舒更葡糖鈉分離純化工藝的研究

沈保濤，劉金明，成祥旭，張永振，張貴民（山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，國家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 273400）

舒更葡糖鈉（sugammadex sodium）是一種新型的選擇性肌松藥拮抗劑（結(jié)構(gòu)式見圖1），能選擇性結(jié)合氨基載體類肌松藥并終止其肌肉松弛效應(yīng)。該藥物是一種修飾的γ-環(huán)糊精，由8個(gè)毗鄰的葡萄糖分子構(gòu)成環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)，具有親脂性內(nèi)腔，具有最佳的容納氨基載體分子，8個(gè)帶負(fù)電荷親水的羧基側(cè)鏈從環(huán)糊精分子邊緣向外投射，側(cè)鏈上的酸性功能基（COO-）增加了舒更葡糖鈉內(nèi)腔的親脂性并能與羅庫溴銨帶正電荷的氮原子形成靜電鍵[1-5]。同時(shí)，這些基團(tuán)彼此排斥，因而保證了環(huán)糊精分子內(nèi)腔的開放，一旦羅庫溴銨的甾體核進(jìn)入舒更葡糖鈉內(nèi)腔，帶負(fù)電荷的羧基鍵緊緊地與羅庫溴銨帶正電荷的季銨分子結(jié)合。靜脈注射舒更葡糖鈉，其與血漿中游離的羅庫溴銨結(jié)合后，減少血漿中游離藥物濃度，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭處羅庫溴銨返回血漿，并進(jìn)一步與舒更葡糖鈉結(jié)合，使羅庫溴銨從效應(yīng)室快速轉(zhuǎn)移至中央室，從而使神經(jīng)肌肉阻滯迅速逆轉(zhuǎn)[6]。舒更葡糖鈉作為一種新的肌松拮抗劑，固價(jià)格昂貴，目前在國內(nèi)還沒有普遍使用，但該藥能快速、充分逆轉(zhuǎn)肌松作用，降低術(shù)后肌松殘余的發(fā)生率，能用于肝腎功能不全的患者，改善患者預(yù)后，使用時(shí)要警惕過敏反應(yīng)和心血管不良事件的發(fā)生[7]。

圖1 舒更葡糖鈉結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of sugammadex sodium

專利CN201610896608報(bào)道了一種舒更葡糖鈉純化方法，該方法主要采用離子交換樹脂純化，純化后的舒更葡糖鈉水溶液在乙醇中將產(chǎn)品析出[8]。但是該方法舒更葡糖鈉會富集乙醇中的雜質(zhì)，增加氣相雜質(zhì)的含量，不能保證終產(chǎn)品的純度。專利CN109517093A報(bào)道了一種通過制備色譜柱和冷凍干燥獲得最終純品的方法[9]，雖然該方法的純度和收率都較高，但是經(jīng)冷凍干燥處理后的舒更葡糖鈉粉末的水分含量高達(dá)8.659%，尤其在溫濕度較高的環(huán)境時(shí)水分含量更難控制，夏季濕度較高時(shí)水分很容易超過10%，而且乙腈溶劑殘留達(dá)到0.7303%，超過了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的限度要求。該文中對比例3采用公斤級噴霧干燥機(jī)MODEL SCL-12對溶液進(jìn)行開放式空氣噴霧干燥，得到舒更葡糖鈉粉末純度最高，能達(dá)到99.8%，但是該工藝在噴霧干燥后為了進(jìn)一步控制水分含量還需要在50～80℃條件下進(jìn)行真空干燥[10]。筆者通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧氣含量在0.1%以下進(jìn)行噴霧干燥時(shí)，得到舒更葡糖鈉粉末質(zhì)量會更穩(wěn)定，可在進(jìn)行噴霧干燥前先用高純氮?dú)庵脫Q噴霧干燥系統(tǒng)中空氣使其氧氣含量低于0.1%，這樣既能減少系統(tǒng)中由空氣中引入的水分也能防止氧氣對舒更葡糖鈉的氧化，純度＞99.9%且水分＜5.0%[10]。專利CN110627926A報(bào)道了多達(dá)21種舒更葡糖鈉有關(guān)物質(zhì)，有些是在空氣中被氧化產(chǎn)生的非對映異構(gòu)體雜質(zhì)，有些是舒更葡糖鈉在光照條件下產(chǎn)生的光降解雜質(zhì)等，不僅如此，舒更葡糖鈉特殊的中空錐形圓桶型結(jié)構(gòu)及較強(qiáng)的水溶性特點(diǎn)，使其在生產(chǎn)過程中很容易包裹無機(jī)鹽及小分子有機(jī)物等雜質(zhì)，這給后續(xù)的精制純化工藝帶來非常大的難度[11]。本工藝在控制舒更葡糖鈉的有關(guān)物質(zhì)的同時(shí)，也能控制水分和溶劑殘留，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent，1260 HPLC）；動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)（北京創(chuàng)新通恒，LC6000型）；真空冷凍干燥機(jī)（LABCONCO）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI，R-220 pro）；B-295SE型噴霧干燥儀（BUCHI）；卡爾費(fèi)休水分檢測儀（METTLERTOEDO V30）；氣相色譜儀（SHIMADZU，GC 2010 plus）。

