不同新型冠狀病毒核酸檢測試劑（熒光PCR法）的選擇和臨床應(yīng)用

沈默 周武 梁敏 王忠永

隨著對新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019,COVID-19）的不斷了解，人們對于新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARSCoV-2）核酸檢測的認(rèn)識也逐步深入。實時熒光PCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性是COVID-19確診患者的主要診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[1-3]。但在臨床實際應(yīng)用中，核酸檢測“假陰性”的質(zhì)疑也使核酸檢測試劑盒的質(zhì)量和性能備受關(guān)注。核酸檢測容易受到各種因素，如病程、實驗方法學(xué)、人員因素、采樣、運(yùn)送及保存及病毒本身變異等影響，檢測試劑性能也是重要的影響因素之一[4]。本研究對早期取得注冊證并已在臨床使用的幾種熒光PCR法SARS-CoV-2核酸檢測試劑進(jìn)行性能比較，發(fā)現(xiàn)不同品牌試劑間存在一定差異，提示臨床診療過程中需對試劑性能差異造成的結(jié)果不同引起高度重視，實驗室應(yīng)加強(qiáng)對不同品牌、不同批號試劑的評估，選擇適宜的檢測方案，以利于SARSCoV-2核酸檢測結(jié)果更好地應(yīng)用于臨床。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2020年1月24日至3月20日溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢測樣本共3 284例，以咽拭子和糞便標(biāo)本為主，陽性樣本數(shù)180例，陽性率為5.48%。利用1例隔離病房確診COVID-19患者采集的咽拭子陽性標(biāo)本提取的RNA模板，對市場上華大生物科技（武漢）有限公司（批號：6020200209）、上海之江生物科技有限公司（批號：P20200205）、上海伯杰醫(yī)療科技有限公司（批號：20200202A）、上海捷諾生物科技有限公司（批號：COV2020008）4種不同品牌試劑（分別為A、B、C、D試劑）進(jìn)行評價分析。以選用C試劑為主，A試劑作為復(fù)檢備用試劑的檢測方案在國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心的12個室間質(zhì)評樣本檢測中的應(yīng)用進(jìn)行分析。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 EX3600全自動核酸提取儀、MVR01核酸提取試劑（上海之江生物技術(shù)有限公司）；ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司），4種不同品牌的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒均為國家藥品監(jiān)督管理局審批通過的熒光PCR法檢測試劑；病毒采樣管（友康恒業(yè)生物科技有限公司，型號MT0301-1）。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 標(biāo)本采樣 用病毒采樣管中拭子適度用力拭抹咽后壁部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將無菌拭子放入采集管中，在靠近頂端處折斷無菌拭子桿，旋緊管蓋封閉[5]。

1.2.2.2 核酸提取 核酸提取嚴(yán)格按照試劑說明書操作。提取試劑貨號：Z-ME-0044，型號：MVR01，批號：P20200104。本研究主要評估核酸擴(kuò)增試劑的性能，故統(tǒng)一采用上海之江生物科技股份有限公司的自動提取儀器和提取試劑進(jìn)行核酸提取，利用提取后的核酸模板進(jìn)行平行試驗驗證。

1.2.2.3 標(biāo)本稀釋 確診患者標(biāo)本核酸模板采用DEPC 水進(jìn)行 1×、10×、100×、1 000×、10 000×的梯度稀釋（各稀釋度樣本分別用a～e表示），備用。

1.2.2.4 核酸擴(kuò)增 根據(jù)不同品牌試劑說明書，在ABI 7500熒光定量PCR儀設(shè)置相應(yīng)反應(yīng)程序后擴(kuò)增檢測。不同試劑檢測目的基因靶標(biāo)不同（包括了ORF1ab/RdRp、N和E基因），評估的4種試劑中1種試劑檢測單靶標(biāo)，2種試劑檢測雙靶標(biāo)，1種試劑檢測三靶標(biāo)；3種試劑含內(nèi)標(biāo)。擴(kuò)增體系中模板加樣量1種試劑為10 μl，其余均為5 μl。最低檢測限1種試劑為100 copies/ml，1 種試劑為 500 copies/ml，2 種試劑為1 000 copies/ml。陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)參考各試劑說明書。質(zhì)量控制：每批試驗均帶陰性和陽性對照，陰性和陽性對照檢測結(jié)果在控，則該批次試驗有效，反之無效。所有檢測均進(jìn)行3次重復(fù)，取平均循環(huán)閾值（cycling threshold,Ct）進(jìn)行計算。

1.3 國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心室間質(zhì)評標(biāo)本檢測 使用本實驗室常規(guī)配套使用的兩種檢測試劑（C+A）對2020年3月下發(fā)的編號為202001-202012的12個樣本進(jìn)行檢測，樣本提取方法見1.2.2.2，檢測過程完全按照C試劑和A試劑的說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。對SARS-CoV-2 ORF1ab/RdRp基因的A～D試劑擴(kuò)增組Ct值比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的秩和檢驗。不同品牌試劑的批內(nèi)重復(fù)性用變異系數(shù)（CV）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種試劑重復(fù)檢測結(jié)果比較 4種試劑的基本情況見表1。4種試劑目標(biāo)靶基因ORF1ab/RdRp的重復(fù)檢測結(jié)果Ct值見表2。SARS-CoV-2 ORF1ab/RdRp基因的A～D試劑擴(kuò)增組Ct值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，除了B試劑與D試劑差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余試劑兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。按照4種品牌試劑說明書的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，A試劑5個稀釋度標(biāo)本檢測結(jié)果均為陽性，其余試劑1×、10×、100×稀釋度檢出陽性結(jié)果，低濃度RNA模板標(biāo)本檢測結(jié)果均為陰性，見表3。

