枯草芽孢桿菌BS-1菌株對獼猴桃采后軟腐病的抑制和保鮮效果評價

劉 奎，趙煥蘭，宗 寧，李歡歡，劉永勝,3，苗 敏

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.北方民族大學(xué)，寧夏 銀川 750021；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽 合肥 230061）

獼猴桃（Actinidiachinensis），屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬植物，是20世紀(jì)野生果樹人工馴化栽培最成功的四大果樹之一[1]。近些年來，我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)迅速崛起，2017年，我國獼猴桃種植面積達(dá)250 000 hm2，超過世界其他所有獼猴桃生產(chǎn)國的種植面積總和[1]。但獼猴桃果實采后腐爛率高達(dá)35%左右[2]，果實采后腐爛是果實自身的衰老或生理失調(diào)、病原微生物侵染和采后貯運過程中的機械損傷三者相互影響的結(jié)果，其中病原菌侵染引起的組織腐爛是果實采后腐爛最主要的原因[3]。獼猴桃果實軟腐病是獼猴桃采后主要病害，由病原真菌感染引起。該病在陜西、四川和江西等獼猴桃主產(chǎn)區(qū)均普遍發(fā)生，其普遍發(fā)病率都可達(dá)到20%～50%[4]，造成采前落果和貯藏期果實腐爛率升高，嚴(yán)重影響獼猴桃果實品質(zhì)及市場銷售，造成重大經(jīng)濟損失[5]。

軟腐病病原學(xué)的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)多種病原真菌可以引起獼猴桃軟腐病，Li等[6]在軟腐病病果上分離鑒定到Diaporthespp.、Botryosphaeriadothidea、Alternaria alternata和Pestalotiopsismicrospora，所占比例分別是52.6%、23.7%、13.2%和10.5%。Zhou等[7]報道Botryosphaeriadothidea、Lasiodiplodiatheobromae、Neofusicoccumparvum為獼猴桃軟腐病致病菌。Botrytiscinerea[8]、Penicilliumexpansum[9]也被報道為軟腐病病原菌，但大多數(shù)研究認(rèn)為擬莖點霉菌（Diaporthespp.）和葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）是我國獼猴桃軟腐病的主要致病菌。

獼猴桃軟腐病的防治以及對獼猴桃采后保鮮研究成為近些年研究熱點。目前獼猴桃軟腐病的防治研究以化學(xué)防治和生防菌株篩選為主[10]。長期施用化學(xué)農(nóng)藥容易使真菌產(chǎn)生抗藥性，破壞生態(tài)環(huán)境安全及影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全；生防菌株對貯藏期果實防治效果較好且安全可靠，其中應(yīng)用最多的生防菌是酵母菌和細(xì)菌。研究表明，生防細(xì)菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對荔枝采后病原菌霜疫霉[11]、柑橘炭疽病菌[12]、桃軟腐病病原菌根霉菌、枇杷炭疽病病原菌炭疽菌[13]具有抑菌活性，且可以提高果實的采后貯藏品質(zhì)。此外，胡欣潔等[14]研究發(fā)現(xiàn)B.subtilisCy-29菌懸液處理果實后能較好地保持紅陽獼猴桃果實良好的品質(zhì)，適當(dāng)延緩果實的成熟衰老。但是有關(guān)B.subtilisstrain BS-1菌液及其無菌體發(fā)酵液（FJY）對獼猴桃軟腐病主要病原菌抑制探究以及獼猴桃貨架期保鮮研究較少。本文研究了B.subtilis菌株BS-1菌液及其無菌體FJY是否抑制病原菌Botryosphaeriadothidea和Diaporthenobilis的菌絲體外生長及果實致病能力，并進(jìn)一步對無菌體FJY的抑菌穩(wěn)定性進(jìn)行了探究，最后將BS-1菌液及FJY應(yīng)用于獼猴桃貨架期保鮮，探究它們對貨架期獼猴桃果實品質(zhì)的影響，以期將枯草芽孢桿菌FJY開發(fā)為一種獼猴桃軟腐病的生防制劑，為采后保鮮劑的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

BacillussubtilisBS-1菌株由重慶文理學(xué)院劉嘉老師提供，Botryosphaeriadothidea（B.dothidea）和Diaporthenobilis（D.nobilis）菌株由合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物學(xué)院基因工程實驗室從寄主（獼猴桃）分離并保存。試驗所用獼猴桃為市售徐香獼猴桃。

