甘草飲片指紋圖譜的建立及主要成分的含量測定

汪洋，黃宇飛，金文芳，王國凱，朱月健，葛德助，劉勁松*（. 安徽中醫(yī)藥大學藥學院 中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室，合肥 00；. 安徽普仁中藥飲片有限公司，安徽 亳州 6800；. 安徽濟人藥業(yè)有限公司，安徽亳州 6800）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat. 或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根和根莖，味甘性平，作用溫和[1-2]，具有抗炎、抗腫瘤、治療心腦血管疾病和抗病毒等作用[3-6]。

隨著中藥指紋圖譜的不斷發(fā)展和應用，指紋圖譜和多成分含量測定方法已經(jīng)能提供豐富的指標成分和藥效成分信息，可以較為全面地反映中藥材飲片的質(zhì)量，近年來已被廣泛用作中藥材的質(zhì)量控制方法[7-8]。甘草作為一種大宗藥材，已有多位學者對其指紋圖譜或含量測定進行過研究[9-10]，這些研究也為甘草質(zhì)量標準的控制奠定了基礎(chǔ)。但是通過對文獻的研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)學者都是研究同一產(chǎn)地或者同一品種甘草藥材的指紋圖譜[11-13]，對甘草飲片質(zhì)量的研究較少。同時，由于市場中藥材來源的不確定性，會導致甘草飲片質(zhì)量參差不齊。為了能更有效地控制甘草藥材飲片的質(zhì)量，區(qū)分甘草飲片的品質(zhì)，本研究采用高效液相色譜法建立了不同地區(qū)、不同市場和不同產(chǎn)地的多批次甘草飲片的指紋圖譜，為質(zhì)量標準的建立提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 1525高效液相色譜儀（美國Waters 1525）；超純水處理系統(tǒng)（美國PALL CascadaTMⅡⅠ5）；超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司 KQ2200）；分析天平（瑞士 METTLER TOLEDO AB135-S）；乙腈（色譜純，瑞典Oceanpak公司）；磷酸（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；0.22 μm微孔濾頭（美國沃特世）；甘草酸銨（批號：CFN99153，純度≥98.00%）、甘草苷（批號：CFN99154，純度≥98.00%）（武漢天植生物技術(shù)有限公司）；30批甘草飲片分別采集于不同省市，由安徽中醫(yī)藥大學俞年軍教授鑒定為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.），來源見表1。

表1 樣品來源Tab 1 Sample source

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為WondaSil C18Superb（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（B）-0.1%磷酸水（A），梯度洗脫（0～15 min，20%～30%B；15～25 min，30%～32%B；25～30 min，32%～43%B；30～43 min，43%～44%B；43～48 min，44%～90%B；48～55 min，90%～20%B）；流速1 mL·min－1；柱溫30℃；檢測波長254 nm；進樣體積20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取藥材適量，粉碎（過3號篩），精密稱取2.0 g于具塞錐形瓶中，加入70%的乙醇50 mL，稱重，超聲30 min，放涼后用70%的乙醇補重，搖勻后離心，取上清液過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取甘草苷和甘草酸銨對照品10.00 mg，置于5 mL的量瓶中，加入70%的乙醇充分振蕩溶解，定容到刻度，得到單個質(zhì)量濃度為2.00 mg·mL－1的對照品溶液。精密移取適量對照品溶液置同一量瓶中混合，定容，即得混合對照品溶液。

2.4 多成分含量測定

2.4.1 線性關(guān)系考察 各取適量對照品溶液進行混合，使混合溶液中甘草苷的濃度分別為0.025、0.05、0.15、0.20、0.30、0.40 mg·mL－1；甘草酸的濃度分別為0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg·mL－1。進樣測定，以峰面積為縱坐標（X），質(zhì)量濃度為橫坐標（Y）建立線性方程，結(jié)果甘草苷標準方程為Y＝1.31×107X－2.61×105（r＝0.9996）；甘草酸為Y＝6.32×106X－1.75×105（r＝0.9997）。

2.4.2 精密度試驗 連續(xù)進樣6次同一供試品溶液（S7），計算甘草苷和甘草酸的峰面積的RSD分別為1.7%和0.86%，證明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 分別在0、2、4、8、12、24 h后進樣同一批供試品溶液（編號：S7），得甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.84%和1.7%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復性試驗 進樣檢測同一批供試品溶液6次（S7），計算甘草苷和甘草酸含量的RSD分別為1.6%和1.5%，說明方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 精密稱取0.50 g同一批藥材粉末6份（S7），分別加入0.12 mg甘草苷和0.55 mg甘草酸銨的對照品，制備供試品溶液，進樣測定，甘草苷和甘草酸加樣回收率的平均值分別為100.34%和100.52%，其RSD值分別為0.98%和0.88%，表明此方法準確可行，回收率良好。

2.4.6 含量測定結(jié)果 將甘草飲片粉末制備成供試品溶液，進樣測定，外標法計算樣品中甘草酸和甘草苷成分的百分含量，結(jié)果見表2。S6、S8、S10、S22的甘草酸的含量高于其他批次，其甘草苷的含量也高于大部分批次。

表2 30批甘草藥材含量測定結(jié)果(n＝2)Tab 2 Determination of 30 batches of licorice materials (n＝2)

2.5 指紋圖譜

2.5.1 指紋圖譜的建立及特征峰的指認 按“2.2”項下方法制備（S1～S30）供試品溶液，進樣檢測。將混合對照品溶液色譜圖與S1號色譜圖進行對比（見圖1），發(fā)現(xiàn)2號峰與13號峰的保留時間與混合對照品一致，并通過光譜對比，確定2號峰為甘草苷，13號峰為甘草酸。

