新型冠狀病毒滅活操作對(duì)利奈唑胺血藥濃度的影響及一致性評(píng)價(jià)

唐原君，尹悅勤，陳明，汪碩聞*，范國(guó)榮（. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院 臨床藥學(xué)科，上海00080；. 上海健康醫(yī)學(xué)院，上海 038）

新型冠狀病毒肺炎（簡(jiǎn)稱新冠肺炎，COVID-19）為新發(fā)急性呼吸道傳染病，目前已成為全球性重大的公共衛(wèi)生事件[1]。根據(jù)病例的回顧性研究，部分重癥患者往往存在合并細(xì)菌、真菌感染的情況[2-3]，必須聯(lián)合使用抗菌藥物和抗真菌藥物進(jìn)行治療。利奈唑胺是新一代全合成的噁唑烷酮類抗菌藥物，臨床用于治療革蘭氏陽(yáng)性球菌所致的感染，對(duì)葡萄球菌屬、肺炎鏈球菌屬、腸球菌屬細(xì)菌都具有高度的抗菌活性[4]。然而其在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征卻存在較大的個(gè)體差異，腎功能、合并用藥、年齡、體重等因素均可影響利奈唑胺的血藥濃度，為避免或減少其不良反應(yīng)，提高藥物療效，開(kāi)展治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM），實(shí)施科學(xué)個(gè)體化給藥將發(fā)揮重要作用[5]。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎患者血藥濃度檢測(cè)技術(shù)指引》中的相關(guān)要求，針對(duì)新冠肺炎患者的外周靜脈血標(biāo)本，需要按規(guī)定嚴(yán)格做好防護(hù)[6]。TDM項(xiàng)目送檢樣本屬于未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料，其操作應(yīng)當(dāng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，同時(shí)采用生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)。

鑒于目前國(guó)內(nèi)許多開(kāi)展TDM的實(shí)驗(yàn)室均不符合生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)要求，且在防護(hù)物資緊張的情況下也無(wú)法滿足生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)的要求。在保證監(jiān)測(cè)方法準(zhǔn)確性和可靠性的基礎(chǔ)上，能否通過(guò)病毒滅活的操作方法對(duì)臨床獲取標(biāo)本進(jìn)行處理，成為后疫情時(shí)代下TDM從業(yè)者亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。根據(jù)指南推薦的對(duì)于生物標(biāo)本的病毒滅活方法可采取濕熱法和紫外消毒法，已有報(bào)道對(duì)萬(wàn)古霉素和伏立康唑的臨床生物標(biāo)本經(jīng)新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）滅活處理后的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察[7-8]。本研究考察了新型冠狀病毒不同滅活方式對(duì)利奈唑胺血藥濃度的影響，以此填補(bǔ)病毒滅活操作對(duì)TDM樣本穩(wěn)定性影響的空白，為開(kāi)展其他相關(guān)TDM的醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供參考借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo UltiMate_3000超高效液相色譜儀（美 國(guó)Thermo Fisher），包 括LPG-3x00色 譜泵，WPS-3000自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC-3x00柱溫箱，VWD-3x00檢測(cè)器，采用Chromeleon 6.80工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。HY-5渦旋混合器（美國(guó)SI公司）；Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；AL104-01電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）；SK7200H超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Hi-Tech水純化系統(tǒng)（18.2M，上海和泰儀器有限公司）。

