• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于小RNA技術(shù)的天津地區(qū)番茄花葉病毒分子檢測與基因組部分序列分析

    2021-11-01 07:04:14金鳳媚孫海波郝志愚
    華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:花葉病毒相似性基因組

    金鳳媚,薛 俊,孫海波,郝志愚

    (天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,天津 300192)

    番茄(LycopersiconesculentumMill.)在我國種植面積較大,在保證蔬菜供應(yīng)上占有重要地位。近年來,在番茄產(chǎn)區(qū),番茄病毒病發(fā)生嚴(yán)重,在天津地區(qū)發(fā)生的主要病毒病有番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)、番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)、番茄斑萎病毒(Tomatospottedwildvirus,TSWV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)等[1-3]。

    ToMV為正義單鏈RNA病毒,屬于帚狀病毒科(Virgaviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)。基因組共有4個(gè)開放閱讀框,分別編碼外殼蛋白(Coat Protein,CP)、運(yùn)動(dòng)蛋白(Movement Protein,MP)以及與復(fù)制相關(guān)的126 ku蛋白和183 ku蛋白[4]。由于ToMV與煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)親緣關(guān)系很近,所以在早期報(bào)道中,將ToMV稱為TMV番茄分離物[5]。近年來,鑒于ToMV和TMV在生物學(xué)、血清學(xué)和核酸序列等方面的不同,ToMV被作為一種獨(dú)立的病毒進(jìn)行研究[6]。ToMV的寄主很多,番茄是該病的主要寄主。ToMV侵染番茄后葉片出現(xiàn)花葉病狀,有的還會(huì)導(dǎo)致葉片變形,植株矮縮,甚至死亡。果實(shí)會(huì)出現(xiàn)著色不均,或出現(xiàn)凹陷的褐色病斑[7]。

    近年來,天津市西青區(qū)和寶坻區(qū)的部分番茄產(chǎn)區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了疑似番茄花葉病毒引起的醬油果。由于其表現(xiàn)非常類似于由低溫引起的番茄轉(zhuǎn)色不良而產(chǎn)生的醬油果,導(dǎo)致很多農(nóng)戶錯(cuò)誤地采取噴施營養(yǎng)肥和提高棚室地溫的措施,病株也未見明顯好轉(zhuǎn),嚴(yán)重影響了番茄果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此,明確這種番茄病的病原已迫在眉睫。

    本研究利用小RNA 深度測序及RT-PCR 技術(shù)對(duì)天津地區(qū)番茄病株樣本進(jìn)行了病原的分子鑒定及基因組序列分析,旨在明確引起該病的病原,同時(shí)為該病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    2020年5-6月份在天津市西青區(qū)和寶坻區(qū)日光溫室番茄栽培田中,采集發(fā)病的番茄果實(shí)樣本,保存于-80 ℃冰箱內(nèi),用于RNA提取及后續(xù)試驗(yàn)。

    菌株與載體:大腸桿菌DH5α,T-easy 載體均購自寶生物工程有限公司。

    試劑:RNA提取試劑、RNase Inhibitor、M-MLV均購自寶生物工程有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 小RNA深度測序 對(duì)所采集的番茄果實(shí)的小RNA進(jìn)行測序。2020年5月選取10株顯癥植株并各自采1個(gè)果實(shí)。從每個(gè)果實(shí)的發(fā)病部位各取0.1 g 組織,然后進(jìn)行混合,提取混合樣小RNA。利用試劑盒(Small RNA Sample Pre Kit,Illumina公司)構(gòu)建文庫,然后利用測序儀(Illumina HiSeq4000)進(jìn)行深度測序,除雜后利用軟件(Velvet assembler)獲得拼接序列(Contigs),將拼接序列與NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nig.gov)病毒數(shù)據(jù)庫中的已知病毒基因組序列進(jìn)行比對(duì),初步判斷樣品中病毒的種類。上述測序及分析工作委托上海伯豪基因科技有限公司完成。