圖1 混合對照品溶液（A）和樣品S1共有模式（B）的色譜圖Fig 1 Chromatogram of the mixed standard solution（A）and S1 common mode（B）

2.5.2 相似度評價 采用2012版的中藥指紋圖譜軟件對30批藥材圖譜進行多點校正，校正完成后選擇Mark峰匹配，匹配后30批藥材的疊加色譜圖見圖2，選擇S1號色譜圖作為參照圖譜，進行相似度計算，結(jié)果相似度均在0.941～0.999。

圖2 30批甘草藥材疊加色譜圖Fig 2 Chromatograms of 30 batches of licorice materials

2.6 多元統(tǒng)計學分析

2.6.1 聚類分析 使用SPSS 23.0軟件，采用系統(tǒng)聚類法，以各共有峰峰面積為變量對藥材樣品進行聚類分析[14-16]，結(jié)果見圖3。當把范圍設置為10時，采用聚類分析法可將30批甘草藥材聚為2類，S6、S8、S10、S22為Ⅰ類，S1～S5、S7、S9、S11～S21、S23～S30為Ⅱ類。結(jié)果內(nèi)蒙古產(chǎn)地與亳州市場的藥材聚為了一類，我國市面上的大部分甘草品種為烏拉爾甘草[17]，可能是因產(chǎn)地內(nèi)蒙古和亳州市場的藥材為同一品種。

圖3 30批甘草藥材聚類分析樹狀圖Fig 3 Clustering analysis dendrogram of 30 batches of licorice materials

2.6.2 主成分分析 采用SPSS 23.0軟件對30批不同批次甘草藥材的13個共有峰的數(shù)據(jù)進行主成分分析，計算得KMO值大于0.5，存在顯著差異（P＜0.05）。計算主成分特征值和累計貢獻率，以特征值大于1為標準，得到前3個主成分因子的特征值分別為7.010、3.049、1.048，特征值的大小代表了矩陣正交化之后所對應特征向量對于整個矩陣的貢獻程度，前3個主成分因子的累計方差貢獻率為85.43%（＞85.00%），說明這3個主成分代表了甘草藥材13個共有峰85.43%的信息量，具有很好的代表性。主成分分析碎石圖在＜3時陡峭，＞3時平緩（見圖4），說明主成分因子1、2、3可以反映甘草藥材指紋圖譜共有峰的大部分信息。

圖4 主成分分析碎石圖Fig 4 PCA gravel diagram

表4 主成分特征值和及方差Tab 4 Principal component eigenvalue sum and variance

2.6.3 正交偏最小二乘判別分析 分別將30批藥材的共有峰面積和不同產(chǎn)地的共有峰面積數(shù)據(jù)導入SIMCA 14.1軟件，進行有監(jiān)督的OPLSDA建模分析，生成的OPLS-DA得分散點圖分別為圖5和圖6，其預測模型的Q2分別為0.556和0.835，均大于0.5，說明建立的預測模型有效。30批藥材的OPLS-DA得分散點圖中發(fā)現(xiàn)S6、S8、S10、S22的點在二、三象限，其余各批次的點大部分都聚集在一、四象限中。不同產(chǎn)地的得分圖中，不同產(chǎn)地分別聚集在不同的象限中，均有明顯的區(qū)分。

圖5 OPLS-DA得分散點圖Fig 5 OPLS-DA’s dispersion plots

圖6 不同產(chǎn)地OPLS-DA得分散點圖Fig 6 Dispersion plots of OPLS-DA from different origins

3 討論

本試驗前期通過對甘草指紋圖譜相關(guān)文獻的考察，選取254 nm作為檢測波長[18]。分別考察了幾種不同的流動相體系（乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.05%磷酸水和甲醇-0.1%磷酸水），結(jié)果表明乙腈-0.1%磷酸水體系的基線更平穩(wěn)，重現(xiàn)性最好。分別考察了不同的提取方式（超聲、回流），提取溶媒（甲醇、乙醇、水），提取溶劑的濃度（30%和70%）、取樣量（0.20、2.00、4.00 g）和提取時間（20、30、40 min），通過對各色譜圖的對比，發(fā)現(xiàn)回流和超聲提取的峰形差別不大，但是超聲提取的方式更簡單方便，故選擇超聲提??；不同的提取溶媒中，水提取的有效成分較少，甲醇和乙醇提取的有效成分較多，色譜圖相差不大，故選擇乙醇作為提取溶媒；對不同取樣量進行考察，發(fā)現(xiàn)2.00 g和4.00 g的色譜圖差別不大，但明顯優(yōu)于0.20 g藥材的色譜圖，綜合考慮取樣量選擇2.00 g；在提取溶劑濃度的考察中，70%的濃度明顯優(yōu)于30%；在對提取時間的考察時，發(fā)現(xiàn)提取30 min后的色譜圖變化不大，但有效組分的含量明顯高于20 min。

本試驗采用HPLC梯度洗脫建立了甘草飲片的指紋圖譜，對30批次甘草飲片的HPLC指紋圖譜進行分析，得到13個共有峰，軟件分析其相似度均在0.9以上。通過聚類分析和主成分分析對比，發(fā)現(xiàn)30批次甘草飲片的HPLC指紋圖譜聚類分析垂直樹狀圖與OPLS-DA得分散點圖的分類結(jié)果一致，說明了此次創(chuàng)建的指紋圖譜方法可靠。不同產(chǎn)地的藥材分別聚集在不同的象限內(nèi)，有明顯的區(qū)別。對亳州市場的10批飲片的含量進行對比，發(fā)現(xiàn)差別較大，這也表明在同一市場中的藥材飲片的質(zhì)量參差不齊，品質(zhì)不一，對其進行質(zhì)量控制十分必要。