表1 4種品牌試劑基本情況表

表2 不同品牌試劑重復(fù)檢測結(jié)果（ORF1ab/RdRp基因）Ct值

表3 不同稀釋度標(biāo)本用4種品牌試劑檢測的結(jié)果

2.2 4種品牌試劑靈敏度比較 各選取每個稀釋度中1次ORF1ab/RdRp基因擴(kuò)增曲線，檢測結(jié)果見圖1。其中A試劑5個稀釋度均呈現(xiàn)陽性擴(kuò)增（最后一個稀釋度3次重復(fù)試驗出現(xiàn)2次陽性擴(kuò)增），B和C試劑有3個稀釋度呈現(xiàn)陽性擴(kuò)增，后2個稀釋度為陰性，D試劑ORF1ab/RdRp基因5個稀釋度均無陽性擴(kuò)增（該試劑N基因3個稀釋度有陽性擴(kuò)增）。結(jié)果顯示A試劑靈敏度最高，B、C靈敏度類似，D試劑ORF1ab/RdRp基因檢出存在較大問題，未見陽性擴(kuò)增曲線。通過4種品牌試劑的ORF1ab/RdRp基因Ct值比較，A試劑比C試劑提早1～2個循環(huán)，C試劑比B試劑提早1～3個循環(huán)。

圖1 4種品牌試劑ORF1ab/RdRp基因5個稀釋度擴(kuò)增的曲線圖（a：A試劑；b：B試劑；c：C試劑；d：D試劑）

2.3 重復(fù)性試驗 4種品牌試劑每個稀釋度重復(fù)檢測3次，ORF1ab/RdRp基因（D試劑采用N基因）擴(kuò)增重復(fù)性見圖2，A試劑重復(fù)性最好，C試劑次之。不同品牌試劑重復(fù)檢測結(jié)果的Ct值變化CV見表4。

表4 4種品牌試劑ORF1ab/RdRp基因Ct均值和重復(fù)檢測結(jié)果的CV

圖2 4種品牌試劑ORF1ab/RdRp基因不同稀釋度重復(fù)性試驗擴(kuò)增曲線圖（a：A試劑；b：B試劑；c：C試劑；d：D試劑N基因）

2.4 A、B、C 3種品牌試劑除ORF1ab/RdRp基因外，D試劑除N基因外其他靶標(biāo)基因檢出情況 A試劑為單標(biāo)靶，無其他靶標(biāo)基因；B試劑為三標(biāo)靶，其N基因與E基因的檢測曲線見圖3；C試劑為雙標(biāo)靶，其N基因檢出見圖3；D試劑為雙靶標(biāo)，其除N基因外的ORF1ab/RdRp基因所有稀釋度標(biāo)本中均無擴(kuò)增。B試劑的E基因和C試劑的N基因擴(kuò)增曲線要優(yōu)于B試劑的N基因擴(kuò)增，見圖3。

圖3 B、C兩種品牌試劑其他靶標(biāo)基因擴(kuò)增曲線圖（a：B試劑N基因；b：B試劑E基因；c：C試劑N基因）

2.5 國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心室間質(zhì)評標(biāo)本的檢測結(jié)果 C試劑為主要檢測試劑，A試劑作為復(fù)檢備用試劑，檢測結(jié)果見表5。

表5 C試劑和A試劑檢測國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心室間質(zhì)評標(biāo)本結(jié)果

3 討論

COVID-19疫情屬于突發(fā)公共衛(wèi)生事件，傳播迅速且廣泛，給人民的生命健康帶來了極大的威脅，這使得SARS-CoV-2短時間內(nèi)成為全球關(guān)注的焦點。2020年1月7日，研究人員從1例武漢患者體內(nèi)成功分離出病毒并進(jìn)行了全基因組測序[6-7]，疫情形勢嚴(yán)峻的特殊情況下，各廠家在較短時間內(nèi)完成了核酸檢測試劑盒的研發(fā)，不可否認(rèn)，核酸檢測試劑盒應(yīng)用于臨床給COVID-19的診療提供了強(qiáng)有力的支持，但短時期內(nèi)多種試劑通過應(yīng)急審批上市，各核酸檢測試劑的質(zhì)量和性能參數(shù)可能并不盡如意，而且在應(yīng)用過程中試劑也在不斷更新和優(yōu)化，導(dǎo)致部分品牌試劑存在較大的批次間差異，臨床使用過程中發(fā)現(xiàn)，部分試劑不同批次間的差異甚至非常之大。本研究僅針對各品牌試劑的某一個批號試劑進(jìn)行評估，對不同批號試劑可能存在的性能差異未進(jìn)行研究，但根據(jù)實驗室工作經(jīng)驗，仍提醒實驗室人員在進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測時務(wù)必關(guān)注試劑批號變更可能帶來的檢測結(jié)果誤差，應(yīng)按規(guī)定做相應(yīng)的性能驗證，以滿足實驗室檢測的要求[8]。

