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    新型冠狀病毒滅活方式對(duì)化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法監(jiān)測環(huán)孢素血藥濃度的影響

    2021-11-01 05:33:16繆文清石晨陽尹悅勤趙霖蔓范國榮上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科上海00080上海健康醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院上海08重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶40006
    中南藥學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:環(huán)孢素血樣渦旋

    繆文清,石晨陽,尹悅勤,趙霖蔓,范國榮*(. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科,上海00080;. 上海健康醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,上海 08;. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,重慶 40006)

    新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎,COVID-19)在世界各地流行蔓延,并出現(xiàn)多種變異的新型冠狀病毒(簡稱新冠病毒,SARSCoV-2),疫情防控形勢十分嚴(yán)峻。

    環(huán)孢素是一種真菌源性的環(huán)狀十一氨基酸多肽,是器官移植后免疫抑制治療的主要藥物[1-2],可以大大提高移植器官如心臟、肝臟、腎臟的存活率[3-5]。環(huán)孢素的血藥濃度監(jiān)測有助于調(diào)整劑量,以避免劑量不足導(dǎo)致治療無效或過量而中毒。環(huán)孢素會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng),主要是腎毒性和肝毒性[6],還包括腹瀉、牙齦增生、惡心、嘔吐等。多項(xiàng)研究表明對(duì)環(huán)孢素的濃度進(jìn)行監(jiān)測,根據(jù)血藥濃度來制訂個(gè)體化給藥方案有良好效果[7]。

    新冠肺炎疫情期間,環(huán)孢素血液檢測樣本可能來源于無癥狀感染者、疑似患者或確診患者,這對(duì)于從事血藥濃度檢測的醫(yī)務(wù)工作者來說,存在暴露于新冠病毒環(huán)境甚至感染新冠病毒的危險(xiǎn)性。因此,為了確保檢測人員的安全,需要在血樣檢測前按照《新型冠狀病毒肺炎患者血藥濃度檢測技術(shù)指引》中的要求對(duì)標(biāo)本進(jìn)行病毒滅活[8],根據(jù)新冠病毒的理化特性,其對(duì)紫外線和熱敏感,56℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶性溶劑均可有效滅活病毒[9]。目前指南推薦的對(duì)于生物標(biāo)本的消毒方法為濕熱法和紫外消毒法,但是56℃水浴30 min和紫外線照射兩種病毒滅活方式對(duì)化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法(CMIA)監(jiān)測環(huán)孢素血藥濃度是否有影響,熱滅活和紫外線照射預(yù)處理的環(huán)孢素血樣標(biāo)本是否還能滿足檢測的要求,是否會(huì)對(duì)血樣標(biāo)本中被檢測的環(huán)孢素產(chǎn)生破壞從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性等未見報(bào)道?;诖耍狙芯靠疾炝诵鹿诓《緹釡缁詈妥贤饩€照射滅活兩種方式對(duì)CMIA檢測環(huán)孢素血藥濃度的影響。

    1 研究對(duì)象與方法

    1.1 研究對(duì)象

    收集本院移植患者環(huán)孢素血藥濃度檢測標(biāo)本180例,隨機(jī)選取20例測定溶血前后環(huán)孢素血藥濃度,80例測定熱滅活前后環(huán)孢素血藥濃度,80例測定紫外線照射滅活前后環(huán)孢素血藥濃度。另配制10份環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別測定熱滅活前后環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)液濃度。

