抗交叉反應(yīng)性糖類決定簇抗體吸附劑在過敏原體外檢測中的應(yīng)用價(jià)值

王燕 朱澤華 汪明星 貴志芳 劉玉華 張臘紅

目前過敏性疾病已越來越普遍，它可發(fā)生在各個(gè) 年齡階段，以老人和兒童發(fā)病率稍高。據(jù)世界變態(tài)反應(yīng)組織（WAO）統(tǒng)計(jì)，近30年間過敏性疾病的發(fā)生率至少增加了3倍，目前全球總患病率已達(dá)30%，過敏已成全球第六大疾病[1-2]。在我國，過敏性疾病發(fā)病率也呈逐年遞增的趨勢，已成為嚴(yán)重影響我國人群健康的常見疾病之一[3]。

過敏性疾病是由變應(yīng)原引發(fā)人體變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致的一類疾病，常累及呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和皮膚等，臨床表現(xiàn)形式多樣，常見皮膚濕疹、過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性腸炎、蕁麻疹以及結(jié)膜炎等，其診治有賴于過敏原的確定。目前常規(guī)確診方法是檢測血清變應(yīng)原特異性IgE（specific IgE,sIgE）。然而通常使用的免疫印跡法檢測sIgE結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，導(dǎo)致檢測結(jié)果與臨床診斷不相符合[4-5]。目前公認(rèn)的交叉反應(yīng)性糖類決定簇（cross-reactive carbohydrate determinants,CCD）是一個(gè)可引起非特異性陽性結(jié)果的潛在干擾源，從而出現(xiàn)假陽性[6-7]，部分廠家在檢測試劑條中添加了CCD指示帶，提示CCD陽性引起的干擾，但是如何排除此干擾尚未定論。本研究采用抗CCD抗體吸附劑處理CCD指示帶陽性和陰性的過敏原sIgE陽性患者樣本，旨在排除CCD引起的干擾，同時(shí)觀察吸附劑處理后對(duì)過敏原真陽性結(jié)果是否有影響，使實(shí)驗(yàn)室結(jié)果更準(zhǔn)確，指導(dǎo)臨床醫(yī)生進(jìn)行更有針對(duì)性的治療。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2018年12月至2019年9月杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)過敏原檢測的92例sIgE陽性患者的靜脈血樣本，其中CCD指示帶陽性62例（CCD陽性組），陰性30例（CCD陰性組）。CCD陽性組男39例（62.9%），女 23例（37.1%），年齡 4～88（43.87±17.12）歲；CCD陰性組男 18例（60.0%），女12例（40.0%），年齡 2～87（40.60±27.80）歲。兩組患者性別、年齡的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器 過敏原檢測試劑及抗CCD抗體吸附劑由德國歐蒙公司提供，具體為特異性變態(tài)反應(yīng)原檢測試劑盒（試劑批號(hào)：A181128AO）；抗CCD抗體吸附劑（試劑批號(hào)：A190723AF）。儀器為德國歐蒙公司EUROBLOTMaster（Ⅱ）免疫印跡法自動(dòng)操作儀、EURO Line Camera掃描儀掃描和EUROLineScan3.4.25判讀系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 使用內(nèi)含促凝劑的快速血清管，采集進(jìn)行過敏原檢測的患者空腹外周靜脈血3～4 ml，室溫靜置30 min，3 500 r/min離心5 min用于本項(xiàng)目檢測。

1.3.2 抗CCD抗體吸附劑復(fù)溶 將1支抗CCD抗體吸附劑（凍干粉）溶于110 μl蒸餾水，室溫放置20 min后，再用漩渦混勻器充分混勻30 s，17 000 r/min離心30 s并收集復(fù)溶液；溫育：按吸附劑與血清1∶20的比例將抗CCD抗體吸附劑加入待測樣本中，搖床上室溫25℃溫育1 h。