LB培養(yǎng)基配方：準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，用蒸餾水溶解并定容至1 L，然后于121℃下滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基配方：去皮土豆200 g、葡萄糖20 g、20 g瓊脂，將去皮土豆切成1 cm3的小塊，加1 L蒸餾水，煮沸15 min，用8層紗布過濾后加入瓊脂，待其溶解后加入葡萄糖，攪拌均勻，冷卻后用蒸餾補足水分至1 L，115℃滅菌30 min。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1118B超凈工作臺，CNT65數(shù)顯糖度計，DIGC6游標(biāo)卡尺，TA.XTPlus物性測試儀，SK-R1807-E標(biāo)準(zhǔn)型三維搖床，MJX-100B-Z霉菌培養(yǎng)箱，MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，Heraeus Multifuge XIR大容量多功能冷凍離心機，PHS-25臺式pH計。

1.2 方法

1.2.1 BS-1菌株體外抑制病原菌菌絲生長試驗

參照代玉立[15]的平板對峙法稍做調(diào)整。將BS-1菌株從-80℃超低溫冰箱取出，劃線于LB固體平板，長出單克隆后，挑取單克隆于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床，180 r/min培養(yǎng)過夜，第2天轉(zhuǎn)接至新LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌細(xì)胞數(shù)達(dá)0.6×108CFU/mL，作為菌液，備用。利用打孔器打取直徑5 mm、培養(yǎng)5 d后新鮮B.dothidea和D.nobilis病原菌菌餅接種于新PDA平板中央，以病原菌為中心，左上、右上、左下、右下，4角距離2 cm處固定4個點，下面兩個點接種5μL備好的B.subtilis菌液，上面2個點接種5μL LB培養(yǎng)基作為對照。接種后的平板培養(yǎng)于25℃霉菌培養(yǎng)箱中，從第3天開始觀察抑菌情況和記錄抑菌圈大?。ňz邊緣到細(xì)菌菌落邊緣的距離），并拍照。每組處理6個平板，試驗重復(fù)3次。

1.2.2 BS-1發(fā)酵液的制備及其體外抑制病原菌菌絲生長試驗

參照黎曉茜等[10]方法并加以修改。將細(xì)胞數(shù)達(dá)0.6×108CFU/mL的BS-1菌液按1%接種量接種于裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28℃搖床，180 r/min培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)后的菌液于4℃，10 000 r/min離心15 min得上清液，將上清液用0.45μm濾膜真空抽濾后即得無菌體發(fā)酵液（FJY）。倒內(nèi)含2%FJY的PDA平板，冷卻凝固后，接種B.dothidea和D.nobilis病原菌于平板中間，置于25℃下培養(yǎng)，從第3天開始觀察抑菌情況和記錄菌落直徑，并拍照。每組處理6個平板，試驗重復(fù)3次。

1.2.3 BS-1及FJY果實體內(nèi)損害病原菌致病力試驗

參照王曉莉[13]的方法并加以調(diào)整。按照前述方法準(zhǔn)備BS-1菌液和無菌體FJY。將購于市場的大小均一、無病害及損傷、較硬的徐香獼猴桃清洗后，用1%次氯酸鈉表面消毒10 min后清水沖洗3次，晾干備用。使用終體積分?jǐn)?shù)為5%的Bacillussubtilis菌液、無菌體FJY及LB培養(yǎng)基分別浸泡獼猴桃5 min，晾干，待接種病原菌。在處理好的獼猴桃赤道部位用錐子打約3 mm深的孔，在孔處接種直徑5 mm的5 d菌齡病原菌菌餅，然后用封口膜纏好后，25℃培養(yǎng)箱放置7 d后觀察患病情況，記錄菌斑直徑，計算患病面積并拍照。每組處理8個獼猴桃，試驗重復(fù)3次。以Bacillussubtilis菌液處理的獼猴桃打孔后不接病原菌作為對照。