1.2 試藥

利奈唑胺對(duì)照品（純度：98%，批號(hào)：M0801AS）、苯妥英鈉對(duì)照品（純度：99%，批號(hào)：J0727AS）（大連美侖試劑有限公司），磷酸二氫鉀（批號(hào)：20190725，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），異丙醇（批號(hào)：K49790140802）、甲醇（批號(hào)：1036307929）（德國(guó)Merck Millipore公司），甲基叔丁基醚（批號(hào)：17080261，美國(guó)Tedia公司），水為Hi-Tech水純化系統(tǒng)自制的去離子水（18.2 MΩ）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參考文獻(xiàn)，采用超高效液相色譜法測(cè)定利奈唑胺的濃度[9]。以苯妥英鈉為內(nèi)標(biāo)，色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫：30℃，流動(dòng)相：甲醇-水＝55∶45（V/V），等度洗脫，流速：0.3 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，進(jìn)樣量20 μL，分析時(shí)間3 min。典型色譜圖見(jiàn)圖1，利奈唑胺的保留時(shí)間為1.473 min。質(zhì)控血漿樣品和臨床樣本根據(jù)測(cè)定當(dāng)日的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

圖1 人血漿中利奈唑胺高效液相色譜圖Fig 1 Typical chromatogram of linezolid and phenytoin sodium in human plasma

2.2 溶液配制

精密稱取利奈唑胺對(duì)照品10.51 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，即得利奈唑胺質(zhì)量濃度為1.051 mg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱保存。

精密稱取苯妥英鈉對(duì)照品10.02 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，即得苯妥因鈉質(zhì)量濃度為1.02 mg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇溶液逐級(jí)稀釋成1.02 μg·mL－1的對(duì)照品工作液，置于4℃冰箱保存。

2.3 新冠病毒滅活方法

①濕熱滅活法：在56℃水浴加熱30 min；②紫外滅活法：在紫外燈下照射60 min。

2.4 血漿樣品前處理

取人血漿樣品200 μL置于1.5 mL離心管中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)（苯妥因鈉1.02 μg·mL－1），渦旋混勻，再加入1 mL提取溶劑（叔甲醚-異丙醇＝90∶10，V/V），渦旋振蕩5 min，于13 000 r·min－1離心10 min。取上清液800 μL，于氮?dú)庀麓蹈?，?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，于13 000 r·min－1離心5 min，取上清液80 μL置于進(jìn)樣器中自動(dòng)進(jìn)樣20 μL測(cè)定。

2.5 新冠病毒滅活操作對(duì)利奈唑胺樣品穩(wěn)定性考察

2.5.1 新冠病毒滅活方法對(duì)利奈唑胺對(duì)照品溶液濃度的影響 取利奈唑胺對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為2.63、5.26、10.51 μg·mL－1的利奈唑胺質(zhì)控對(duì)照品溶液，分別采用濕熱滅活法和紫外滅活法對(duì)利奈唑胺質(zhì)控對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。結(jié)果如表1所示，采用紫外滅活法，利奈唑胺的實(shí)測(cè)濃度僅為標(biāo)示值的59.23%、16.75%、3.51%，且隨著濃度的增高，利奈唑胺降解越多。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版“原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則（9001）”中關(guān)于制劑質(zhì)量的定義，本研究中將對(duì)照品準(zhǔn)確度范圍定義為標(biāo)示值的95%～105%。若超過(guò)此范圍，則認(rèn)為該化合物在該新冠病毒滅活操作條件下不穩(wěn)定，不予考慮進(jìn)行后續(xù)的生物樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，采用濕熱法滅活操作未對(duì)利奈唑胺對(duì)照品溶液產(chǎn)生影響，采用紫外法滅活操作后利奈唑胺對(duì)照品溶液不穩(wěn)定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇濕熱滅活法進(jìn)行操作。

表1 新冠病毒滅活法對(duì)利奈唑胺質(zhì)控對(duì)照品溶液濃度影響考察(n＝6)Tab 1 Effect of SARS-CoV-2 virus inactivation on the concentration of linezolid quality control reference solution (n＝6)