1.3.3 CCD被吸附后樣本的檢測 抗CCD抗體吸附劑處理前后的樣本采用免疫印跡法檢測血清樣本中的CCD IgE及sIgE的表達(dá)情況，具體按照試劑盒說明書操作。CCD IgE及19種特異性過敏原均采用分級(jí)報(bào)告，具體為：兩組膜條用EURO Line Camera掃描儀收集數(shù)據(jù)后，EUROLineScan 3.4.25判讀軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)條帶著色強(qiáng)度自動(dòng)判讀結(jié)果，分0～6級(jí)，著色越深級(jí)別越高，表示抗體水平越高。過敏原的檢測膜條共包括20種成分，分別為：CCD、10種吸入性過敏原（樹木組合、豚草、艾蒿、塵螨、屋塵、貓毛、狗上皮、蟑螂、霉菌組合、葎草）、9種食入性過敏原（雞蛋白、牛奶、花生、黃豆、牛肉、羊肉、海洋魚類組合、蝦、蟹）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者經(jīng)CCD抗體吸附劑處理后CCD指示帶的變化情況 CCD陽性組經(jīng)抗CCD抗體吸附劑處理后61例轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰比例為98.4%（61/62），級(jí)別下降1例，通過加大吸附劑的濃度后也轉(zhuǎn)陰；CCD陰性組經(jīng)處理后檢測結(jié)果無變化，見表1。

表1 兩組患者經(jīng)CCD抗體吸附劑處理后CCD指示帶的變化情況

2.2 92例樣本陽性條帶個(gè)數(shù)在吸附劑處理前后的變化情況 CCD陽性組樣本在吸附劑處理前有60例樣本的陽性條帶數(shù)集中分布在5～11條，經(jīng)CCD吸附劑處理后減為0～6條；1例樣本陽性條帶數(shù)由1條減為0條；另外有1例樣本陽性條帶數(shù)由18條減為17條，此樣本條帶數(shù)變化雖不明顯，但相應(yīng)級(jí)別均下降。CCD陰性組陽性條帶數(shù)集中分布在1～4條，在吸附劑處理后不受影響，見圖 1、2。

圖1 抗交叉反應(yīng)性糖類決定簇（CCD）抗體吸附劑處理前后CCD陽性組陽性條帶數(shù)的變化

2.3 CCD陽性組sIgE經(jīng)吸附劑處理后其它特異性陽性條帶的變化情況 抗CCD抗體吸附前，62例CCD陽性組中sIgE陽性條帶總數(shù)為499條，吸附后陽性條帶總數(shù)為116條，下降了76.8%。處理后各過敏原檢測條帶轉(zhuǎn)陰比例由高到低分別為：花生（95.0%）、葎草（94.9%）、樹木組合（91.8%）、艾蒿（91.7%）、豚草（91.7%）、黃豆（87.0%）、蟑螂（66.0%）和蟹（61.7%），且與吸附劑處理前后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。其它過敏原在吸附劑處理前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 CCD陽性組sIgE陽性條帶在吸附劑處理前后的變化情況

2.4 CCD陽性組sIgE在吸附劑處理前后檢測值的變化情況 CCD陽性組血清經(jīng)抗CCD抗體吸附劑處理后吸入性過敏原sIgE中的樹木組合、豚草、艾蒿、蟑螂和葎草與食入性過敏原sIgE中的花生、黃豆和蟹的檢測值明顯減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而其他過敏原sIgE值在吸附劑處理前后差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖3。

圖2 抗交叉反應(yīng)性糖類決定簇（CCD）抗體吸附劑處理前后CCD陰性組陽性條帶數(shù)的變化

圖3 交叉反應(yīng)性糖類決定簇（CCD）抑制劑處理前后各特異性IgE（sIgE）的變化（與處理前比較，*P＜0.05）

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活飲食習(xí)慣的改變，新生的、合成的、轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物層出不窮，過敏性疾病的發(fā)病率逐年增加，已成為嚴(yán)重影響人群健康的常見疾病之一[3]。患者就診時(shí)，醫(yī)生通過分析患者臨床資料結(jié)合實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)變應(yīng)原sIgE檢測是目前Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)病診斷的主要依據(jù)。然而，血清變應(yīng)原sIgE檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果常存在差異，特別是血清中存在CCD導(dǎo)致的交叉反應(yīng)是造成兩者不符合的重要原因之一[8]。