    1.2 儀器與試藥

    ARCHITECT i1000SR 全自動(dòng)免疫分析儀(美國雅培),DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),GB19258-2012紫外線殺菌燈(東莞市毅萬光源有限公司),Vortex-Genie 2渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司),移液槍(德國Eppendorf公司),高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。環(huán)孢素測定試劑盒(批號(hào):07001M800)、環(huán)孢素校準(zhǔn)品(批號(hào):85K27620)(美國雅培公司)和質(zhì)控液(泰克帕斯診斷產(chǎn)品有限公司,批號(hào):02111190)。環(huán)孢素注射液(諾華制藥,規(guī)格:5 mL/250 mg,批號(hào):SXH60)。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 環(huán)孢素血藥濃度測定方法 采用CMIA測定標(biāo)本熱滅活前后,紫外線照射滅活前后環(huán)孢素血藥濃度以及環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,試劑盒檢測范圍為30.0~1500.0 ng·mL-1。環(huán)孢素標(biāo)本前處理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程如下:標(biāo)本輕輕上下顛倒混勻10次,混勻后用移液槍精密吸取200 μL至離心管中,在每份含有待測樣本的離心管中分別加入環(huán)孢素全血溶解劑100 μL,環(huán)孢素全血沉淀劑400 μL,蓋緊離心管后用渦旋振蕩器,渦旋5~10 s充分混勻,用高速離心機(jī)13 000 r·min-1離心4 min,將上清液倒入移植預(yù)處理管中,再用渦旋振蕩器,渦旋5~10 s,上機(jī)檢測。檢測結(jié)束后用含氯消毒劑對(duì)儀器探針、管路等進(jìn)行清洗維護(hù)。

    1.3.2 溶血實(shí)驗(yàn)方法 于患者再次服藥前,用EDTA抗凝管抽取靜脈血大約5 mL,均勻混合后從中取出1 mL血樣標(biāo)本置于離心管內(nèi),用渦旋振蕩器強(qiáng)力渦旋1 min引起機(jī)械性溶血。

    1.3.3 熱滅活方法 于患者再次服藥前,用EDTA抗凝管抽取靜脈血大約5 mL,均勻混合后從中取出1 mL血樣標(biāo)本置于離心管內(nèi),經(jīng)熱滅活處理。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)分會(huì)要求,標(biāo)本熱滅活條件為56℃水浴30 min[10]。在通風(fēng)櫥或有條件的實(shí)驗(yàn)室可在生物安全柜內(nèi),用75%乙醇對(duì)標(biāo)本采集管外周進(jìn)行噴灑消毒,用吸水紙擦拭后放入56℃水浴鍋中,為防止標(biāo)本采集管漂浮,放置重物于標(biāo)本蓋上,每隔5~10 min將血樣標(biāo)本搖勻1次,使標(biāo)本熱滅活時(shí)受熱均勻。

    1.3.4 紫外線照射滅活方法 于患者再次服藥前,用EDTA抗凝管抽取靜脈血大約5 mL,均勻混合后從中取出1 mL置于透明離心管內(nèi),于254 nm紫外線燈下放置30 min。

    1.3.5 熱滅活處理 取濃度為50 mg·mL-1環(huán)孢素注射液,加入生理鹽水稀釋成500 ng·mL-1的環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)溶液,取10份500 ng·mL-1的環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)溶液按照“1.3.3”項(xiàng)下方法56℃水浴30 min,另取10份500 ng·mL-1的環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)溶液不做熱滅活處理。然后均按照“1.3.1”項(xiàng)下方法測定環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)液濃度。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

    應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組數(shù)據(jù)間采用配對(duì)t檢驗(yàn),分析溶血前后、環(huán)孢素血樣標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)液熱滅活前后、紫外線照射前后環(huán)孢素血藥濃度結(jié)果,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 溶血前后環(huán)孢素血藥濃度檢測結(jié)果

    采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法檢測20例溶血前后環(huán)孢素血藥濃度,結(jié)果溶血前環(huán)孢素平均血藥濃度為(279.71±100.66)ng·mL-1,最低血藥濃度為103.30 ng·mL-1,最高血藥濃度為451.90 ng·mL-1;溶血后環(huán)孢素平均血藥濃度為(276.92±98.29)ng·mL-1,最低血藥濃度為132.90 ng·mL-1,最高血藥濃度為464.30 ng·mL-1,溶血前后環(huán)孢素血藥濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.649),見表1。