2.5.2 濕熱滅活法對(duì)利奈唑胺質(zhì)控血漿樣品濃度的影響 取利奈唑胺對(duì)照品儲(chǔ)備液，用空白血漿配制成質(zhì)量濃度為2.63、5.26、10.51 μg·mL－1的利奈唑胺質(zhì)控血漿樣品，采用濕熱滅活法進(jìn)行利奈唑胺質(zhì)控血漿樣品穩(wěn)定性考察。未滅活樣品和濕熱滅活法操作后的樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，結(jié)果見(jiàn)表2。采用血漿樣品處理濕熱法滅活后，利奈唑胺質(zhì)控血漿樣品低、中、高濃度的準(zhǔn)確度分別為99.1%、94.9%和100.1%，RSD均小于15%。根據(jù)“生物樣品定量分方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則（9012）”中關(guān)于生物樣品準(zhǔn)確度的規(guī)定，本研究中將生物樣品的準(zhǔn)確度范圍定義為標(biāo)示值的85%～115%，若超過(guò)上述范圍則認(rèn)為該生物樣品在此操作下不穩(wěn)定。結(jié)果表明，采用濕熱法滅活操作未對(duì)利奈唑胺質(zhì)控血漿樣品的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

表2 濕熱法滅活對(duì)利奈唑胺質(zhì)控血漿樣品濃度影響考察(n＝6)Tab 2 Effect of damp heat inactivation on the concentration of linezolid quality control plasma samples (n＝6)

2.5.3 利奈唑胺血藥濃度監(jiān)測(cè)樣本濕熱滅活前后分析方法一致性評(píng)價(jià) 選取本院重癥醫(yī)學(xué)科使用利奈唑胺的患者58例，采集穩(wěn)態(tài)谷濃度血液標(biāo)本，經(jīng)6000 r·min－1離心5 min分離上層血漿，采用濕熱滅活法進(jìn)行利奈唑胺臨床樣品穩(wěn)定性考察，分別測(cè)定未滅活操作、濕熱滅活法操作后的利奈唑胺血藥濃度。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)兩種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（intraclass correlation efficient，ICC）值統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示未滅活操作與濕熱滅活操作的利奈唑胺濃度結(jié)果的相關(guān)系數(shù)值為0.997（P＜0.001）。說(shuō)明所檢測(cè)數(shù)據(jù)可信度高、一致性較好（ICC＞0.75），可以初步判斷兩組TDM檢測(cè)結(jié)果可重復(fù)性較好。

采用MedCalc軟件對(duì)兩種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行Passing-Bablok回歸法相關(guān)分析，以未進(jìn)行滅活操作所測(cè)得利奈唑胺的濃度結(jié)果（Y）與濕熱滅活法操作所得利奈唑胺的濃度結(jié)果（X）進(jìn)行線性回歸分析，回歸方程為Y＝－0.042 35＋1.009X（R2＝0.9957，n＝58），如圖2所示。其斜率和截距均在95%的置信區(qū)間內(nèi)，表明兩種方法之間不存在系統(tǒng)誤差和比例誤差，測(cè)定結(jié)果之間的相關(guān)性良好（R2＞0.95）。Passing-Bablok回歸法證明兩種檢測(cè)方法可以互相代替。

圖2 利奈唑胺未滅活操作與濕熱滅活法Passing-Bablok線性回歸分析圖Fig 2 Passing-Bablok linear regression of un-inactivation and damp heat inactivation on linezolid

采用MedCalc軟件將兩種方法測(cè)定的利奈唑胺濃度值進(jìn)行Bland-Altman分析，繪制偏差圖，如圖3所示。58例利奈唑胺實(shí)測(cè)配對(duì)數(shù)據(jù)差值的均數(shù)d＝－0.0133，則95%一致性界限為（－0.5880，0.5613）。從圖3可以看出96.55%（56/58）的點(diǎn)在95%一致性界限以內(nèi)，符合相關(guān)要求。在一致性界限范圍內(nèi)，未滅活操作的血藥濃度值與濕熱法滅活操作后血藥濃度值相比，差值的絕對(duì)值最大為1.18。由圖3中可知使用百分比比值計(jì)算一致性界限時(shí)，95%一致性界限為（－9.6668%，10.3177%），96.55%（56/58）的點(diǎn)在95%一致性界限內(nèi)，此相差幅度在臨床上可以被接受。Bland-Altman分析證明濕熱滅活法與未滅活操作兩種檢測(cè)方法可以互換。

