高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法對睡蓮花中4種成分的鑒定和含量測定

李潔，丁文歡，樊珍珍，張浩科，田樹革（. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 8300；. 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，烏魯木齊 8300；3. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 8300）

睡蓮花是睡蓮科植物雪白睡蓮Nymphaea candidaC. Presl的干燥花蕾，具有降熱止咳、止痛、益心安神等功效，臨床用于治療感冒發(fā)熱、頭痛咳嗽、心悸不安、咽痛或熱證引起的頭痛、熱感咳嗽及小兒急、慢驚風(fēng)等表癥[1]。其主要分布在我國新疆，也是多種抗病毒復(fù)方制劑中的主要的組方藥材[2]。藥理學(xué)研究表明睡蓮花具有抗氧化、抗菌、消炎、降血糖、保肝等作用[3]。睡蓮花主要含有鞣質(zhì)、黃酮類成分等成分，其中沒食子酸、沒食子酸甲酯、煙花苷、槲皮素等是發(fā)揮抗菌、保肝作用的主要成分[4-5]，因此，本實驗采用HPLC-UV-MS/MS對上述4種成分進行定性定量分析，以期獲得更準(zhǔn)確可靠的方法，為睡蓮花的質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)研究。

1 材料

1.1 儀器

KQ-200KDE型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS-105型電子天平（瑞士梅勒-托利多公司）；TGL-16B型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AK-1000A型搖擺式中藥粉碎機（溫嶺市奧利中藥機械有限公司）；HY-BⅡ型回旋振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；6310 ion trap 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國Agilent公司），包括Agilent 1200高效液相色譜儀，1100型紫外檢測器。

1.2 試藥

睡蓮花樣品于2012年8月—2013年2月分別從新奇康藥業(yè)股份有限公司、維藥制藥廠和維吾爾醫(yī)院等地收集，共6批，由新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥系徐海燕副教授鑒定為睡蓮花Nymphaea candidaC. Presl。沒食子酸對照品（純度：98%，批號：110831-2012054，中國食品藥品檢定研究院），沒食子酸甲酯對照品（純度：99%，批號：92366A，瑞士阿達(dá)姆斯試劑有限公司），槲皮素對照品（純度：98.5%，批號：20111013，上海源葉生物科技有限公司），煙花苷對照品（純度：97%）由新疆藥物研究所趙軍博士提供，色譜甲醇（飛世爾實驗器材有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 分別精密稱取適量沒食子酸、沒食子酸甲酯、煙花苷、槲皮素對照品分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.450 mg·mL－1沒食子酸、0.410 mg·mL－1沒食子酸甲酯、0.531 mg·mL－1煙花苷、0.340 mg·mL－1槲皮素的混合對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液 睡蓮花粉末過3號篩，精密稱定1 g，置具塞錐形瓶中，加入50 mL的甲醇溶液，稱定，超聲提取30 min（功率80 W，頻率100 Hz），放冷，再次稱重，用甲醇補足減失的重量，用0.45 μm微孔濾膜過濾后取濾液，備用。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

采用Agilent C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），0.2%冰 乙酸水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脫：95%→90% A（0～10 min），90%→75% A（10～20 min），75%→55% A（20～40 min），55%→15% A（40～50 min），15%→0% A（50～60 min）。流速1 mL·min－1，進樣量20 μL，柱溫30℃，檢測波長270 nm。

質(zhì)譜參數(shù)：負(fù)離子掃描模式（ESI－），毛細(xì)管電壓為3.5 kV，霧化氣（氮氣）壓力是30 psi，干燥氣溫度為350℃、流速為12 L·min－1，霧化氣、干燥氣均為氮氣。一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜掃描范圍均為m/z100～650，錐孔電壓范圍0.4～1 V。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 在“2.2”項色譜條件下，分別進樣對照品溶液及供試品溶液各20 μL，結(jié)果各組分峰形良好，無干擾峰，各峰之間的分離度均符合要求，見圖1。

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of mixture standards（A）and samples （B）

2.3.2 線性范圍考察 取“2.1.1”項下混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣。以對照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸計算，結(jié)果見表1。

表1 睡蓮花中4種化學(xué)成分的回歸方程Tab 1 Linear regression equation of the 4 components in Nymphaea candida C. Presl

2.3.3 精密度試驗 取“2.1.1”項下混合對照品溶液20 μL，按“2.2”項下色譜條件下連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果沒食子酸、沒食子酸甲酯、煙花苷和槲皮素的峰面積的RSD值分別2.1%、1.8%、1.5%、2.0%。表明該儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 稱取按“2.1”項下方法配制的供試品溶液6份，進樣測定。含量RSD值分別為沒食子酸1.3%、沒食子酸甲酯1.5%、煙花苷1.1%和槲皮素1.8%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.1”項下方法制備供試品，分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h進樣測定，結(jié)果沒食子酸、沒食子酸甲酯、煙花苷和槲皮素峰面積的RSD值分別為2.0%、1.4%、1.8%、1.3%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的供試品6份，分別加入已知含量的80%、100%、120%混合對照品適量混勻，在“2.2”項色譜條件下測定，結(jié)果沒食子酸、沒食子酸甲酯、煙花苷和槲皮素的平均加樣回收率分別為98.87%、100.34%、103.25%、101.56%，RSD分別為0.45%、0.68%、0.52%、1.4%。