    1.2.2 RT-PCR驗(yàn)證 根據(jù)陳利達(dá)等[8]設(shè)計(jì)的引物檢測TMV,廖富榮等[9]設(shè)計(jì)的檢測ToMV的引物,陳靈芝等[10]設(shè)計(jì)的引物檢測番茄斑駁病毒(Tomatomottlevirus,ToMMV)(表1)。利用RT-PCR對(duì)小RNA測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。采用TRIzol試劑提取番茄感病果實(shí)的總RNA,以其為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,體系為:模板RNA 1 μL,Random引物1 μL,dNTP 0.5 μL,用DEPC處理水補(bǔ)足10 μL。65 ℃變性5 min,迅速置于冰上2 min,離心后,加入下列試劑:5×M-MLV Buffer 5 μL,RTaseM-MLV 1 μL,RNAase Inhibitor 0.5 μL,總體積10 μL。先用30 ℃保溫10 min,然后42 ℃保溫60 min,最后70 ℃保溫15 min。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T-easy載體,由TaKaRa公司完成測序。對(duì)10 株田間樣品進(jìn)行檢測,根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小以及測序結(jié)果鑒定樣品中的病毒種類。

    表1 病毒 RT-PCR 檢測引物Tab.1 Primers for RT-PCR detection

    1.2.3 ToMV天津分離物(ToMV-TJ)全基因組序列 取受侵染的番茄病株果實(shí),抽提總RNA,以美國分離物(USA_99-1)(GenBank:KR537870.1)基因組序列為參照,參考隋雪蓮[11]設(shè)計(jì)的部分引物,共設(shè)計(jì)9對(duì)覆蓋全基因組的PCR引物(表2),采用RT-PCR法獲得病毒基因組擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)體系同上所述,擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T-easy載體上后由TaKaRa公司完成測序。利用 DNAStar 軟件對(duì)上述9對(duì)引物擴(kuò)增所得產(chǎn)物序列進(jìn)行拼接。

    表2 ToMV-TJ全基因組擴(kuò)增用到的PCR引物Tab.2 Primers for determination of ToMV-TJ genomic sequence

    1.2.4 序列分析 利用Blast(www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST/)進(jìn)行序列比較,利用MEGA 5.05進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建,利用DNAStar進(jìn)行序列相似性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 田間病株的癥狀

    番茄植株感病后主要表現(xiàn)為果實(shí)表面有醬油色斑塊,病斑大小不一,一般呈圓形。多從果肩開始發(fā)病,初期斑塊顏色淡,后期病斑變?yōu)榘岛稚磷睾稚?,邊緣明顯,微凹陷。植株葉片和莖植無明顯癥狀。植株感病后期坐果減少(圖1)。

    2.2 小RNA深度測序檢測番茄樣品中病毒種類

    對(duì)感病番茄的果實(shí)進(jìn)行高通量測序,獲得Raw reads共81 133 750條,去除不合格reads,得到Clean reads共79 534 404條。利用Velnet軟件將測序獲得的小RNA拼接組裝成病毒的Contigs,經(jīng)與GenBank中報(bào)道的病毒序列進(jìn)行比對(duì),其中5條比對(duì)到ToMMV,114條比對(duì)到ToMV,8條比對(duì)到TMV。測序結(jié)果初步表明,混合樣品中可能含有以上3種病毒。

    2.3 利用RT-PCR對(duì)小RNA測序結(jié)果的驗(yàn)證

    利用檢測ToMMV、ToMV和TMV 3種病毒的特異引物(表1),對(duì)感病果實(shí)進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果表明,利用檢測ToMV和ToMMV特異引物To-F/R和spe-F/R均能從感病果實(shí)中擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物(圖 2)。而檢測TMV的特異引物不能擴(kuò)增到預(yù)期產(chǎn)物,初步判斷病原可能為ToMV和(或)ToMMV。利用表2中的引物進(jìn)行擴(kuò)增,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,將測序結(jié)果利用Blast進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明,擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與ToMV美國99-1分離物的相似性均在98%以上,證明引起番茄果實(shí)壞死斑癥狀的病原為ToMV。

