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    廣藿香醇在體外對(duì)人肝微粒體中CYP3A4的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用研究

    2021-11-01 05:33:34武夢(mèng)琳秦崇臻柴玉娜盧瑤瑤汪新茹張晶敏齊光照鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部鄭州450052
    中南藥學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:微粒體咪達(dá)唑侖孵育

    武夢(mèng)琳,秦崇臻,柴玉娜,盧瑤瑤,汪新茹,張晶敏,齊光照(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,鄭州450052)

    細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYPs)是最重要的藥物代謝酶,在外源性藥物的解毒和內(nèi)源性分子的生物合成中發(fā)揮著重要作用[1-2]。CYP3A4在藥物代謝酶中占舉足輕重的地位,超過60%的臨床藥物通過此酶代謝,并且其與許多藥物間的相互作用有關(guān),因此藥物對(duì)于CYP3A4的抑制作用會(huì)導(dǎo)致藥物合用時(shí)出現(xiàn)毒副作用[3-4]。

    已有許多關(guān)于中藥對(duì)CYPs抑制作用的研究,如三白草酮對(duì)CYP2C19的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[5],芹菜素對(duì)CYP2C9的抑制作用[6],丹參提取物對(duì)CYP450的抑制作用[7-8]等。

    廣藿香是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材,主要用于防治瘟疫、流行性感冒、腹痛等疾病,以廣藿香為主要成分的中成藥制劑也日益增多[9]。作為廣藿香揮發(fā)油的主要成分之一,廣藿香醇(patchouli alcohol,PA),又稱百秋李醇,是天然植物中提取的三環(huán)倍半萜化合物[10],具有抗病毒、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗真菌以及胃腸調(diào)節(jié)等活性[11-13]。目前在臨床上,廣藿香醇也是多種中成藥的重要組分,如藿香正氣顆粒、小兒感冒顆粒以及小兒廣樸止瀉口服液等。其中廣藿香醇作為小兒感冒顆粒的有效成分之一,可以發(fā)汗解表,用于治療小兒外感風(fēng)熱[14];作為小兒廣樸止瀉口服液的主要成分之一,可以化濕健胃,對(duì)腹痛、腹瀉以及腹脹的治療有著較好的臨床效果[15]。在國(guó)家食品安全中,廣藿香醇因氣味宜人,也常作為食品添加劑和香精香料[16]。因此,應(yīng)當(dāng)特別注意廣藿香醇與其他藥物聯(lián)用時(shí)可能引起的藥物相互作用。

    目前關(guān)于廣藿香醇的研究側(cè)重于含量測(cè)定、化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定以及基礎(chǔ)藥理學(xué)方面[10,17-18],而在藥物相互作用機(jī)制中的影響,以及藥物聯(lián)用時(shí)對(duì)CYPs是否有影響尚未有相關(guān)報(bào)道。為評(píng)估廣藿香醇的用藥安全,本文通過Cocktail法以探針底物為檢測(cè)體系,探討廣藿香醇在人肝微粒體和重組酶中的作用以及酶促動(dòng)力學(xué)的影響,旨在為臨床提供安全合理的聯(lián)合用藥依據(jù)。

    1 材料

    1.1 儀器

    美國(guó)Waters公司MS/MS系統(tǒng):API型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀,帶電噴霧離子化源(ESI)及數(shù)據(jù)采集Masslynx軟件;Waters 2695型超高效液相色譜儀帶自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱;Luna C18(150 mm×2.0 mm,5 μm)色譜柱。

    1.2 試藥

    香豆素(批號(hào):01260595)、7-羥基香豆素(批號(hào):54826)、甲苯磺丁脲(批號(hào):T0891)、4-羥基甲苯磺丁脲(批號(hào):UC160)、(S)-美芬妥英(批號(hào):UC175)、4'-羥基美芬妥英(批號(hào):H146)、美托洛爾(批號(hào):80337)、α-羥基美托洛爾(批號(hào):80073)、咪達(dá)唑侖(批號(hào):M-908)、1-羥基咪達(dá)唑侖(批號(hào):H-922)、曲馬多(批號(hào):1672600)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)、輔酶Ⅱ(β-NADP)(Sigma公司)。廣藿香醇(天津萬(wàn)象恒遠(yuǎn)科技有限公司,批號(hào):WXHY-001994,HPLC測(cè)純度>98%)。甲醇、甲酸、乙腈、叔丁基甲基醚和甲酸銨(廣州迪馬公司,色譜純);實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水;其余試劑為分析純。人肝微粒體和人重組酶(BD基因公司)。