圖3 利奈唑胺未滅活操作與濕熱滅活法Bland-Altman分析圖Fig 3 Bland-Altman analysis of un-inactivation and damp heat inactivation on linezolid

3 討論

《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》中提出，新冠病毒對(duì)紫外線和熱敏感，56℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過(guò)氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒[1]。針對(duì)重癥新冠肺炎患者往往合并細(xì)菌、真菌感染的情況，臨床亟需對(duì)抗菌藥物的血藥濃度監(jiān)測(cè)標(biāo)本開(kāi)展新冠病毒滅活操作穩(wěn)定性的研究，以保護(hù)相關(guān)醫(yī)護(hù)人員的操作安全。目前尚未見(jiàn)到關(guān)于新冠病毒滅活操作對(duì)利奈唑胺血濃度監(jiān)測(cè)影響的研究報(bào)道，本文主要采用濕熱法和紫外法滅活病毒。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利奈唑胺樣品經(jīng)濕熱滅活法后測(cè)定濃度與滅活前無(wú)明顯差異，但經(jīng)紫外滅活法處理后出現(xiàn)明顯降解，有文獻(xiàn)報(bào)道，利奈唑胺在光化學(xué)條件下會(huì)發(fā)生C-F鍵的斷裂，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的三線態(tài)笨基陽(yáng)離子，發(fā)生光降解現(xiàn)象[10-11]。且在紫外滅活法中，隨著利奈唑胺濃度的升高，降解率增大，推測(cè)可能是由于在高濃度時(shí)，利奈唑胺的光化學(xué)動(dòng)力學(xué)受反應(yīng)中間體形成的影響，比如自由基，引起鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從而提高光降解率，造成利奈唑胺的濃度和光降解速率成正比。

本研究中所采用的臨床患者血樣均是在病區(qū)進(jìn)行分離血漿的操作后送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)的，考慮到全血樣品在分離血漿的操作中也存在感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)，本研究對(duì)全血樣品也進(jìn)行了滅活前后的考察，發(fā)現(xiàn)濕熱滅活法會(huì)使全血樣品發(fā)生嚴(yán)重的溶血現(xiàn)象，樣品檢測(cè)的色譜圖雜質(zhì)峰較多，會(huì)對(duì)利奈唑胺的保留時(shí)間造成干擾，且影響到利奈唑胺檢測(cè)的靈敏度。因此本研究中主要是對(duì)血漿樣品進(jìn)行滅活前后的考察。

在一致性評(píng)價(jià)過(guò)程中，采用多種方法從不同角度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，可以避免單一評(píng)價(jià)方法的局限性，也使得評(píng)價(jià)結(jié)果更具有代表性[12-13]。本文采用經(jīng)典的臨床分析檢驗(yàn)一致性評(píng)價(jià)方法來(lái)判斷利奈唑胺樣品經(jīng)過(guò)病毒滅活處理與未滅活處理的一致性，通過(guò)計(jì)算ICC值、Passing-Bablok回歸法和Bland-Altman偏差圖分析法進(jìn)行綜合分析考察，證明濕熱法新冠病毒滅活操作不會(huì)對(duì)利奈唑胺血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。

綜上所述，在新冠肺炎疫情防控期間，對(duì)于利奈唑胺的TDM檢測(cè)血漿樣本可采用56℃、30 min濕熱法進(jìn)行病毒滅活操作，不可采用紫外滅活方式。后續(xù)將對(duì)更多的抗菌藥物進(jìn)行新冠病毒滅活操作影響的考察，從而減少疫情期間TDM相關(guān)醫(yī)護(hù)人員病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。