    2.4 番茄花葉病毒天津分離物序列測定及分析

    利用ToMV-F1/R1~ToMV-F9/R9引物,對(duì)病樣進(jìn)行RT-PCR檢測,均得到目的條帶(圖3),將目的條帶克隆并測序,組合后得到了ToMV-TJ的全基因組序列,提交至 GenBank數(shù)據(jù)庫,登錄號(hào)為MW042871。序列分析表明,ToMV-TJ全序列共6 383個(gè)核苷酸,有4個(gè)開放閱讀框,分別編碼126 ku的復(fù)制酶相關(guān)蛋白,183 ku的蛋白(由126 ku蛋白通讀產(chǎn)生,與病毒復(fù)制有關(guān)),運(yùn)動(dòng)蛋白和外殼蛋白,這與其他地區(qū)的ToMV基因組結(jié)構(gòu)一致。

    利用Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對(duì)天津地區(qū)發(fā)生的ToMV基因組部分序列進(jìn)行比對(duì)。在眾多比對(duì)結(jié)果中,選擇了一些具有代表性的分離物序列進(jìn)行同源性的分析。這些序列為國內(nèi)已報(bào)道番茄花葉病毒分離物以及世界不同地區(qū)有代表性的分離物(表3)。

    表3 其他ToMV毒株來源Tab.3 Other sources of ToMV strains

    利用MEGA 5.05軟件對(duì)CP蛋白的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖4)。結(jié)果表明,大部分分離物形成一個(gè)大分支,證明這些分離物的CP蛋白進(jìn)化關(guān)系很近,該蛋白很保守。天津分離物(ToMV-TJ)與美國(USA_99-1)和墨西哥(Mexico_M4)分離物關(guān)系最近。與斯洛伐克(Slovakia_SL-1)分離物的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。該進(jìn)化關(guān)系圖部分地區(qū)體現(xiàn)出病毒的區(qū)域相似性,如哈薩克斯坦的2個(gè)分離物(Kazakhstan_K1、Kazakhstan_K2)和越南的2個(gè)分離物(Viet_Nam_BaoLoc、Viet_Nam_chili),以及中國臺(tái)灣China_Taiwan_Penghu)、內(nèi)蒙古(China_Neimenggu)、杭州(China_Hangzhou)分離物分別聚在了一起。

    對(duì)該基因的運(yùn)動(dòng)蛋白基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖5)。結(jié)果表明,與CP蛋白基因類似,天津分離物(ToMV-TJ)與美國(USA_99-1)和墨西哥(Mexico_M4)分離物和埃及(Egypt_AH4)關(guān)系最近。大部分分離物形成一個(gè)大分支,只有英國分離物(UK_FERA)的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。同樣地,該進(jìn)化關(guān)系圖部分地區(qū)

    體現(xiàn)出病毒的區(qū)域相似性,如哈薩克斯坦的2個(gè)分離物(Kazakhstan_K1、Kazakhstan_K2),中國新疆(China_Xinjiang)和杭州(China_Hangzhou),越南的2個(gè)分離物(Viet_Nam_BaoLoc、Viet_Nam_ chili),以及地理距離很近的斯洛文尼亞(Slovenia_WW17-I-f16-18-Nocc-pos2 )和斯洛伐克(Slovakia_SL-1)分別聚在了一起。

    與前2個(gè)蛋白類似,126蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明(圖6),大部分的分離物都形成了一個(gè)大分支,天津分離物(ToMV-TJ)與美國分離物(USA_99-1)的進(jìn)化關(guān)系最近。同樣地,該進(jìn)化關(guān)系圖部分地區(qū)體現(xiàn)出病毒的區(qū)域相似性,如中國新疆(China_Xinjiang)、中國杭州(China_Hangzhou)、中國山東(China_Shangdong)分離物聚在一起;哈薩克斯坦的2個(gè)分離物(Kazakhstan_K1、Kazakhstan_K2)聚在一起。