本研究比較了4種品牌試劑對同一例COVID-19患者咽拭子標(biāo)本提取的核酸模板不同稀釋度樣本的檢測結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)，不同品牌試劑檢測ORF1ab/RdRp基因的結(jié)果 Ct值存在差異；4種試劑檢測ORF1ab/RdRp基因的靈敏度也不同；A試劑批內(nèi)重復(fù)檢測結(jié)果優(yōu)于其他3種試劑?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，不同品牌試劑之間檢測能力存在明顯差異，4種試劑的靈敏度、重復(fù)性均存在一定差別，究其原因，存在以下幾種可能：（1）與試劑的引物、探針設(shè)計有關(guān)；（2）與引物、探針的穩(wěn)定性有關(guān)；（3）不同試劑的不同靶標(biāo)基因檢測能力存在一定的差異。相對而言，高濃度核酸模板不同試劑檢測定性結(jié)果一致性較好，隨著核酸模板稀釋度加大，不同試劑檢測結(jié)果不一致，試劑盒的最低檢測限如果不能滿足低濃度樣本的檢測，可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果[9]。雖然目前SARS-CoV-2熒光PCR試劑均為定性試劑，且各廠家均在試劑說明書中列出了各自的最低檢測限，但由于臨床實驗室很難做到采用定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評估其靈敏度，故采用梯度稀釋方法對不同品牌的試劑進(jìn)行相對比較仍不失為一個簡單有效的評估方法。4種SARS-CoV-2核酸擴(kuò)增檢測試劑的檢測能力有差異，尤其對于弱陽性標(biāo)本的檢測差異明顯，部分試劑的準(zhǔn)確性、靈敏度及重復(fù)性欠佳，亟需進(jìn)一步優(yōu)化，提高其性能，以便更好地適應(yīng)臨床篩查的需求，減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

基于對不同品牌試劑的評估，結(jié)合試劑本身的特性和臨床需求，本研究采用C試劑作為主要檢測試劑，A試劑作為復(fù)檢備用試劑的SARS-CoV-2核酸檢測方案。采用該方案檢測國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心室間質(zhì)評標(biāo)本，結(jié)果全部符合預(yù)期結(jié)果。國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心發(fā)布的《全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質(zhì)量評價結(jié)果報告》對除202003和202009外的10個樣本進(jìn)行了統(tǒng)計，公布的樣本信息顯示：樣本 202001、202005、202006、202007、202012 不含SARS-CoV-2核酸，預(yù)期結(jié)果應(yīng)該為陰性，本研究選用的兩種試劑檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致，其中樣本2020001含有SARS，2020012含MERS和OC43等其他冠狀病毒成分，C試劑和A試劑均未檢出陽性結(jié)果，選用試劑的特異性符合要求；202002、202004、202008、202010、202011均為SARS-CoV-2陽性樣本，核酸濃度分別為 640、3.2×103、1.6×104、128、8.0×104copies/ml，按照說明書標(biāo)明的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，C試劑檢測樣本202002 和 202004（濃度為 640 和 3.2×103copies/ml）出現(xiàn)了假陰性結(jié)果，A試劑復(fù)檢得出陽性結(jié)果，保證了低濃度檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。樣本202010由于核酸濃度只有128 copies/ml，兩種試劑均未檢出陽性結(jié)果，國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心的評價原則500 copies/ml以上的樣本要求檢出，因此該標(biāo)本的陰性結(jié)果不作為假陰性判定，統(tǒng)計結(jié)果也顯示，該樣本的總體符合率只有0.6%（931份結(jié)果中6份陽性）。樣本2020028和202011兩種試劑均檢測陽性結(jié)果，與預(yù)期結(jié)果符合。A試劑作為復(fù)檢試劑，對C試劑起到一定的補(bǔ)充作用，能夠大大減少低濃度樣本的漏檢率，減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。兩種試劑組合的臨床應(yīng)用基本滿足需求。

本研究僅針對部分品牌的某一批號試劑性能進(jìn)行簡單評估，并不一定能全面反映試劑性能。另外，本研究僅針對SARS-CoV-2核酸擴(kuò)增試劑進(jìn)行比較，未對不同試劑間的提取方法和效率進(jìn)行評估。作為疫情下最為重要和常用的實驗室判斷手段，熒光PCR病毒核酸檢測具有極其重要的作用，實驗室人員應(yīng)重視不同試劑間的性能差異，選用高性價比試劑。實驗室在充分評估試劑性能的基礎(chǔ)上，在臨床實際應(yīng)用中最好在常規(guī)使用試劑的基礎(chǔ)上準(zhǔn)備1～2種備用試劑，作為對與臨床或影像學(xué)特征不符的可疑結(jié)果的補(bǔ)充驗證試劑，以避免出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。