1.2.4 FJY的溫度、紫外照射和pH耐受性測定

參考李晨楚[16]的方法，稍有調(diào)整。溫度耐受試驗：將FJY分別于37、60、100、121℃下處理1 h，冷卻至室溫后備用。紫外照射耐受試驗：將FJY分別于功率為18 W的紫外燈管下，燈與水平面成45°放置，分別照射0、0.5、1、2 h后備用。pH耐受試驗：將FJY（初始pH為8）用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH分別為3、4、5、8、9、10，室溫放置2 h后調(diào)回至pH為8后備用。按照2%的比例向PDA培養(yǎng)基中加入各處理的FJY，倒平板備用，以加入2%LB培養(yǎng)基為對照。接種B.dothidea和D.nobilis病原菌于平板中間，放入25℃培養(yǎng)箱，從第3天開始觀察抑菌情況和記錄抑菌率，并拍照。每組處理6個平板，試驗重復(fù)3次。

1.2.5 BS-1及FJY貨架期貯藏保鮮試驗處理

按照前述方法準(zhǔn)備好細(xì)胞數(shù)達(dá)0.6×108CFU/mL的BS-1菌液以及FJY。保鮮所用的獼猴桃為剛從果園采收運到市場的新鮮獼猴桃，剔除爛果，挑選大小均勻的果實，將其分為3組，每組20 kg，其中2組分別噴灑5%細(xì)胞數(shù)達(dá)0.6×108CFU/mL的B.subtilisBS-1菌液和FJY，另一組噴灑無菌水作為對照，每個果實確保噴灑均勻，晾干后，裝入塑料袋，室溫放置，定期觀察腐爛情況并測定品質(zhì)指標(biāo)。

1.2.6 貨架期指標(biāo)測定

使用物性測試儀測定貨架期期間果實的硬度、脆性、緊實度，單位分別為g、g·s、g·s。每次測量3個獼猴桃，每個果實赤道部位取3個測量點?？扇苄怨绦挝锖渴褂脭?shù)顯糖度儀測定，可滴定酸含量采用酸堿滴定法[10]測定，失重率采用稱量法[10]測定，腐爛率（%）=腐爛果實個數(shù)/總果實個數(shù)×100。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016軟件計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，并應(yīng)用Origin 9.0軟件作圖，使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行差異顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BS-1對B.dothidea和D.nobilis生長的影響

2.1.1 BS-1菌液對B.dothidea和D.nobilis體外菌絲生長的影響

由圖1A的平板照片可以看出，接種后第3天，B.dothidea和D.nobilis兩種病原菌平板靠近BS-1的一端菌出現(xiàn)明顯的抑菌圈，大小分別為8.37 mm和17.14 mm，第7天抑菌圈大小趨于穩(wěn)定，大小分別為3.61 mm和12.60 mm（圖1B，1C）。而對照一直沒有觀察到抑菌圈，表明BS-1對兩種病原菌的平板擴展即病原菌體外菌絲生長均有明顯抑制作用。

圖1 BS-1菌液對B.dothidea和D.nobilis體外菌絲生長的影響Fig.1 Effects of BS-1 on the growth of B.dothidea and D.nobilis in vitro

2.1.2 FJY對B.dothidea和D.nobilis體外菌絲生長的影響

由圖2A可知，從接種后第3天開始，F(xiàn)JY處理后的兩種病原菌的菌落直徑均小于CK組，菌落擴展得到顯著抑制。第4天時，F(xiàn)JY對B.dothidea的平板抑菌率最高，達(dá)79.45%（圖2B）；而對D.nobilis的平板抑菌率在第5天時最高，為57.73%（圖2B，2C）。這些結(jié)果表明FJY對這獼猴桃兩種主要病原菌的體外菌絲生長有顯著抑制作用。

圖2 FJY對B.dothidea和D.nobilis體外菌絲生長的影響Fig.2 Effects of FJY on the growth of B.dothidea and D.nobilis in vitro

2.1.3 BS-1和FJY對B.dothidea和D.nobilis果實致病能力的影響

由圖3A可知，與LB培養(yǎng)基處理相比，BS-1菌株及FJY處理的病斑面積減小，兩病原菌致病能力減弱。接種B.dothidea7 d時，LB處理組病斑面積達(dá)456.16 mm2，而BS-1菌株及FJY處理組分別僅為340.18、326.62 mm2（圖3B）。接種D.nobilis7 d時LB處理組病斑面積達(dá)527.80 mm2，而BS-1菌株及FJY處理組分別僅為188.94、184.66 mm2（圖3C），并且從圖3A的CK組可以看出，單獨接種BS-1菌株未引起果實致病。上述結(jié)果表明：BS-1及FJY可以顯著抑制這兩種病原菌的果實致病能力，減少軟腐病的發(fā)生。