    2.2 熱滅活前后環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)液濃度檢測結(jié)果

    采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法檢測10例熱滅活(水浴加熱56℃ 30 min)前后環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)液濃度(質(zhì)量濃度為500 ng·mL-1),熱滅活前環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)液平均濃度為(499.42±2.35)ng·mL-1,最低濃度為495.80 ng·mL-1,最高濃度為502.40 ng·mL-1;熱滅活后平均濃度為(467.14±4.03)ng·mL-1,最低濃度為461.80 ng·mL-1,最高濃度為472.80 ng·mL-1;采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,表明熱滅活前后環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002),并且熱滅活后環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)液濃度普遍降低。

    2.3 熱滅活前后環(huán)孢素血藥濃度檢測結(jié)果

    采用CMIA檢測80例熱滅活(水浴加熱56℃ 30 min)前后環(huán)孢素血藥濃度,熱滅活前環(huán)孢素平均血藥濃度為(335.64±143.89)ng·mL-1,最低血藥濃度為140.80 ng·mL-1,最高血藥濃度為987.50 ng·mL-1;熱滅活后環(huán)孢素平均血藥濃度為(320.62±133.75)ng·mL-1,最低血藥濃度為129.30 ng·mL-1,最高血藥濃度為946.90 ng·mL-1;采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,表明熱滅活前后環(huán)孢素血藥濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010),并且熱滅活后環(huán)孢素血藥濃度普遍降低,見表1。

    2.4 紫外線照射滅活前和紫外線照射滅活后環(huán)孢素血藥濃度檢測結(jié)果

    采用CMIA檢測80例紫外線照射滅活(254 nm 30 min)前后環(huán)孢素血藥濃度中,紫外線照射滅活前環(huán)孢素平均血藥濃度為(344.83±131.81)ng·mL-1,最低血藥濃度為162.30 ng·mL-1,最高血藥濃度為851.60 ng·mL-1;紫外線照射滅活后環(huán)孢素平均血藥濃度為(349.91±130.68)ng·mL-1,最低血藥濃度為180.80 ng·mL-1,最高血藥濃度為853.80 ng·mL-1;采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,表明紫外線照射滅活前后環(huán)孢素血藥濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.139),見表1。

    表1 不同處理方式環(huán)孢素血藥濃度變化情況Tab 1 Cyclosporine blood concentration under diffenent inactivation condition

    3 討論

    3.1 溶血前后環(huán)孢素血藥濃度變化情況分析

    溶血是指紅細(xì)胞破裂,血紅蛋白逸出到血漿中,可由多種理化因素和毒素引起,高溫、低滲溶液、機(jī)械性強(qiáng)力振蕩、突然低溫冷凍(-20~-25℃)、過酸、過堿等均可引起溶血。紅細(xì)胞遇高溫后其細(xì)胞膜破裂,因此熱滅活(56℃30 min)不可避免地會(huì)引起標(biāo)本溶血。本研究中所有標(biāo)本熱滅活后均發(fā)生溶血,因此需要考察溶血后是否會(huì)對(duì)環(huán)孢素血藥濃度檢測結(jié)果造成影響,以排除和規(guī)避是溶血造成的環(huán)孢素血藥濃度的增加或降低;進(jìn)一步也可以為后續(xù)熱滅活試驗(yàn)確定環(huán)孢素對(duì)熱是否穩(wěn)定排除溶血因素。本研究采用渦旋振蕩器強(qiáng)力渦旋1 min引起機(jī)械性溶血建立溶血模型模擬溶血,考察溶血前后環(huán)孢素血藥濃度變化情況。結(jié)果表明,溶血前后環(huán)孢素血藥濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.649),因此,可以排除標(biāo)本溶血對(duì)環(huán)孢素血藥濃度的影響。由于CMIA采用兩步法免疫檢測,運(yùn)用Chemiflex技術(shù),樣本中的環(huán)孢素A與環(huán)孢素A抗體包被的微粒子結(jié)合,再和吖啶酯標(biāo)記的環(huán)孢素A結(jié)合物形成反應(yīng)混合物,最后通過加入激發(fā)液和預(yù)激發(fā)液產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)以相對(duì)發(fā)光單位的數(shù)值(RLU)來測量[11],溶血釋放的血紅蛋白不能作為抗原競爭免疫結(jié)合,因此,溶血現(xiàn)象不會(huì)影響環(huán)孢素血藥濃度測定結(jié)果。