    2.5 相似性分析

    為進(jìn)一步了解ToMV-TJ分離物與國內(nèi)外其他地區(qū)分離物的序列相似性,利用DNAStar ClustralW軟件進(jìn)行了相似性分析(表4)。其中,CP蛋白基因與越南的分離物(Viet_Nam_chili)的相似性最低為79.8%,與美國(USA_99-1)的分離物相似性最高為99.8%。與其他CP蛋白基因分離物的平均相似性為95.53%。該基因編碼的蛋白與哈薩克斯坦K2分離物(Kazakhstan_K2)的相似性最低為96.6%,與美國(USA_99-1)的分離物、中國新疆(China_Xinjiang)、中國山東(China_Shandong)、埃及(Egypt_AH4)、墨西哥(Mexico_M4)、韓國(South Korea_GW2)、烏干達(dá)(Uganda_ToMV0Ug)、越南(Viet_Nam_Baoloc)、英國(UK_FERA)相似性最高為100%。與其他地區(qū)分離物的平均相似性為99.10%。

    表4 ToMV-TJ分離物與其他國家和地區(qū)分離物的相似性分析Tab.4 The identities of ToMV-TJ isolate with reference ToMV in different country and regions %

    MP蛋白基因與越南的分離物(Viet_Nam_chili)的相似性最低為75.8%,與美國(USA_99-1)的分離物相似性最高為99.8%。與其他MP蛋白基因分離物的平均相似性為95.21%。該基因編碼的蛋白與中國北京的分離物(China_Beijing)的相似性最低為98.5%,與美國(USA_99-1)等大部分的分離物(Australia_Queensand、China_Neimenggu、China_Shandong、China_Xinjiang、China_Hangzhou、Egypt_AH4、Germany_ToMV1-2、Japan_L11Y、Japan_Fukushima、Kazakhstan_K1、Kazakhstan_K2、Mexico_M4、South Korea_ GW2、Uganda_ToMV-Ug、Viet_Nam_Baoloc、Viet_Nam_chili)相似性為100%。平均相似性為99.26%。

    126蛋白基因與越南的分離物(Viet_Nam_chili)的相似性最低為64.6%,與中國山東(China_Shandong)的分離物相似性最高為99.7%。與其他126蛋白基因分離物的平均相似性為92.72%。該基因編碼的蛋白與中國北京的分離物(China_Beijing)的相似性最低為99.00%,與美國99-1等其他的分離物的相似性在99.0%~99.7%,平均相似性為99.0%。

    對(duì)CP、MP和126蛋白3個(gè)基因和蛋白相似性分析表明,這3個(gè)基因在核苷酸水平的保守性CP蛋白最強(qiáng),MP次之,126蛋白最弱。而在蛋白水平MP最強(qiáng),CP次之,126蛋白最弱,相似性平均在99.0%以上,且蛋白的平均相似性大于核苷酸的平均相似性。這說明ToMV編碼的這3個(gè)蛋白在全世界范圍內(nèi)的變異頻率不是很高,保守性很強(qiáng),而且該病毒的基因變異大部分屬于無義突變。

    3 討論

    Small RNA測序技術(shù)已在植物病毒鑒定中得到廣泛應(yīng)用[12-13]。本研究應(yīng)用該技術(shù)對(duì)天津地區(qū)發(fā)生的番茄果實(shí)褐化的病原檢測出3種病毒。進(jìn)一步結(jié)合RT-PCR和測序技術(shù)確定該病為ToMV引起,而不是一種生理性病害,這為今后的該病防治提供了理論依據(jù)。

    3.1 天津地區(qū)ToMV的序列分析

    本研究中,對(duì)該病毒的外殼蛋白CP和運(yùn)動(dòng)蛋白MP以及編碼的126蛋白進(jìn)行了克隆和序列分析。通過分析可以看出,天津地區(qū)的病毒分離物與空間距離較遠(yuǎn)的美國、墨西哥分離物同源關(guān)系較近。這在一定程度上說明,此病毒的天津分離物可能是由于貿(mào)易活動(dòng)隨種子或種苗從國外帶到本地,并進(jìn)行了為害。廖富榮等[9]報(bào)道在進(jìn)口的番茄種中檢測出ToMV。番茄花葉病毒雖然在我國很多地方均有報(bào)道[3,14-16],但是各地發(fā)生的情況和癥狀不盡相同,致病的病原可能為不同的病毒株系。因此,在番茄種苗調(diào)運(yùn)時(shí)還應(yīng)加強(qiáng)檢疫,避免該病毒隨著番茄種苗在不同地區(qū)的調(diào)運(yùn),加速該病毒的廣泛傳播。

