內(nèi)生細(xì)菌S258產(chǎn)揮發(fā)性有機(jī)物的抑菌促生長(zhǎng)活性及其組分分析

羅曉宇，單晨陽(yáng)，賈召召，張 昕，林 玲

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014)

細(xì)菌能夠產(chǎn)生特有的氣味-揮發(fā)性有機(jī)物(Volatile organic compounds，VOCs)，能夠影響其他生物的生長(zhǎng)代謝，甚至防治植物病蟲害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，進(jìn)而提高作物的產(chǎn)量[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性有機(jī)物在20 ℃和0.01 kPa條件下可快速揮發(fā)進(jìn)入氣相狀態(tài)，具有良好的細(xì)胞膜穿透性以及在空氣和土壤空隙中高效率的擴(kuò)散能力，從而提高對(duì)靶標(biāo)微生物的抑制作用[3]。目前，既可作為植物病害生物防治因子又可促進(jìn)植物生長(zhǎng)的揮發(fā)性有機(jī)物已成為關(guān)注的重點(diǎn)。合理利用具抑菌促生長(zhǎng)揮發(fā)性有機(jī)物的細(xì)菌，可減少化肥農(nóng)藥施用量，有助于形成環(huán)境友好的植物生產(chǎn)環(huán)境。

作物枯萎病和黃萎病是2種危害嚴(yán)重的維管束病害，其病原菌分別為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)，其中尖孢鐮刀菌又有多個(gè)?；汀２≡軌蛟谕寥乐虚L(zhǎng)期存活，并且從寄主植株根部侵入后，能夠進(jìn)入植株的維管束中，進(jìn)而擴(kuò)展至植株的各個(gè)部位。維管束病害的防治非常困難，生物防治則是一條重要途徑。內(nèi)生細(xì)菌可在植物體內(nèi)定殖，具有穩(wěn)定的生存空間，從而對(duì)防治微管束病害具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具有良好的應(yīng)用前景[4-5]。近年來(lái)，有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌的研究相對(duì)較多，已經(jīng)從水稻、棉花、辣椒、向日葵等多種作物中分離獲得內(nèi)生細(xì)菌菌株，并且對(duì)多種植物病害都顯示出良好的防治效果[5-9]，但對(duì)其所產(chǎn)揮發(fā)性有機(jī)物的研究較少。菌株S258是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所從棉花品種泗棉3號(hào)的根部分離獲得的一株內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)棉花黃萎菌和棉花枯萎菌具有拮抗活性，具有產(chǎn)水解酶活性和產(chǎn)嗜鐵素活性[10]。本研究通過二分格培養(yǎng)皿對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定菌株S258產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)棉花黃萎菌和西瓜枯萎菌的抑菌活性以及對(duì)擬南芥的促生長(zhǎng)作用，并且用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分析菌株S258揮發(fā)性有機(jī)物的組成，以期為菌株S258在病害生物防治上的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為生物農(nóng)藥的研究與利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 內(nèi)生細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)S258，對(duì)照細(xì)菌菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，病原真菌為棉花黃萎菌(Verticilliumdahliae)V08DF1和西瓜枯萎菌(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)GY16，所有菌株均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存。

1.1.2 供試植物 Columbia 生態(tài)型擬南芥，種子購(gòu)自上海鈺博科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 細(xì)菌菌株用25%甘油-70 ℃保存，常規(guī)活化采用 LA 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng) 24 h后，挑取單克隆，轉(zhuǎn)接于 LB 培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h 后獲得發(fā)酵液，用無(wú)菌水稀釋到1×108cfu/mL，備用。病原真菌采用PDA 培養(yǎng)基活化，28 ℃分別培養(yǎng)7，3 d 后備用。

1.2.2 抑菌效果測(cè)定 參照毛黎娟等[11]的方法，采用二分格平皿對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行抑菌效果的測(cè)定。在直徑9 cm的二分格培養(yǎng)皿的一格中加入8 mL PDA 培養(yǎng)基，另一格中加入8 mL LA 培養(yǎng)基。在LA的一側(cè)涂布20 μL內(nèi)生細(xì)菌S258的發(fā)酵液(1×108cfu/mL)，28 ℃黑暗條件培養(yǎng) 24 h后，在PDA的一側(cè)中央接種取自菌落邊緣的病原真菌的菌餅(Φ=5 mm)，用Parafilm膜封口，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。由于不同病原真菌的生長(zhǎng)速率不同，后續(xù)培養(yǎng)時(shí)間也不同。病原真菌為棉花黃萎菌時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)7 d；病原真菌為西瓜枯萎菌時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。觀察病原真菌的生長(zhǎng)情況，并測(cè)量病原真菌的菌落直徑，計(jì)算抑菌率。以涂布大腸桿菌DH5α的平板為對(duì)照。每處理3次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。各處理的平均值用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行組間差異顯著性比較。