1.2 試藥

磷酸二氫鈉（分析純，默克股份兩合公司），磷酸、甲酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），純度檢測用乙腈（色譜級，默克股份兩合公司），制備用乙腈（制備級，濰坊中匯化工有限公司），制備用水為純化水，分析用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測方法

2.1.1 有關(guān)物質(zhì)檢測方法 色譜柱：Phenomenex Aqua C18（2.0 mm×150 mm，3 μm，125 ?）；檢測波長：200 nm；柱溫：40℃；流速：0.27 mL·min－1；流動相A：0.025 mol·L－1磷酸二氫鈉水溶液（pH＝3.0）∶乙腈＝830∶205；流動相B：乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.1.2 含水量檢測方法 取舒更葡糖鈉粉末50 mg，溶解于甲醇和甲酰胺的混合溶液中（體積比1∶1），使用卡爾費(fèi)休水分檢測儀進(jìn)行檢測。

2.1.3 殘留溶劑檢測方法 色譜柱：6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細(xì)管柱DB-624（0.32 mm×30 mm，1.8 μm）；載氣：高純氮?dú)?；升溫程序?0℃，維持6 min，以20℃·min－1的速率升溫至180℃，維持4 min；檢測器：220℃；頂空平衡溫度80℃；維持30 min；分流比：10∶1；傳輸線：150℃；定量環(huán)：160℃；流速：2.0 mL·min－1。稱取待測舒更葡糖鈉粉末100 mg，溶解于2 mL水中作為待測樣，按上述方法進(jìn)行測定。

2.2 舒更葡糖鈉粗品的合成

以γ-環(huán)糊精為起始原料，在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中與溴和三苯基膦發(fā)生溴代反應(yīng)，γ-環(huán)糊精中葡萄糖6位的羥基被替換為溴基得到中間體溴代-γ-環(huán)糊精，再與3-巰基丙酸和氫氧化鈉發(fā)生硫醚化反應(yīng)，溴代-γ-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化為6-丙酸鈉-γ-環(huán)糊精，即舒更葡糖鈉[12]。本試驗(yàn)使用的舒更葡糖鈉粗品（批號：200301B-1）是由公司彭祥龍博士等[13]合成的，純度為69.79%，見圖2。

圖2 舒更葡糖鈉粗品純度檢測譜圖Fig 2 Purity detection spectrum of sugammadex sodium crude product

2.3 舒更葡糖鈉的制備

2.3.1 制備柱裝填 取干燥的Sepax HP C1810μm 120 ?填料300 g置于燒杯中，緩慢加入異丙醇并同向攪拌，保持總體積約800 mL，超聲30 min后將勻漿液倒入DAC-50 mm柱中，通過調(diào)節(jié)氣閥大小，使氣壓保持10 MPa裝柱[14]。

2.3.2 一次制備 稱取舒更葡糖鈉粗品15 g加入1.2 L純化水溶解再加入乙酸調(diào)pH 2.6后，加入約200 mL乙腈使其完全溶解，通過DAC-50 mm高壓制備色譜系統(tǒng)進(jìn)行一次制備純化。具體方法如下：

填料：Sepax HP C1810 μm 120 ?；儀器：動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)；波長：200 nm；流速：60 mL·min－1；進(jìn)樣量：200 mL；流動相A：0.15%的甲酸水溶液，B：0.15%的甲酸乙腈混合液，梯度洗脫，程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program

重復(fù)多次進(jìn)樣收集接出液，收集24.4 min峰吸收值1100～1000 AU的洗脫液，檢測接出液純度為97.62%，一次制備接出圖譜見圖3A，一次制備接出液純度檢測結(jié)果見圖3B。

圖3 舒更葡糖鈉一次制備（A）及純度檢測（B）色譜圖Fig 3 First preparation（A）and purity detection（B）chromatogram of sugammadex sodium

2.3.3 二次制備 將一次制備接出液加入1.5倍的純化水稀釋后經(jīng)DAC-50 mm高壓制備色譜系統(tǒng)進(jìn)行二次制備，具體方法如下：

填料：Sepax HP C1810 μm 120 ?；儀器：動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)；波長：200 nm；流速：60 mL·min－1；進(jìn)樣量：2.5 L；流動相A：純水，B：乙腈，梯度洗脫，程序見表3。

表3 梯度洗脫程序Tab 3 Gradient elution program

重復(fù)多次進(jìn)樣收集接出液，收集22 min峰吸收值300～200 AU的洗脫液即二次制備接出液，檢測純度為99.93%，二次制備色譜圖見圖4A，二次制備接出液純度檢測圖見圖4B。