2.4 睡蓮花中4種成分的鑒定

將4種化合物對照品分別進行質(zhì)譜分析，通過優(yōu)化質(zhì)譜條件，在全掃描一級、二級質(zhì)譜中，4種化合物對照品溶液的分子離子峰和碎片離子峰顯著，具體結(jié)果見表2及圖2。在相同色譜條件下，將混合對照品與供試品溶液進樣分析，如圖2所示，混合對照品溶液的色譜圖中，沒食子酸、沒食子酸甲酯、煙花苷和槲皮素保留時間分別為9.35、23.19、45.65和48.18 min，且供試品出現(xiàn)相同保留時間色譜峰，同時比較一級、二級質(zhì)譜，且對應(yīng)出相同分子離子峰和碎片離子峰，鑒定出睡蓮花中該4種化學(xué)成分。

圖2 睡蓮花中4種化學(xué)成分的一級、二級質(zhì)譜圖Fig 2 MS and MS/MS spectrogram of 4 components in Nymphaea candida C. Presl

表2 睡蓮花中4種化學(xué)成分的質(zhì)譜信息Tab 2 Mass data of 4 components in Nymphaea candida C. Presl

睡蓮花中沒食子酸、沒食子酸甲酯為簡單的酚酸類化合物，質(zhì)譜裂解行為較為簡單，主要為取代基羧基和羥基的丟失，沒食子酸的準(zhǔn)分子離子由m/z168.7脫去羧基（－44），得到m/z124.7的碎片離子（見圖3A）；沒食子酸甲酯（m/z182.7）則是先脫水（－18）得到?jīng)]食子酸的離子峰（m/z167.6），再脫去羧基（－44）得到m/z124.7的碎片離子（見圖3B）；煙花苷屬于黃酮苷類化合物，準(zhǔn)分子離子峰m/z593.3，通過脫去兩個葡萄糖，得到黃酮苷元（m/z284.7）（見圖3C）；槲皮素屬于黃酮醇類化合物，黃酮類化合物由于A，B苯環(huán)較穩(wěn)定性不易開裂，因此質(zhì)譜裂解主要發(fā)生C環(huán)的retro-Diels-Alder（RDA）裂解，以及包括丟失中性H2O，CO和CO2的過程。槲皮素的準(zhǔn)分子離子峰300.8發(fā)生RAD裂解，得到m/z178.6的碎片，繼續(xù)失去中性分子CO進一步裂解產(chǎn)生裂片離子m/z150.06，再丟失CO2產(chǎn)生m/z106.7的碎片（見圖3D）。

圖3 睡蓮花中沒食子酸（A）、沒食子酸甲酯（B）、煙花苷（C）和槲皮素（D）的質(zhì)譜裂解途徑Fig 3 Mass fragmentation patterns of gallic acid，methyl gallate，nicotiflorin and quercetin in Nymphaea candida C. Presl

2.5 樣品含量測定

按“2.1.2”項下方法制備各批次供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進行測定，4種成分含量見表3。6批不同批次的睡蓮花中，沒食子酸、沒食子酸甲酯、煙花苷、槲皮素的含量分別在8.00～15.61、1.10～3.26、20.24～28.31、1.83～2.40 μg·g－1。其中煙花苷與沒食子酸的含量較高，沒食子酸甲酯與槲皮素次之。

表3 樣品中4種化學(xué)成分的含量測定結(jié)果(μg·g－1，n＝3)Tab 3 Content of 4 components in Nymphaea candida C. Presl (μg·g－1，n＝3)

3 討論

睡蓮花具有清熱解毒，鎮(zhèn)靜安神的功效[6]，是多種復(fù)方、單方制劑的組方藥材，本研究建立了HPLC-UV-MS/MS法同時測定睡蓮花中4種成分。本文分別用水、70%乙醇、無水乙醇、70%甲醇、甲醇結(jié)合超聲提取法提取樣品，發(fā)現(xiàn)甲醇的提取率較高，因此選用甲醇作為提取溶劑。采用甲醇-水、甲醇-0.2%冰乙酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%冰乙酸水溶液進行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)各成分在甲醇-0.2%冰乙酸水溶液中響應(yīng)良好且有較好的色譜峰，故采用甲醇-0.2%冰乙酸水溶液作為流動相。

對被測成分的質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，這4種成分在負(fù)離子模式下的響應(yīng)遠(yuǎn)高于正離子模式，在負(fù)離子檢測模式下易產(chǎn)生加合離子峰，故確定選擇負(fù)離子模式下檢測4種主要成分。將豐度最大的子離子作為定量離子，保證了方法的專屬性和準(zhǔn)確性。

在質(zhì)量控制方面，HPLC-MS/MS[7-12]等現(xiàn)代分析技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，色譜的強分離性能與質(zhì)譜的強定性相結(jié)合，尤其在缺乏對照品的情況下，對色譜峰鑒定分析，有助于藥材的質(zhì)量控制[13-15]。由于睡蓮花存在基源不清、代用混用等問題，導(dǎo)致藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善，本實驗采用HPLC-UV-MS/MS法測定樣品中4種化學(xué)成分的含量，歸屬其主要的一級、二級質(zhì)譜特征，提供有力的鑒定證據(jù)，該方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確且重現(xiàn)性較好，可為其質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)，也可為研究睡蓮花及其制劑的體內(nèi)外代謝分析提供參考，從而促進新疆特色資源睡蓮花的開發(fā)利用。