    3.2 ToCV的發(fā)生和防治

    近年來,在天津地區(qū)的番茄上發(fā)生的2個(gè)主病毒病為TYLCV和ToMV[1-2]。自1909年美國首次報(bào)道ToMV的發(fā)生以來,該病已廣泛分布于世界各國的番茄生產(chǎn)區(qū),在中國很多地方也有嚴(yán)重發(fā)生[7,17]。對(duì)該病的防治主要是利用抗病基因進(jìn)行育種。已有研究表明,針對(duì)TMV的抗性基因Tm-2和Tm-22對(duì)ToMV有原始抗性[18-19],生產(chǎn)上很多番茄品種含有這些基因。因?yàn)門oMV是一個(gè)為害番茄很多年的老病害,很多品種含有對(duì)該病害的抗性基因(Tm-22),所以,沒有對(duì)病情進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的診斷,造成了損失。筆者在番茄品種選育過程中也發(fā)現(xiàn)有很多含有Tm-22基因的材料,也能引起病毒的侵染。這可能是因?yàn)椴《净虮旧戆l(fā)生了變異,從而突破了寄主的抗性。對(duì)于上述推測,還需通過構(gòu)建突變體試驗(yàn)、侵染性克隆接種試驗(yàn)等予以驗(yàn)證。近年來,對(duì)于ToMV的防治也有一些其他有益的嘗試,如利用納米氧化鋅增強(qiáng)番茄植株免疫力,提高了番茄對(duì)ToMV的抗性,消除了病毒對(duì)植株長勢的不良影響,已初步顯示出良好的效果[20]。

    3.3 ToCV的檢測

    ToMV與TMV和ToMMV同是帚狀病毒科煙草花葉病毒屬的典型成員,親緣關(guān)系很近,利用血清學(xué)檢測這3種病毒時(shí)有很強(qiáng)的交叉反應(yīng),不能將病毒鑒定區(qū)分開來[4]。在本研究中,在利用小RNA深度測序技術(shù)進(jìn)行病毒的鑒定后再利用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,利用以番茄斑駁病毒基因組序列(KX898034)為模板設(shè)計(jì)的引物均能擴(kuò)增出條帶,但將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序后與ToMV的相似性最高,所以在對(duì)該病毒進(jìn)行檢測時(shí)只是做RT-PCR檢測不能準(zhǔn)確判斷其是否為番茄花葉病毒,要結(jié)合測序結(jié)果進(jìn)行判斷。

