0、2、4、6、8、10、12 h按“2.1”項(xiàng)下條件測定，以12號色譜峰（黃芩苷）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間RSD＜1.3%，相對峰面積的RSD＜2.5%，說明樣品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取敗毒飲（批號：190814）6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測定以12號色譜峰（黃芩苷）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間RSD＜1.2%，相對峰面積的RSD＜2.5%，重復(fù)性良好。

2.4 敗毒飲HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)

將11批敗毒飲色譜圖數(shù)據(jù)輸入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，以S1為參照圖譜，運(yùn)用中位數(shù)法，設(shè)時(shí)間寬度為0.1，多點(diǎn)校正后自動匹配色譜峰，生成對照圖譜，見圖1。選擇圖譜中穩(wěn)定性好、特征性明顯的色譜峰作為共有峰，確定16個(gè)共有峰，指紋圖譜疊加圖見圖2。根據(jù)對照品比對，指認(rèn)出3號峰為綠原酸、6號峰為咖啡酸、12號峰為黃芩苷、13號峰為蒙花苷。利用該系統(tǒng)對11批樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果相似度均＞0.995，表明各批制劑批間差異小，制劑質(zhì)量穩(wěn)定。見表1。

表1 11批樣品相似度評價(jià)結(jié)果Tab 1 Similarity of 11 batches of samples

圖1 敗毒飲對照指紋圖譜Fig 1 HPLC reference fingerprint of Baidu decoction

圖2 11批樣品HPLC指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprint of 11 batches of samples

2.5 4種成分的含量測定

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱取各對照品適量，分別用甲醇制成含綠原酸199.2 μg·mL－1、咖啡酸79.2 μg·mL－1、黃芩苷1.24 mg·mL－1、蒙花苷156.32 μg·mL－1的對照品母液。分別精密吸取綠原酸、咖啡酸對照品母液各0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，吸取黃芩苷對照品母液各0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL，吸取蒙花苷對照品母液 各0.5、1、2、3、4、5 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列對照品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以進(jìn)樣量和峰面積分別作為橫坐標(biāo)（X）和縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，具體結(jié)果見表2，可以看出各成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

表2 4種成分線性關(guān)系Tab 2 Linearity of the 4 components

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取上述對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)測定6次，測得綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、蒙花苷峰面積的RSD分別為2.9%、1.6%、2.1%、0.77%，表示精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取敗毒飲（批號：190814），按“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣分析，測得綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、蒙花苷峰面積的RSD分別為0.58%、0.66%、0.13%、0.54%，說明樣品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取敗毒飲（批號：190814）6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、蒙花苷的平均含量分別為0.5178、0.037 05、3.274、0.7346 mg·mL－1，RSD分別為0.86%、2.7%、0.39%、2.7%，表明重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 精密量取敗毒飲（批號：190814）1 mL，共6份，置50 mL量瓶中，分別精密加入綠原酸（0.249 mg·mL－1）2.1 mL、咖啡酸（7.92 μg·mL－1）4.8 mL、黃芩苷（0.182 mg·mL－1）15 mL、蒙花苷（78.16 μg·mL－1）9 mL，加稀乙醇至刻度，濾過搖勻，濾液過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果4種成分平均加樣回收率分別為99.4%、101.8%、99.5%、99.7%，RSD分別為2.3%、2.8%、2.6%、1.6%，符合方法學(xué)要求。

2.5.6 含量測定 取11批敗毒飲（S1～S11）各2 mL，按照“2.2”項(xiàng)下方法處理后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，混合對照品及樣品色譜圖見圖3，具體結(jié)果見表3。

圖3 混合對照（A）及樣品（B）色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of the mixed reference substance（A）and the sample（B）

表3 11批樣品中4種成分含量測定結(jié)果(mg·mL－1)Tab 3 Content of the 4 components in 11 batches of samples (mg·mL－1)

2.6 共有色譜峰的歸屬

取處方量1/5的飲片，按照制劑提取工藝，提取各個(gè)飲片，定容至200 mL，得到黃芩、野菊花、紫花地丁、蒲公英、天葵子、赤芍、金銀花飲片的溶液。精密量取上述溶液各2 mL，置50 mL量瓶內(nèi)，加稀乙醇定容至刻度，即得到各個(gè)飲片的供試品溶液。

將各個(gè)飲片的供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，通過和樣品色譜圖的保留時(shí)間對比，對樣品指紋色譜共有峰的來源進(jìn)行歸屬。經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共有峰1、3、4、9、10、11來自金銀花，3、8、9、10、11、13來自野菊花，2、6、9來自蒲公英，7、8、12、14、15、16來自黃芩，5來自紫花地丁，未發(fā)現(xiàn)天葵子和赤芍的色譜峰。相關(guān)飲片色譜圖見圖4。

圖4 單味藥材與樣品HPLC色譜圖Fig 4 HPLC chromatogram of single medicinal materials and the sample

3 討論

3.1 流動相考察

本試驗(yàn)對不同的流動相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，分析了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.1%甲酸等多個(gè)系統(tǒng)，考察了各個(gè)系統(tǒng)對整個(gè)色譜峰的分離效果及特征峰信息量，最終確定流動相為乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)。

3.2 檢測波長考察

本試驗(yàn)采用DAD檢測器在190～400 nm全波長下掃描了敗毒飲樣品，根據(jù)三維色譜圖，結(jié)合色譜峰信息的全面性、基線平穩(wěn)性、各峰分離度等方面，最終確定334 nm為采集波長。

3.3 色譜峰歸屬

在考察色譜峰歸屬時(shí)，未發(fā)現(xiàn)任何色譜峰歸屬于赤芍和天葵子。有關(guān)赤芍的含量測定及指紋圖譜研究常選擇波長為230 nm、260 nm[8-10]。天葵子主要成分為生物堿、氰基和硝基類、酚酸類等[11]，孫志強(qiáng)等[12]在波長258 nm處對其特征指紋及其兩個(gè)成分含量進(jìn)行了研究，本色譜條件未出現(xiàn)赤芍和天葵子相應(yīng)色譜峰，可能其在334 nm處吸收較弱。

4 結(jié)論

本研究首次建立了敗毒飲的指紋圖譜，確認(rèn)了16個(gè)共有峰，指認(rèn)出綠原酸（3號峰）、咖啡酸（6號峰）、黃芩苷（12號峰）、蒙花苷（13號峰）4個(gè)成分并對其進(jìn)行了含量測定。本方法前處理?xiàng)l件快捷簡單，準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性好，實(shí)用性強(qiáng)，為有效地控制敗毒飲的質(zhì)量提供了科學(xué)的方法。