圖3 BS-1及FJY對獼猴桃果實B.dothidea和D.nobilis致病能力的影響Fig.3 Effects of BS-1 and FJY on the pathogenicity of B.dothidea and D.nobilis in kiwifruit

2.2 FJY抑菌穩(wěn)定性探究

2.2.1 溫度對FJY抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖4A可見，F(xiàn)JY經(jīng)不同溫度處理并培養(yǎng)7 d后，對兩種病原菌的抑制趨勢一致。在37～121℃范圍內(nèi)，雖然隨著處理溫度升高，F(xiàn)JY抑菌效果有所下降，但與對照相比，各處理組病原菌的菌落直徑顯著變小。即使經(jīng)121℃高溫處理，F(xiàn)JY仍有顯著的抑菌效果。由圖4B和圖4C的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析可知，隨著處理溫度的升高，F(xiàn)JY抑菌率下降，但在接種第7天時，經(jīng)121℃處理后，F(xiàn)JY對B.dothidea和D.nobilis仍有24.86%和29.70%的抑菌率。表明FJY的抑菌效果有一定的溫度耐受性，在37～100℃之間有較好的抑菌效果，經(jīng)121℃高溫處理后仍具有一定的抑菌活性。

圖4 溫度對FJY抑菌穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of temperatures on the bacteriostatic stability of FJY

2.2.2 紫外照射對FJY抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖5A可以看出，F(xiàn)JY經(jīng)不同時間紫外照射并培養(yǎng)7 d，其對兩種病原菌的抑制趨勢基本一致。與對照組相比，在紫外照射時間0.5～2 h內(nèi)，各處理組菌落直徑減小，并且隨著紫外照射時間的延長，F(xiàn)JY仍然保持較好的抑菌效果。由圖5B和5C可以看出，處理3 d后，雖相比于未經(jīng)紫外處理的FJY，各處理組對B.dothidea和D.nobilis抑菌率有所下降，但是幅度不大，且隨著紫外照射時間的延長，抑菌率仍分別維持在71.33%～76.15%和44.54%～47.69%之間。表明在0.5～2 h紫外照射下，F(xiàn)JY具有一定的穩(wěn)定性，對兩種病原菌有較好的抑制效果。

圖5 紫外照射對FJY抑菌穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of utraviolet rays on the bacteriostatic stability of FJY

2.2.3 pH對FJY抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖6A可見，F(xiàn)JY經(jīng)不同pH處理并培養(yǎng)7 d，對兩種病原菌的抑制趨勢一致。在酸性pH 3～5、堿性pH 8～10范圍內(nèi)，雖各pH處理之間有差異，但與對照組相比，各處理組病原菌的菌落直徑下降，抑菌效果明顯。由圖6B和圖6C可以看出，培養(yǎng)第3天時，各處理組抑菌率均高于未處理的FJY（pH=8），對B.dothidea和D.nobilis抑菌率范圍分別為73.59%～79.27%、52.22%～56.48%。培養(yǎng)第7天時，使用pH 4和pH 10處理的FJY抑菌率最高。這些結(jié)果表明：FJY具有較好的酸堿耐受性，在pH 3～5（酸性）、pH 8～10（堿性）范圍內(nèi)均有顯著的抑菌效果。

圖6 pH對FJY抑菌穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of pH on the bacteriostatic stability of FJY

2.3 BS-1及FJY對獼猴桃貨架期品質(zhì)的影響

2.3.1 BS-1及FJY對獼猴桃硬度、脆性和緊實度的影響

在前文探究BS-1菌株及其FJY的抑菌效果和FJY的抑菌效果之后，進(jìn)一步探究它們在獼猴桃采后保鮮上的應(yīng)用。果實的硬度、脆性、緊實度是獼猴桃貨架期的重要品質(zhì)指標(biāo)。由圖7可知，與對照相比，BS-1菌液處理雖然可以提高果實的硬度、脆性和緊實度，但是效果遠(yuǎn)不及無菌體FJY。FJY處理組果實的硬度、脆性和緊實度在貨架3 d時分別為805.65 g、1 462.74 g·s、305.75 g·s，貨架7 d時分別為707.26 g、1 170.34 g·s、269.82 g·s，顯著高于同期對照組果實（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，相比于BS-1菌液，F(xiàn)JY更為顯著地提高了獼猴桃貨架期的硬度、脆性和緊實度，具有很好的保鮮效果。

