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    基于遷移芯片木蝴蝶總黃酮類對肝癌細(xì)胞遷移的影響研究

    2021-11-01 05:33:14李楠楠包永睿鄭義博王鶴辰孟憲生遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院遼寧大連6600遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心遼寧大連6600遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室遼寧大連6600遼寧中醫(yī)藥大學(xué)安捷倫現(xiàn)代中醫(yī)藥多組學(xué)研究合作實驗室遼寧大連6600
    中南藥學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:木蝴蝶貼壁孔板

    李楠楠,包永睿,2,3,4,鄭義博,王鶴辰,孟憲生,2,3,4*(. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連6600;2. 遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連 6600;3. 遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室,遼寧 大連6600;4. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)-安捷倫現(xiàn)代中醫(yī)藥多組學(xué)研究合作實驗室,遼寧 大連 6600)

    木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶Orozylum indicum(L.)Vent.的干燥成熟種子,具有清肺利咽,疏肝和胃的功效[1]。黃酮是木蝴蝶的主要成分,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[2-4]。微流控芯片(microfluidic chip)具有微量化、超高通量化、集成化等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、疾病診斷與治療、藥物篩選等領(lǐng)域[5-7]。本研究應(yīng)用微流控芯片技術(shù)研究木蝴蝶總黃酮類成分在體外對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用,不僅為木蝴蝶作為抗肝癌藥物的研究奠定基礎(chǔ),也為中藥抗腫瘤藥物的體外藥理學(xué)研究提供新的方法。

    1 材料

    1.1 儀器

    TG-2U型光刻機(jī)(北京中科同志科技有限公司);LSP04-1A精密注射泵(保定蘭格公司);ECLIPSE-TI 倒置熒光顯微鏡(日本NIKON 公司);RT-PCR(Piko Thermol公司);通用電泳儀(美國BD公司);直拉單晶拋光硅片(哈爾濱特博科技有限公司)。

    1.2 試藥

    木蝴蝶藥材購自大連同仁堂藥房,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為Orozylum indicum(L.)Vent.的干燥成熟種子;木蝴蝶總黃酮(由本實驗室制備,經(jīng)紫外分光光度計測定純度大于90%)。10%胎牛血清、1%青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公 司);TRlzol Reagent(美國Life公司);RIPA裂解液(美國ambion公司);RT-PCR試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司);SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒、飛克特超敏ECL發(fā)光液(大連美侖生物科技有限公司);抗體Anti-p38 MAPK phosphor(Thr180/Tyr182)(美國Arigo公司);抗體p38 MAPK、β-actin(美國Proteintech公司)。

    1.3 細(xì)胞株

    人肝癌細(xì)胞HepG2,由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫提供。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    按常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)。隔日換液、傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞做后續(xù)實驗。

    2.2 藥品的配制

    取適量木蝴蝶總黃酮,用DMEM培養(yǎng)液溶解,配制成1.0 mg·mL-1含藥培養(yǎng)液,過 0.22μm 微孔濾膜,4℃保存,備用。

    2.3 芯片的設(shè)計及制作

    基于實驗室較為成熟的芯片制作工藝,采用軟光刻法[8-9]制作陽模,采用澆注法[10]將彈性材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)澆注于陽模上形成芯片的閥層及通道層,最后采用氧等離子不可逆鍵合的方法[11]將PDMS結(jié)構(gòu)與載玻片鍵合在一起形成PDMS-玻璃復(fù)合型芯片即“遷移芯片”。該芯片由上至下分別為閥控層、通道層和玻璃層,包括3個培養(yǎng)液入口,3個閥控液體入口,2個細(xì)胞入口,8個廢液流出口。

    2.4 芯片中細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

    取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞,用0.25%的胰酶消化后,用100 μL培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。先通入閥控液體,再通過微量注射器將細(xì)胞從芯片的細(xì)胞注入口注入,37℃培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)12 h后使用精密注射泵以0.2 μL·min-1的流速向芯片中通入培養(yǎng)液,繼續(xù)流動培養(yǎng)24 h。將液閥關(guān)閉,使用精密注射泵以0.2 μL·min-1的流速向芯片中通入藥物,給藥作用48 h,用顯微鏡在遷移區(qū)域拍照,用IPP軟件進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)[12],按照下面公式計算相對遷移率并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。相對遷移率(%)=(實驗組遷移細(xì)胞數(shù)/空白組遷移細(xì)胞數(shù))×100%。