    3.2 熱滅活前后環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)溶液和環(huán)孢素血藥濃度變化情況分析

    80例熱滅活環(huán)孢素血藥濃度中,環(huán)孢素血藥濃度降低的占75.0%(60例),差值在-195.9~184.6 ng·mL-1,中位數(shù)為-10.6 ng·mL-1,血藥濃度變化范圍在-32.5%~ 14.9%,熱滅活前后環(huán)孢素血藥濃度變化結(jié)果見圖1。由于環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)溶液水浴加熱56℃ 30 min后濃度也下降,可得知環(huán)孢素在56℃水浴30 min不穩(wěn)定,會(huì)引起環(huán)孢素的降解,且已排除標(biāo)本溶血對(duì)環(huán)孢素血藥濃度監(jiān)測的影響,因此,熱滅活后環(huán)孢素血藥濃度降低的主要原因可能是濕熱法在滅活所有脂包膜病毒和大部分非脂包膜病毒的同時(shí),使環(huán)孢素受熱分解引起的。

    圖1 熱滅活前后環(huán)孢素血藥濃度結(jié)果變化圖(虛線表示濃度變化下降超過15%)Fig 1 Changes in the blood concentration of cyclosporine before and after the thermal inactivation(the dotted indicates concentration decrease by more than 15%)

    根據(jù)《中國藥典》關(guān)于原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則,其含量變化值允許在±5%范圍內(nèi)[12],本研究中熱滅活后環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度變化范圍在-7.28%~5.89%,已超過允許范圍;根據(jù)藥典關(guān)于生物樣品定量分析的指導(dǎo)原則,其含量變化值允許在±15%范圍內(nèi)[12],本研究中熱滅活后環(huán)孢素血藥濃度變化范圍在-32.5%~14.9%,已超過允許范圍。本研究發(fā)現(xiàn)無論是環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)溶液還是環(huán)孢素血液檢測標(biāo)本,熱滅活后環(huán)孢素濃度均有不同程度的下降,而且都超過藥典規(guī)定的范圍,根據(jù)環(huán)孢素?zé)釡缁詈蟮臋z測結(jié)果調(diào)整臨床用藥,會(huì)對(duì)移植患者環(huán)孢素的使用方案造成誤導(dǎo),甚至使病情惡化。因此,新冠肺炎疫情期間,不建議對(duì)環(huán)孢素檢測標(biāo)本熱滅活處理后再進(jìn)行血藥濃度檢測。

    3.3 紫外線照射滅活前后環(huán)孢素血藥濃度變化情況分析

    采用CMIA檢測80例紫外線照射滅活前后環(huán)孢素血藥濃度,結(jié)果表明,紫外線照射滅活前后環(huán)孢素血藥濃度結(jié)果未見明顯變化。因此,建議對(duì)環(huán)孢素血藥濃度檢測標(biāo)本紫外線照射滅活處理后再進(jìn)行常規(guī)檢測。

    紫外線照射滅活如果沒有防護(hù)措施,極易對(duì)人體造成巨大傷害。如果裸露的肌膚被這類紫外線燈照射,輕者會(huì)出現(xiàn)紅腫、疼癢、脫屑;重者甚至?xí)l(fā)癌變、皮膚腫瘤等。同時(shí),它也是眼睛的“隱形殺手”,會(huì)引起結(jié)膜、角膜發(fā)炎,長期照射可能會(huì)導(dǎo)致白內(nèi)障,因此在研究過程中檢測人員需要注意紫外線防護(hù)。

    綜上所述,CMIA檢測COVID-19確診患者或者疑似患者的環(huán)孢素血藥濃度,不可用濕熱法56℃水浴30 min滅活樣本,可用254 nm紫外線照射30 min滅活臨床血液檢測標(biāo)本,以降低血樣檢驗(yàn)人員感染病毒風(fēng)險(xiǎn)。

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