    猜你喜歡
    花葉病毒相似性基因組
    一類上三角算子矩陣的相似性與酉相似性
    牛參考基因組中發(fā)現(xiàn)被忽視基因
    淺析當(dāng)代中西方繪畫的相似性
    藜草花葉病毒的研究概述
    中國蔬菜(2016年8期)2017-01-15 14:23:34
    低滲透黏土中氯離子彌散作用離心模擬相似性
    我國甜菜花葉病毒基因與馬鈴薯Y病毒屬其它家族序列的比較與分析
    中國糖料(2015年6期)2015-11-25 08:40:58
    芯片技術(shù)檢測黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    有趣的植物基因組
    基因組生物學(xué)60年
    国产又色又爽无遮挡免| 精品人妻在线不人妻| 性高湖久久久久久久久免费观看| 十八禁人妻一区二区| 夫妻午夜视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 99国产精品免费福利视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 国产男人的电影天堂91| 日本91视频免费播放| 国产一区二区在线观看av| 日日爽夜夜爽网站| 日本五十路高清| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲一区中文字幕在线| 深夜精品福利| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲,欧美精品.| 精品一区二区三区四区五区乱码| 91字幕亚洲| 亚洲精品av麻豆狂野| 日本av手机在线免费观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲avbb在线观看| 各种免费的搞黄视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产91精品成人一区二区三区 | 黄频高清免费视频| 一本久久精品| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 正在播放国产对白刺激| 久久久久久久久免费视频了| 免费观看人在逋| 女性被躁到高潮视频| 天天操日日干夜夜撸| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 麻豆乱淫一区二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 大码成人一级视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 午夜成年电影在线免费观看| av视频免费观看在线观看| 黄片播放在线免费| 啦啦啦 在线观看视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜福利在线免费观看网站| 又黄又粗又硬又大视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 免费在线观看完整版高清| 国产av国产精品国产| 老司机影院毛片| 在线 av 中文字幕| 久久九九热精品免费| 黄片大片在线免费观看| 妹子高潮喷水视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费黄频网站在线观看国产| 人妻人人澡人人爽人人| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲国产精品一区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久中文字幕一级| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产不卡av网站在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 97在线人人人人妻| 欧美另类亚洲清纯唯美| 18禁国产床啪视频网站| 中文字幕av电影在线播放| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 三上悠亚av全集在线观看| 精品久久久久久电影网| 无遮挡黄片免费观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产精品久久久久成人av| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲av电影在线进入| 色94色欧美一区二区| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲专区中文字幕在线| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 妹子高潮喷水视频| 高清欧美精品videossex| 青草久久国产| 久久久国产欧美日韩av| 9色porny在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品久久久久久精品古装| a级毛片黄视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 永久免费av网站大全| 性高湖久久久久久久久免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 国产成人免费观看mmmm| 欧美午夜高清在线| av不卡在线播放| 极品人妻少妇av视频| 久久av网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99久久精品国产亚洲精品| kizo精华| 五月天丁香电影| 日韩制服骚丝袜av| 99国产精品免费福利视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美黄色淫秽网站| 女性生殖器流出的白浆| 性色av一级| 正在播放国产对白刺激| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 97在线人人人人妻| 日日爽夜夜爽网站| 成年人黄色毛片网站| 国产又色又爽无遮挡免| 在线 av 中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲中文av在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲国产中文字幕在线视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | av网站在线播放免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 麻豆av在线久日| 窝窝影院91人妻| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 国产日韩欧美在线精品| 制服人妻中文乱码| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一本久久精品| 十八禁人妻一区二区| www.自偷自拍.com| 爱豆传媒免费全集在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲专区国产一区二区| 一区二区三区精品91| 婷婷色av中文字幕| 国产成人影院久久av| 丰满少妇做爰视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产亚洲av高清不卡| 中文字幕人妻熟女乱码| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 亚洲精品美女久久av网站| 国产片内射在线| 久热爱精品视频在线9| 涩涩av久久男人的天堂| 成年女人毛片免费观看观看9 | 好男人电影高清在线观看| 国产精品一二三区在线看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 搡老乐熟女国产| 岛国毛片在线播放| av不卡在线播放| 中文欧美无线码| 午夜免费成人在线视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 90打野战视频偷拍视频| 一级毛片精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 三级毛片av免费| 精品乱码久久久久久99久播| 黄片小视频在线播放| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久久久网色| 亚洲成人手机| av天堂久久9| 99香蕉大伊视频| av在线老鸭窝| 中文字幕av电影在线播放| 国产一区二区三区av在线| 国产av一区二区精品久久| 亚洲成人手机| 亚洲熟女精品中文字幕| kizo精华| 中文字幕精品免费在线观看视频| 性色av乱码一区二区三区2| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日韩视频在线欧美| 