    2.5 孔板劃痕實驗

    取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞,PBS清洗,0.25%的胰酶消化,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個·mL-1,接種于6孔培養(yǎng)板,每孔1 mL,繼續(xù)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁完全。使用1 mL槍頭在每組孔底部劃出“一”字形劃痕,然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,使用PBS清洗3次,設(shè)空白對照組(加細(xì)胞,但不加藥物)、木蝴蝶總黃酮組(TF組,藥物干預(yù)48 h),用顯微鏡在遷移區(qū)域拍照。

    2.6 PT-PCR法實驗

    將處于對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞接種于6孔板中,木蝴蝶總黃酮干預(yù)48 h 后消化收集細(xì)胞,TRIzol法提取總RNA[13]。應(yīng)用RT-①PCR試劑盒明書操作,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA并合成目的基因。引物序列如下:①β-actin:F 5'-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3',R 5'-TTTGATGTCACGCACGATTT-3'; ②p38:F 5'-CGGCACACTGATGACGAAAT-3',R 5'-CAACGTTCTTCCGGTCAACA-3'。

    2.7 Western blot實驗

    取對數(shù)生長期人肝癌HepG2細(xì)胞接種于6孔板中,木蝴蝶總黃酮干預(yù)48 h后消化收集細(xì)胞,加入RIPM、PMSF、磷酸酶抑制劑裂解提取總蛋白。采用NanoDrop 5000 BSA法測定蛋白濃度,PBS緩沖液調(diào)整使各組蛋白終濃度相同。采用SDS-PAGE法,5%濃縮膠和8%分離膠,在100 V電壓下濃縮30 min,調(diào)節(jié)電壓120 V電泳分離蛋白質(zhì),在160 V電壓下轉(zhuǎn)膜1 h,取出PVDF膜用BSA溶液室溫?fù)u床封閉2 h。封閉結(jié)束后,將PVDF膜在一抗(5%BSA按照1∶500進(jìn)行稀釋)、二抗(5%BSA按照1∶5000進(jìn)行稀釋)中孵育,TBST搖床清洗,ECL法進(jìn)行顯色,采用Image J軟件分析條帶灰度值[14],計算各組蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

    2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

    應(yīng)用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,實驗結(jié)果以±s表示,多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析,P<0.05說明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 遷移芯片

    根據(jù)實驗需求,本課題組設(shè)計一種用于研究藥物對細(xì)胞遷移影響的芯片——PDMS-玻璃復(fù)合芯片,設(shè)計圖及芯片實物圖見圖1。該芯片包括三層:PDMS閥層,通入液體作為液閥,可控制通道的開合,調(diào)節(jié)細(xì)胞和液體的流向;PDMS通道層,可作為細(xì)胞或液體的通道;玻璃層,用于細(xì)胞貼壁。采用氧等離子不可逆鍵合而成,其中細(xì)胞注入口、藥物注入口、廢液口等位置如圖1所示。

    圖1 遷移芯片的結(jié)構(gòu)示意圖(A)和實物圖(B)Fig 1 Schematic diagram(A)and physicalmap(B)of the microfluidic chip

    3.2 基于遷移芯片木蝴蝶總黃酮類對人肝癌細(xì)胞HepG2遷移的影響

    如圖2所示,關(guān)閉液閥前,即給藥0 h時,HepG2細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)通道呈貼壁生長,細(xì)胞形態(tài)呈梭形,胞質(zhì)透明,生長狀態(tài)良好;關(guān)閉液閥后,細(xì)胞培養(yǎng)腔與相鄰?fù)ǖ老嗤ǎ^續(xù)培養(yǎng)24 h后,空白組細(xì)胞向相鄰?fù)ǖ郎L,木蝴蝶總黃酮也有少量細(xì)胞向相鄰?fù)ǖ肋w移生長,但是遷移率較低。木蝴蝶總黃酮組24 h、48 h相對遷移率分別為16.59%、8.06%,與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明木蝴蝶總黃酮能很好地抑制腫瘤細(xì)胞遷移。