CCD是一類廣泛存在于動(dòng)植物糖蛋白中的糖類基團(tuán)[9]，其結(jié)構(gòu)保守，不同物種來源的過敏原（昆蟲、貝類、植物花粉、水果和乳膠等）中CCD存在相似性，可誘導(dǎo)人體產(chǎn)生與多種變應(yīng)原發(fā)生交叉反應(yīng)的抗CCD特異性IgE（anti-CCD IgE）。由于anti-CCD IgE的存在，檢測結(jié)果中不能區(qū)分是由抗過敏原蛋白表位IgE抗體引起的陽性反應(yīng)，還是anti-CCD IgE引起的交叉反應(yīng)造成的假陽性結(jié)果。一般anti-CCD IgE不引起變態(tài)反應(yīng)癥狀，沒有臨床意義[10]，但其免疫原性對(duì)過敏原體外檢測結(jié)果的干擾作用卻不容忽視。有文獻(xiàn)報(bào)道約15%～30%的過敏患者能夠檢測到anti-CCD IgE抗體，且出現(xiàn)多種條帶陽性，這就給臨床鑒定特異性過敏原帶來了一定的困難[11]。

使用CCD吸附劑可有效降低特異性過敏原假陽性的發(fā)生，據(jù)報(bào)道一些研究機(jī)構(gòu)應(yīng)用不同的吸附劑，如加入辣根過氧化物酶（HRP）、菠蘿蛋白酶糖基肽（MUXF）和含CCD的油菜花粉等去除CCD干擾引起假陽性的檢測中[12-16]，但尚未有公認(rèn)的解決方案。本研究直接使用抗CCD抗體吸附劑處理樣本，通過對(duì)比處理前后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，62例CCD陽性指示帶樣本經(jīng)抗CCD抗體吸附劑處理后有61例CCD陽性指示帶轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰比例為98.4%，還有1例級(jí)別下降，通過加大吸附劑的濃度后也轉(zhuǎn)陰。CCD陽性組陽性條帶數(shù)在吸附后明顯下降，而CCD陰性組無變化，說明抗CCD抗體吸附劑能抑制anti-CCD IgE對(duì)過敏原陽性結(jié)果的干擾，而對(duì)真陽性樣本不產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)CCD陽性組樣本陽性條帶數(shù)集中分布在5～11條，CCD陰性組樣本陽性條帶數(shù)集中分布在1～4條，說明多種變應(yīng)原陽性時(shí)，anti-CCD IgE對(duì)sIgE檢測干擾的可能性就越大，這與莫燕芳等[17]的研究結(jié)果一致。因此當(dāng)有多項(xiàng)sIgE陽性時(shí)，提示可能會(huì)有anti-CCD IgE的干擾，在臨床診斷過敏性疾病過程中應(yīng)充分考慮anti-CCD IgE的影響。

經(jīng)CCD抗體吸附劑處理后各過敏原檢測條帶轉(zhuǎn)陰比例由高到低分別為花生、葎草、樹木組合、豚草、艾蒿、黃豆、蟑螂和蟹，且檢測值明顯降低，說明其易受anti-CCD IgE的干擾。另在本次研究中有30例塵螨sIgE陽性的樣本，經(jīng)CCD吸附劑處理后仍有27例樣本的塵螨sIgE陽性，說明塵螨sIgE不易受CCD吸附劑的影響，其他過敏原由于陽性樣本例數(shù)過少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，對(duì)過敏性疾病首先應(yīng)盡快明確其過敏原，目前結(jié)合臨床癥狀和血清sIgE的檢測是臨床診斷過敏性疾病的主要手段，在遇到多項(xiàng)變應(yīng)原檢測結(jié)果同時(shí)陽性或與臨床癥狀不符時(shí)，更要提高警惕，應(yīng)將anti-CCD IgE考慮其中，若CCD指示帶陽性，可再補(bǔ)充抗CCD抗體吸附劑預(yù)處理實(shí)驗(yàn)，以消除anti-CCD IgE引起的交叉反應(yīng)對(duì)結(jié)果的干擾，提升檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

對(duì)于上述易受CCD干擾的過敏原種類，在后期研究中筆者將進(jìn)一步分析這些過敏原是否存在類似的分子結(jié)構(gòu)與生物特征，探討其與CCD的關(guān)聯(lián)性。此外，隨著DNA技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，變應(yīng)原分子診斷（molecular-based allergy,MA）不斷被識(shí)別克隆，后期可將MA技術(shù)引入過敏性的研究中，通過分子水平上的精確定位識(shí)別患者真正的致敏組分和引起交叉反應(yīng)的變應(yīng)原組分，以建立準(zhǔn)確評(píng)估過敏原檢測的分析系統(tǒng)，幫助醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行正確的過敏風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及有效和優(yōu)化的治療。