圖7 BS-1及FJY對獼猴桃硬度、脆性和緊實度的影響Fig.7 Effects of BS-1 and FJY on the hardness,brittleness and tightness of kiwifruit

2.3.2 BS-1及FJY對獼猴桃可溶性固形物和可滴定酸含量的影響

獼猴桃是一種典型的呼吸躍變型果實，貨架期間果實硬度迅速下降，可溶性固形物含量增加，可滴定酸含量逐漸降低[17]。由圖8可知，無論是貨架3 d還是貨架7 d，F(xiàn)JY及BS-1菌液處理組可溶性固形物含量均顯著低于CK（P＜0.05），可滴定酸含量均顯著高于CK（P＜0.05），且FJY處理組可溶性固形物含量顯著低于BS-1處理組（P＜0.05），可滴定酸含量均顯著高于BS-1處理組（P＜0.05）。這些結(jié)果表明：FJY及BS-1菌液處理可以顯著延緩果實可溶性固形物含量的升高，減少可滴定酸的損失，從而提高獼猴桃的貨架品質(zhì)，且FJY的效果較BS-1菌液更為顯著。

圖8 BS-1及FJY對獼猴桃可溶性固形物和可滴定酸含量的影響Fig.8 Effects of BS-1 and FJY on the soluble solids and titratable acids contents of kiwifruit

2.3.3 BS-1及FJY對獼猴桃失重率和腐爛率的影響

圖9A為貨架7 d時對照與處理組獼猴桃照片，可以看出雖然外表上看起來各處理幾乎無差異，但CK組獼猴桃內(nèi)部已完全腐爛，BS-1菌液處理組獼猴桃部分腐爛，但都已喪失食用價值，而FJY處理后的獼猴桃沒有腐爛，仍具有較好的食用價值。由圖9B可以看出，貨架7 d時，F(xiàn)JY處理后的獼猴桃失重率顯著低于CK和BS-1菌液處理組（P＜0.05），僅為5.37%，顯著降低了獼猴桃貨架期的質(zhì)量損失。由圖9C可知，F(xiàn)JY可以顯著降低獼猴桃腐爛率（P＜0.05），可以延長貨架期。

圖9 BS-1及FJY對獼猴桃腐爛率的影響Fig.9 Effects of BS-1 and FJY on the weight loss rates and rot rates of kiwifruit

3 討論與結(jié)論

病原真菌導(dǎo)致果蔬嚴(yán)重的品質(zhì)惡化和產(chǎn)量損失，因此迫切需要探索有效、安全、環(huán)境友好的措施來控制果蔬采前和采后各階段的真菌病害。近些年，諸多研究利用生防細(xì)菌防治果蔬采后病害取得了一定的效果[18-20]。但是關(guān)于B.subtilis對獼猴桃軟腐病的研究相對較少，將FJY用于采后保鮮的研究更少。本研究發(fā)現(xiàn)：B.subtilis菌種BS-1菌液及FJY不僅能抑制獼猴桃軟腐病主要病原菌B.dothidea和D.nobilis平板菌落的擴展，還能降低這兩種病原菌的果實致病力。這為BS-1菌株生物防治獼猴桃軟腐病提供了理論基礎(chǔ)。

FJY具有一定的溫度、紫外和pH耐受性。FJY抑菌效果的穩(wěn)定性為其在獼猴桃采后保鮮劑及軟腐病生防制劑的開發(fā)提供了可能。

本文進(jìn)一步探究了BS-1菌液及其無菌體FJY對獼猴桃采后貨架期貯藏的影響，發(fā)現(xiàn)相比BS-1菌液來說，無菌體FJY具有更好的保鮮效果，可以顯著增強果實硬度，減緩可溶性固形物含量的升高和可滴定酸含量的降低，且顯著降低果實質(zhì)量損失，延長貨架期。這為將FJY開發(fā)為獼猴桃采后保鮮劑奠定了理論基礎(chǔ)。