    2 方法

    2.1 微粒體孵育條件

    100 mmol·L-1K2HPO4-KH2PO4(pH=7.4)的緩沖溶液反應(yīng)體系(總體積為200 μL)中加入肝微粒體(終質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1)或重組酶(終質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1)、3.3 mmol·L-1的MgCl2、1.3 mmol·L-1的β-NADP、3.3 mmol·L-1的G-6-P和對(duì)應(yīng)的藥物,37℃搖動(dòng)水浴中預(yù)孵化5 min,加入0.4 U·mL-1的G-6-PDH(20 μL),37℃水浴20 min之后用含1.13 μmol·L-1曲馬多(內(nèi)標(biāo))的100 μL甲醇終止反應(yīng)。加入1 mL叔丁基甲基醚,震蕩5 min,3500×g離心10 min。分離出800 μL有機(jī)層用氮?dú)獯蹈桑?00 μL流動(dòng)相溶解之后進(jìn)樣10 μL到質(zhì)譜系統(tǒng)。

    2.2 色譜、質(zhì)譜條件

    采用課題組以前建立并驗(yàn)證的方法[19]。流動(dòng)相為10 mmol·L-1乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈(13∶87,V/V),流速為0.25 mL·min-1,總時(shí)間為5 min。離子源溫度和去溶劑溫度分別為100℃和400℃。錐孔氣和脫溶劑氣分別設(shè)定為50 L·h-1和400 L·h-1。ESI源,MRM掃 描,正離子模式監(jiān)測(cè)。

    2.3 廣藿香醇對(duì)肝微粒體酶抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

    2.3.1 廣藿香醇對(duì)CYP450的抑制作用 加入濃度分別為0、0.1、1和10 μmol·L-1廣藿香醇,孵育體系下測(cè)定每個(gè)CYP450對(duì)應(yīng)的特異性底物的代謝物濃度。每個(gè)樣品平行做3份。

    加入濃度分別為0.01、0.1、1、10和100 μmol·L-1廣藿香醇,孵育體系下測(cè)定CYP3A4酶活性,將所得數(shù)據(jù)以抑制劑濃度的log值(μmol·L-1)作為橫坐標(biāo),剩余活性率(%)作為縱坐標(biāo)作圖。采用Graphpad Prism 5.0(San Diego,CA,USA)軟件計(jì)算廣藿香醇的IC50。

    2.3.2 廣藿香醇在人肝微粒體中對(duì)CYP3A4的抑制模型 為了驗(yàn)證廣藿香醇的抑制類型,將廣藿香醇(0、5、10 μmol·L-1)在加入NADPH的人肝微粒體中預(yù)孵育0、10或30 min,然后加入CYP3A4特異性底物咪達(dá)唑侖(5、10或20 μmol·L-1),37℃孵育30 min。每個(gè)樣品平行做3份。所得數(shù)據(jù)采用SigmaPlot軟件(版本10.0,Systat software,Inc.:Chicago,IL,USA) 做Lineweaver-Burk圖和二次作圖。

    2.3.3 CYP3A4重組酶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證廣藿香醇選擇性抑制CYP3A4,將廣藿香醇(0.01、0.1、1、10和100 μmol·L-1)、咪達(dá)唑侖和NADPH系統(tǒng)在10 pmol人重組CYP3A4酶中37℃孵育30 min。每個(gè)樣品平行做3份。所得數(shù)據(jù)以抑制劑濃度的log值(μmol·L-1)作為橫坐標(biāo),剩余活性率(%)作為縱坐標(biāo)作圖,采用Graphpad Prism 5.0(San Diego,CA,USA)軟件計(jì)算廣藿香醇的IC50。

    2.4 統(tǒng)計(jì)分析

    計(jì)算人肝微粒體中不同濃度廣藿香醇對(duì)酶活性的影響,每個(gè)樣品平行3份,數(shù)據(jù)表示為平均值±SD,采用方差分析,P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 5.0(San Diego,CA,USA)通過非線性回歸計(jì)算50%抑制濃度(IC50)值。Lineweaver-Burk圖采用SigmaPlot軟件(版本10.0,Systat software,Inc.:Chicago,IL,USA)制作。

    3 結(jié)果

    3.1 廣藿香醇對(duì)人肝微粒體中CYP450酶的抑制作用

    加入不同濃度廣藿香醇(0、0.1、1和10 μmol·L-1)后對(duì)酶底物代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定,分析剩余活性,結(jié)果見圖1A。由圖可知廣藿香醇對(duì)人肝微粒體CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6并無明顯的抑制作用,且與濃度無關(guān)。而在圖1B中,隨著廣藿香醇濃度升高,肝微粒體CYP3A4 活性明顯下降,其IC50值為5.195 μmol·L-1。提示當(dāng)藥物經(jīng)由CYP3A4代謝時(shí),廣藿香醇可能對(duì)其會(huì)有抑制作用。

    圖1 人肝微粒體中不同濃度廣藿香醇對(duì)CYP2A6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6酶(A)和CYP3A4酶(B)活性的影響Fig 1 Effect of different concentrations of PA on the enzyme activities of CYP2A6,CYP2C9,CYP2C19 and CYP2D6(A),and CYP3A4(B)in human liver microsomes

    3.2 廣藿香醇對(duì)CYP3A4的抑制特點(diǎn)