抑菌率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.2.3 對(duì)擬南芥的促生長(zhǎng)效果測(cè)定 擬南芥種子種植前按照Ryu等[12]的方法進(jìn)行表面消毒處理，然后4 ℃ 春化 2 d。參照Ryu等[12]的方法，采用二分格平皿對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行促生長(zhǎng)效果的測(cè)定。在直徑9 cm的二分格培養(yǎng)皿的一格中加入8 mL LA培養(yǎng)基，另一格中加入8 mL MS培養(yǎng)基。將春化后的擬南芥種子置于MS培養(yǎng)基上，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，培養(yǎng)條件為22 ℃，16 h/8 h 光暗周期，光照強(qiáng)度6 000～8 000 lx。待擬南芥種子萌發(fā)后，在LA的一側(cè)滴加8 μL內(nèi)生細(xì)菌S258的發(fā)酵液(1×108cfu/mL)，用Parafilm膜封口，放入光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，測(cè)定擬南芥的鮮質(zhì)量。以不滴加細(xì)菌的平板為空白對(duì)照。每處理3次重復(fù)。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌揮發(fā)性有機(jī)物的收集及組分鑒定 參照王靜等[13]的方法，用頂空-固相微萃取法(Solid phase micro-extraction，SPME)收集內(nèi)生細(xì)菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物。固相微萃取儀以及萃取頭(100 μm PDMS，65 μm PDMS/DVB，50/30 μm CAR/DVB/PDMS)都購(gòu)自美國(guó) Supelco 公司。吸取尚未冷卻的LA 培養(yǎng)基3 mL入15 mL的無(wú)菌頂空瓶中，然后將瓶體傾斜15°角靜置，待培養(yǎng)基凝固成LA斜面。吸取100 μL 內(nèi)生細(xì)菌S258的發(fā)酵液(1×108cfu/mL)均勻涂布于頂空瓶中的LA斜面上，用含有聚四氟乙烯涂層的瓶蓋封口，28 ℃黑暗條件靜置培養(yǎng)2 d后收集揮發(fā)性有機(jī)物。以不涂布細(xì)菌懸液的處理為空白對(duì)照，從而排除培養(yǎng)基和萃取頭涂層對(duì)細(xì)菌揮發(fā)性有機(jī)物鑒定結(jié)果的干擾。每處理3次重復(fù)。收集揮發(fā)性有機(jī)物之前，先將頂空瓶置于室溫中平衡20 min，萃取頭按照廠家提供的說明書進(jìn)行老化，然后將SPME針插入頂空瓶，將萃取頭推入到頂空瓶上部1/3 處，進(jìn)行細(xì)菌揮發(fā)性有機(jī)物的收集。采樣時(shí)間為30 min，結(jié)束后，收起萃取頭，并拔出針管。

用GC-MS技術(shù)分析內(nèi)生細(xì)菌S258的揮發(fā)性有機(jī)物組分，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀QP2010購(gòu)自日本 Shimadzu公司。GC-MS分析的條件按照王靜等[13]的方法進(jìn)行。數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)為Agilent MassHunter(B.05.02)。結(jié)果經(jīng) NIST 和 WILIY 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)檢索，按照匹配率>80進(jìn)行識(shí)別。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)病原真菌的抑制效果

用二分格平皿對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)病原真菌的抑制作用。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照大腸桿菌DH5α相比，內(nèi)生細(xì)菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)病原真菌具有抑制作用(圖1)。其中，對(duì)棉花黃萎菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)80.9%，而對(duì)西瓜枯萎菌的抑制率僅為10.1%(表1)。

表1 內(nèi)生細(xì)菌S258產(chǎn)揮發(fā)性有機(jī)物的抑菌活性Tab.1 The antifungal activity of the VOCs from an endophytic bacterium S258

2.2 揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)擬南芥的促生長(zhǎng)效果

采用二分格平皿對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌S258所產(chǎn)揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)擬南芥的促生長(zhǎng)作用。結(jié)果表明，在不加細(xì)菌的空白對(duì)照中，擬南芥每株鮮質(zhì)量為6.0 mg，而內(nèi)生細(xì)菌S258的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，單株鮮質(zhì)量達(dá)到32.0 mg，是空白對(duì)照的5.3倍(圖2)。

2.3 揮發(fā)性有機(jī)物的組分分析

用頂空-固相微萃取法收集內(nèi)生細(xì)菌S258所產(chǎn)揮發(fā)性有機(jī)物，并用GC-MS分析其揮發(fā)性有機(jī)物的組成。經(jīng) NIST 和 WILIY 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)檢索，鑒定得到菌株S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物包含30 種單體化合物，分別屬于烷烴、烯烴、醇、酮、醚、醛、酯及雜環(huán)類(表2)。根據(jù)總離子流圖的峰面積判斷，主要?dú)怏w成分為二甲基二硫醚(Dimethyl disulfide)和吲哚(Indole)。

表2 固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)內(nèi)生細(xì)菌S258的揮發(fā)性有機(jī)物組分Tab.2 The components analysis of the VOCs from an endophytic bacterium S258 by SPME GC-MS