圖4 舒更葡糖鈉二次制備（A）及純度檢測（B）色譜圖Fig 4 Second preparation（A）and purity detection（B）chromatogram of sugammadex sodium

2.4 樣品后處理

待冷阱降溫到－20℃后，打開旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴鍋，溫度設(shè)25℃，將二次制備接出液倒入旋蒸瓶中，打開真空泵，濃縮二次制備接出液至1.2 L，先放入冰箱內(nèi)預(yù)冷后再緩慢加入預(yù)凍好的0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液，在冰浴條件下攪拌調(diào)至pH 7.5左右，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，收集濾液，分成3份，每份約400 mL，待用。

2.4.1 冷凍干燥處理及檢測結(jié)果 取合格的舒更葡糖鈉濃縮液400 mL放入凍干盤中，打開真空冷凍干燥機(jī)待冷阱降溫到－50℃后在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下把樣品放入凍干倉內(nèi)，放入樣品盤前需用氮?dú)鈴氐字脫Q凍干機(jī)內(nèi)空氣。關(guān)閉進(jìn)氣閥，排水閥。運(yùn)行凍干程序，樣品經(jīng)過升華、解析過程后形成舒更葡糖鈉粉末。冷凍干燥參數(shù)見表4。

表4 冷凍干燥參數(shù)Tab 4 Freeze drying parameters

取樣前先關(guān)閉真空泵用氮?dú)饨?jīng)進(jìn)氣閥緩慢回填至常壓后，關(guān)閉冷阱壓縮機(jī)，收集舒更葡糖鈉粉末，收率87.8%，純度檢測為98.13%，水分檢測8.66%，乙腈殘留0.7303%，純度檢測圖譜見圖5。

圖5 舒更葡糖鈉檢測譜圖Fig 5 Detection spectrum of sugammadex sodium

2.4.2 析晶干燥處理及檢測結(jié)果 取合格的舒更葡糖鈉濃縮液400 mL，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下加入700 mL甲醇中，有白色固體析出，過濾；將所得固體溶解于300 mL純化水中，加入活性炭，加熱至50℃攪拌1 h，趁熱過濾得濾液，將濾液滴加入700 mL冷甲醇中，然后繼續(xù)攪拌1 h析晶，過濾得濾餅；然后再次將濾餅溶解于300 mL純化水中，加入活性炭，加熱至50℃攪拌1 h，趁熱過濾得濾液，將濾液滴加入700 mL冷甲醇中，然后繼續(xù)攪拌1 h析晶，過濾得濾餅，將濾餅于50℃減壓干燥得舒更葡糖鈉粉末，收率86.5%，純度檢測為98.92%，水分檢測10.22%，甲醇?xì)埩?.38%，純度檢測圖譜見圖6。

圖6 舒更葡糖鈉檢測譜圖Fig 6 Detection spectrum of sugammadex sodium

2.4.3 噴霧干燥處理及檢測結(jié)果 取合格的舒更葡糖鈉濃縮液400 mL，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，通高純氮?dú)?～8 bar置換B-295SE噴霧干燥儀中的空氣30 min，置Oxygen Analyser 檢測氧氣濃度低于0.1%；設(shè)定進(jìn)口溫度為150～160℃；設(shè)定抽氣機(jī)的抽氣速度為25 m3·h－1；設(shè)置噴霧流量計(jì)的流量為473 L·h－1；設(shè)置進(jìn)樣泵流速為3 mL·min－1；然后通過進(jìn)樣泵將舒更葡糖鈉濾液輸送至噴霧干燥儀，干燥結(jié)束，待入口溫度降到90℃以下時(shí)從產(chǎn)品收集容器中收集舒更葡糖鈉粉末，收率89.8%，純度檢測為99.94%，水分檢測4.95%，乙腈殘留0.0004%，純度檢測圖譜見圖7。

圖7 舒更葡糖鈉檢測譜圖Fig 7 Detection spectrum of sugammadex sodium

3 討論

現(xiàn)有方法制備出的舒更葡糖鈉粉末可能會產(chǎn)生溶劑殘留超標(biāo)、水分含量高、粉末性狀不均一以及原料藥在水中溶解性差等問題，本工藝提供了一種操作簡單、條件溫和、產(chǎn)品收率高、純度高、性狀均一、有機(jī)溶劑殘留低、水分含量低、溶解性更好的舒更葡糖鈉分離純化工藝。

本工藝所使用的高壓制備方法具有出峰快，穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。噴霧干燥法是一種新型處理方法，試驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過噴霧干燥處理后的舒更葡糖鈉能夠控制其有關(guān)物質(zhì)、水分和溶劑殘留，且粉末性狀和均一性更好，純度能達(dá)到99.9%。通過該工藝可以有效避免析晶干燥過程中大量溶劑的使用，減少固體析出過程中的降解，相比真空冷凍干燥更能有效降低固體舒更葡糖鈉純品中水分含量和有機(jī)溶劑殘留，值得推廣使用。