美女大奶头黄色视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美一级毛片孕妇| 热re99久久国产66热| 老司机在亚洲福利影院| 91字幕亚洲| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美成狂野欧美在线观看| 岛国在线观看网站| 亚洲精品在线美女| 热99久久久久精品小说推荐| 十八禁网站网址无遮挡| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产91精品成人一区二区三区 | 久热爱精品视频在线9| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲熟女毛片儿| 波多野结衣av一区二区av| 国产又爽黄色视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩有码中文字幕| 国产97色在线日韩免费| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 国产精品久久久人人做人人爽| 少妇精品久久久久久久| 亚洲国产精品999| 国产欧美日韩精品亚洲av| 最新的欧美精品一区二区| 欧美黄色淫秽网站| 一级片'在线观看视频| 国产精品一区二区免费欧美 | 大片免费播放器 马上看| 麻豆乱淫一区二区| 成年人免费黄色播放视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品一区二区免费欧美 | 久久久久精品人妻al黑| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精品第二区| av线在线观看网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久久久久久大尺度免费视频| 少妇粗大呻吟视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 飞空精品影院首页| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 我的亚洲天堂| bbb黄色大片| 搡老乐熟女国产| 99九九在线精品视频| 成人影院久久| 9191精品国产免费久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美日韩黄片免| 日韩一区二区三区影片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲专区国产一区二区| av在线app专区| 日韩电影二区| 日本a在线网址| 久久久久久久久久久久大奶| 精品国产一区二区久久| 91精品国产国语对白视频| 老司机影院成人| 另类精品久久| videos熟女内射| 高清视频免费观看一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 国产主播在线观看一区二区| 久久久精品免费免费高清| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲九九香蕉| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产男女内射视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产野战对白在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 青草久久国产| 国产男人的电影天堂91| 美女福利国产在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲一码二码三码区别大吗| 美女福利国产在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| www.av在线官网国产| 国产精品 欧美亚洲| 欧美日韩精品网址| 他把我摸到了高潮在线观看 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 窝窝影院91人妻| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲人成电影观看| 免费日韩欧美在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕最新亚洲高清| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美日韩一级在线毛片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产欧美日韩一区二区三 | 国产区一区二久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品av久久久久免费| 久久热在线av| 亚洲精品国产av蜜桃| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美日韩精品网址| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美久久黑人一区二区| 欧美黄色片欧美黄色片| av片东京热男人的天堂| 自线自在国产av| 中文字幕人妻丝袜制服| 咕卡用的链子| 精品一区二区三卡| 麻豆国产av国片精品| 美女福利国产在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲精品自拍成人| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| www.999成人在线观看| 女人精品久久久久毛片| av免费在线观看网站| 男女下面插进去视频免费观看| 91精品国产国语对白视频| 国产精品久久久av美女十八| 麻豆av在线久日| 老司机亚洲免费影院| 精品乱码久久久久久99久播| 人人澡人人妻人| 乱人伦中国视频| 蜜桃在线观看..| 午夜福利免费观看在线| 黄片播放在线免费| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲国产av影院在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 69av精品久久久久久 | 丰满迷人的少妇在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 桃红色精品国产亚洲av| 午夜两性在线视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| av电影中文网址| 天天添夜夜摸| 亚洲国产精品一区三区| 99国产精品免费福利视频| 性少妇av在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 91av网站免费观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| cao死你这个sao货| 窝窝影院91人妻| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 91国产中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 十八禁人妻一区二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 搡老岳熟女国产| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲色图综合在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产色视频综合| 欧美另类一区| 久久精品国产综合久久久| 日韩视频在线欧美| 亚洲九九香蕉| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 在线观看免费高清a一片| 免费在线观看影片大全网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 麻豆乱淫一区二区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 下体分泌物呈黄色| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲精品在线美女| 欧美黑人精品巨大| 一区在线观看完整版| 国产成人啪精品午夜网站| 又黄又粗又硬又大视频| 在线永久观看黄色视频| 午夜福利在线观看吧| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲欧美清纯卡通| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久国产成人免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 