    圖2 HepG2細(xì)胞在芯片中的遷移狀態(tài)(A,100×)和遷移統(tǒng)計結(jié)果(B)Fig 2 Migration of HepG2 cells in the chip(A,100×)and statistical data of the cell migration(B)

    3.3 基于劃痕實驗?zāi)竞傸S酮類對人肝癌細(xì)胞HepG2遷移的影響

    如圖3所示,給藥0 h時,各組HepG2細(xì)胞在孔板底部呈貼壁生長,細(xì)胞形態(tài)呈梭形,胞質(zhì)透明,生長狀態(tài)良好。培養(yǎng)24 h后,空白組細(xì)胞向劃痕空白處遷移生長,劃痕“傷口”變?。荒竞傸S酮組部分發(fā)生皺縮,細(xì)胞變圓,但是并未向劃痕空白處遷移生長,劃痕“傷口”無變化。培養(yǎng)48 h后,空白組劃痕空白密布肝癌細(xì)胞,“傷口”幾乎愈合;TF組細(xì)胞大部分發(fā)生皺縮、變圓,部分細(xì)胞已死亡、懸浮于培養(yǎng)液中,但是并未向劃痕空白處遷移生長,劃痕“傷口”無變化。說明木蝴蝶總黃酮具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用。

    圖3 劃痕實驗各組HepG2細(xì)胞遷移狀態(tài)圖(100×)Fig 3 Migration of HepG2 in each group of scratch test(100×)

    3.4 木蝴蝶總黃酮對相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

    采用RT-PCR法和Western blot法檢測相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的變化,由圖4可知,木蝴蝶總黃酮能降低p38 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.05),能降低p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.01)。

    圖4 木蝴蝶總黃酮對HepG2細(xì)胞中p38 mRNA(A)和p38蛋白質(zhì)(B)相對表達(dá)量的影響(n=3,±s)Fig 4 Effect of TF on p38 mRNA expression(A)and protein expression(B)of HepG2 cells(n=3,±s)

    4 討論

    本研究基于實驗室成熟的芯片制作工藝,設(shè)計并制作了用于研究細(xì)胞遷移的微流控芯片,即遷移芯片。該芯片由閥層、通道層、玻璃層組成,閥層和通道層上下對應(yīng),是模擬傳統(tǒng)孔板劃痕遷移實驗。當(dāng)上層閥層中通入液體后,由于壓力的作用,PDMS會發(fā)生彈性形變,通入液體的通道將下壓,與下層通道層中對應(yīng)的通道重合,將其與通道層中細(xì)胞流入通道阻斷,即造成“劃痕”,向通道層中細(xì)胞通道通入細(xì)胞懸液,待細(xì)胞貼壁后,將液閥關(guān)閉,此時細(xì)胞與相鄰的通道相連接,細(xì)胞則可向空白通道處遷移生長。為防止使用時通道塌陷,本課題組在芯片中間加入長橢圓形的支撐結(jié)構(gòu),使該芯片可重復(fù)多次使用。該芯片通過閥控裝置來模擬“劃痕”,并且這種劃痕不會對細(xì)胞造成機(jī)械性損傷,更接近癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移過程。為了驗證該芯片的適用性,本研究同時使用傳統(tǒng)的劃痕法進(jìn)行驗證。劃痕法實驗結(jié)果與微流控芯片結(jié)果均說明木蝴蝶總黃酮具有很好的抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用,具有進(jìn)一步研究的價值。同時也說明微流控芯片法可以替代孔板內(nèi)進(jìn)行的遷移研究實驗,并存在簡單、快捷的優(yōu)勢。

    MAPK即絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase)是一系列與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)者,包括細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、分化、凋亡、存活和耐藥性等[15-16]。p38是MAPK激酶中的一種,與癌癥具有很大的相關(guān)性[17]。Dalasanur等[18]的研究表明,在乳腺癌中激活的p38可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明木蝴蝶總黃酮能降低p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá),即減少p38的活化,說明木蝴蝶總黃酮能抑制p38活化,抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,從而發(fā)揮抗肝癌作用。

    綜上所述,本研究結(jié)果表明木蝴蝶總黃酮具有明顯的體外抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用,其發(fā)揮作用的機(jī)制可能與抑制p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá),減少p38的活化有關(guān)。

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