    從圖2可以看出,不同濃度的廣藿香醇對(duì)CYP3A4抑制作用不同,隨著廣藿香醇濃度的增加,CYP3A4活性降低;而不同時(shí)間段的廣藿香醇對(duì)CYP3A4抑制作用沒有明顯的差異。因此廣藿香醇呈現(xiàn)濃度依賴性地抑制肝微粒體中CYP3A4催化的咪達(dá)唑侖羥基化,但不具有時(shí)間依賴性。

    圖2 廣藿香醇對(duì)CYP3A4酶的抑制特點(diǎn)Fig 2 Inhibition characteristics of PA on CYP3A4 enzyme

    3.3 廣藿香醇對(duì)CYP3A4的抑制作用類型分析

    以底物濃度1/[S]作為橫坐標(biāo),反應(yīng)速度1/[V]作為縱坐標(biāo),按 Lineweaver-Burk 法作圖,確定提取物的抑制類型,結(jié)果見圖3A。以廣藿香醇濃度作為橫坐標(biāo),Lineweaver-Burk圖中幾條直線的斜率作為縱坐標(biāo),作圖得圖3B,據(jù)此可以得到廣藿香醇抑制常數(shù)(Ki)。

    從圖3A中可以看出,不同濃度廣藿香醇共同孵育之后所得的曲線有一個(gè)共同交點(diǎn)并且落在橫坐標(biāo)軸上,說明廣藿香醇對(duì)于CYP3A4抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。從圖3B中可以計(jì)算得到廣藿香醇抑制常數(shù)Ki為0.86 μmol·L-1。

    圖3 廣藿香醇對(duì)CYP3A4酶代謝的動(dòng)力學(xué)直線回歸方程Fig 3 Kinetic linear regression equation of PA for CYP3A4 enzyme metabolism

    3.4 廣藿香醇對(duì)CYP3A4重組酶的抑制作用

    采用10 pmol人重組CYP3A4與廣藿香醇共同孵育,驗(yàn)證廣藿香醇對(duì)于CYP3A4選擇性抑制作用,結(jié)果見圖4,發(fā)現(xiàn)廣藿香醇可以顯著抑制CYP3A4活性,其IC50值為5.625 μmol·L-1,廣藿香醇對(duì)CYP3A4具有選擇性抑制作用,這與在人肝微粒體中實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

    圖4 人重組CYP3A4酶中廣藿香醇(0.01、0.1、1、10及100 μmol·L-1)對(duì)咪達(dá)唑侖代謝的影響Fig 4 Effect of PA(0.01,0.1,1,10 and 100 μmol·L-1) on midazolam metabolism in recombinant human CYP3A4 enzyme

    4 討論

    聯(lián)合用藥在患者治療過程中非常普遍,但是聯(lián)合用藥過程中存在藥物相互作用的可能性。藥物相互作用一般由CYPs酶代謝引起,從而導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)[20-21]。目前,有關(guān)藥物相互作用的報(bào)道越來越多,因此研究藥物對(duì)CYPs的抑制作用可以預(yù)測(cè)可能發(fā)生的藥物相互作用,從而避免或減少聯(lián)合用藥時(shí)的嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。廣藿香醇具有抗炎、抗氧化、抑菌、抑制病毒、抗克氏錐蟲、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理活性[9-13,17]。其在臨床使用的過程中,可能會(huì)與經(jīng) CYP3A4代謝消除的藥物聯(lián)合使用,從而影響藥物的有效性和安全性。常見含廣藿香醇的藥物如藿香正氣水,應(yīng)當(dāng)特別注意與其他藥物聯(lián)用時(shí)可能引起的藥物相互作用。本研究利用經(jīng)典的肝微粒體體外孵育模型,探討廣藿香醇對(duì)CYP3A4的影響及作用機(jī)制。

    本研究首次檢測(cè)了廣藿香醇對(duì)CYPs 的抑制作用、抑制類型以及機(jī)制模型,發(fā)現(xiàn)廣藿香醇對(duì)CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6活性沒有明顯的抑制作用,對(duì)CYP3A4活性的抑制作用呈濃度依賴性,但不具有時(shí)間依賴性。在廣藿香醇對(duì)CYP3A4的抑制作用類型分析中,得到了Ki值為0.86 μmol·L-1,可以判斷藥物抑制作用的類型主要是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。隨后采用體外人肝微粒體孵育和重組酶驗(yàn)證作為主要的實(shí)驗(yàn)方法,通過CYP3A4重組酶驗(yàn)證了這一結(jié)果。因此,當(dāng)聯(lián)用藥物經(jīng)由CYP3A4代謝時(shí),可能會(huì)由于廣藿香醇的抑制作用,該藥不能被及時(shí)代謝,而導(dǎo)致藥物的血藥濃度升高,造成蓄積中毒等情況。這為預(yù)測(cè)藥物和藥物之間的相互作用以及臨床上應(yīng)用含廣藿香醇成分的藥物的安全性提供了參考,但其在臨床使用中的真實(shí)情況,尚需動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。

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