成人国产一区最新在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 最黄视频免费看| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲av男天堂| 日韩免费高清中文字幕av| 美女午夜性视频免费| 欧美日韩一级在线毛片| 色视频在线一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美激情高清一区二区三区| 久久精品成人免费网站| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久综合国产亚洲精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 视频区欧美日本亚洲| 久久午夜综合久久蜜桃| 999精品在线视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产男人的电影天堂91| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 男男h啪啪无遮挡| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 午夜影院在线不卡| av在线老鸭窝| 欧美另类一区| 精品免费久久久久久久清纯 | 一级黄色大片毛片| 天天影视国产精品| 亚洲精品自拍成人| 国产高清国产精品国产三级| 12—13女人毛片做爰片一| 男女边摸边吃奶| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 捣出白浆h1v1| 亚洲avbb在线观看| 9色porny在线观看| 久久久久久久国产电影| 在线观看免费日韩欧美大片| 黄色怎么调成土黄色| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产日韩欧美亚洲二区| 黑丝袜美女国产一区| 久久久久久久精品精品| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美黑人精品巨大| 国产麻豆69| 91九色精品人成在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲九九香蕉| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 色视频在线一区二区三区| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲欧美精品自产自拍| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产深夜福利视频在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 中国国产av一级| 亚洲成人免费电影在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 国产97色在线日韩免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲五月色婷婷综合| 极品少妇高潮喷水抽搐| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 夜夜夜夜夜久久久久| 下体分泌物呈黄色| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美激情高清一区二区三区| 99久久综合免费| 12—13女人毛片做爰片一| 久久精品国产亚洲av高清一级| e午夜精品久久久久久久| 不卡av一区二区三区| 午夜影院在线不卡| 免费观看av网站的网址| 国产精品亚洲av一区麻豆| 五月天丁香电影| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 成人国产一区最新在线观看| 天天操日日干夜夜撸| av在线播放精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲成人免费av在线播放| 国产三级黄色录像| 国产精品免费大片| 亚洲成人免费电影在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 国产麻豆69| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 女人久久www免费人成看片| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品1区2区在线观看. | a在线观看视频网站| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久精品国产综合久久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 两个人免费观看高清视频| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲精品国产av成人精品| 国产欧美日韩一区二区三 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 十分钟在线观看高清视频www| 欧美性长视频在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 最近中文字幕2019免费版| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 岛国在线观看网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲精品国产av蜜桃| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产精品免费大片| 动漫黄色视频在线观看| 大陆偷拍与自拍| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日韩电影二区| 国产成人精品无人区| 女性被躁到高潮视频| 国产精品九九99| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲伊人色综图| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 色婷婷av一区二区三区视频| a 毛片基地| 国产精品av久久久久免费| 午夜久久久在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| av福利片在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 18禁国产床啪视频网站| 9色porny在线观看| 91成人精品电影| 亚洲国产欧美一区二区综合| 老司机亚洲免费影院| 捣出白浆h1v1| 国产成人免费无遮挡视频| 国产真人三级小视频在线观看| 国产一区二区三区av在线| 国产一级毛片在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | kizo精华| 99久久精品国产亚洲精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲情色 制服丝袜| 一二三四社区在线视频社区8| 男女国产视频网站| 国产一卡二卡三卡精品| 老司机午夜福利在线观看视频 | 久久久精品免费免费高清| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美黄色片欧美黄色片| 老司机午夜福利在线观看视频 | 日韩有码中文字幕| 在线 av 中文字幕| 黄色视频不卡| netflix在线观看网站| 啦啦啦 在线观看视频| 国产区一区二久久| tube8黄色片| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲全国av大片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 天堂8中文在线网| 日韩三级视频一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 欧美精品啪啪一区二区三区 | 考比视频在线观看| 久久这里只有精品19| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产黄色免费在线视频| www.精华液| kizo精华| 欧美一级毛片孕妇| 一区二区日韩欧美中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 丝袜在线中文字幕| 成年人黄色毛片网站| 国产精品99久久99久久久不卡| 黑丝袜美女国产一区| 欧美激情久久久久久爽电影 | av在线老鸭窝| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 美国免费a级毛片| 久久中文看片网| av片东京热男人的天堂| 亚洲国产看品久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久|