3 討論

防治困難的維管束病害一直是生物防治應(yīng)用的重點(diǎn)，受到人們的重視。利用內(nèi)生細(xì)菌防治微管束病害，除了因?yàn)閮?nèi)生細(xì)菌能夠在植物體內(nèi)定殖之外，還有一個(gè)重要的作用機(jī)制就是產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)。先前的學(xué)者大多致力于發(fā)掘微生物產(chǎn)生的非揮發(fā)性抗菌物質(zhì)，如抗生素類、抗菌蛋白或細(xì)胞壁降解酶類[14-16]，而對(duì)揮發(fā)性抗菌物質(zhì)的研究相對(duì)較少。現(xiàn)已證明，能分泌抑菌揮發(fā)性有機(jī)物的微生物普遍存在，鏈霉菌、芽孢桿菌屬等多屬的細(xì)菌以及真菌都可以產(chǎn)生抗菌性揮發(fā)性有機(jī)物[3，17-19]。而且，與非揮發(fā)性抗菌物質(zhì)相比，揮發(fā)性抑菌物質(zhì)更加容易在環(huán)境中滲透和擴(kuò)散，從而擴(kuò)展到更遠(yuǎn)的距離，并能通過調(diào)節(jié)激素的代謝來(lái)調(diào)控植物的生長(zhǎng)[20]。Ryu等[12]2003年最早發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物能促進(jìn)擬南芥生長(zhǎng)，隨后又發(fā)現(xiàn)許多根際細(xì)菌的揮發(fā)性有機(jī)物都能促進(jìn)植物生長(zhǎng)。此外，還有一些細(xì)菌如假單胞菌、黏質(zhì)沙雷菌以及寡養(yǎng)單胞菌等可以產(chǎn)生抑制擬南芥生長(zhǎng)的揮發(fā)性有機(jī)物[21]。那些既可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)又可作為植物病害生物防治因子的揮發(fā)性有機(jī)物尤為引人注目。本研究中內(nèi)生細(xì)菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物既能強(qiáng)烈抑制棉花黃萎菌菌絲的生長(zhǎng)，對(duì)西瓜枯萎菌也有一定的抑制作用，同時(shí)對(duì)擬南芥還具有很強(qiáng)的促生長(zhǎng)作用，表明內(nèi)生細(xì)菌S258能夠產(chǎn)生具有抑菌促生長(zhǎng)活性的揮發(fā)性有機(jī)物，是一種可開發(fā)為生防產(chǎn)品的微生物資源。由于擬南芥作為模式植物，可以在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)，易于操作，本研究?jī)H測(cè)定了內(nèi)生細(xì)菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)擬南芥的促生長(zhǎng)效果，對(duì)于其他作物的促生長(zhǎng)效果還需要進(jìn)一步檢測(cè)。

微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物是成分復(fù)雜的混合物，目前，已鑒定超過250 種來(lái)自真菌、340種來(lái)自細(xì)菌的揮發(fā)性有機(jī)物成分[21-22]。目前，收集鑒定細(xì)菌產(chǎn)揮發(fā)性有機(jī)物的常用方法為頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用的方法，不同細(xì)菌產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物包含1～30 種不同的單體化合物[17，23]。本研究中，內(nèi)生細(xì)菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物同時(shí)具有抑制病原真菌生長(zhǎng)和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，顯示出了較高的研究和應(yīng)用價(jià)值。本研究收集并分析了內(nèi)生細(xì)菌S258所產(chǎn)揮發(fā)性有機(jī)物的組成成分，發(fā)現(xiàn)其包含8類30種單體化合物，主要?dú)怏w成分為二甲基二硫醚和吲哚。盡管揮發(fā)性有機(jī)物表現(xiàn)出的抑制病原真菌和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的活性往往是由混合物中的多種成分共同起作用的結(jié)果，人們還是通過各種方法確定了一些在微生物揮發(fā)性有機(jī)物中起作用的單物質(zhì)成分[1，3]。已證實(shí)具有抑菌活性的微生物揮發(fā)性有機(jī)物組分有二甲基二硫醚(Dimethyl disulfide)、二甲基三硫醚(Dimethyl trisulfide)、2-壬酮(2-nonanone)、2-庚酮(2-heptanone)、2-葵酮(2-decanone)、三甲胺(Trimethylamine)、二乙基己醇(2-ethyl-hexanol)、對(duì)羥基苯甲醛(4-hydroxybenzaldehyde)、3-羥基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone)、苯甲醛(Benzaldehyde)、N，N-二甲基辛胺(N，N-dimethyloctylamine)等[24-30]。另外，微生物揮發(fā)性有機(jī)物組分中的2，3-丁二醇(2，3-butanediol)、3-羥基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone)已被證實(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用并且能誘導(dǎo)植物抗病[12，30-31]。在本研究菌株S258所產(chǎn)揮發(fā)性有機(jī)物組分中的二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、2-壬酮、2-葵酮是已證實(shí)的具有抑菌活性的物質(zhì)，但是不含有已報(bào)道的具有促生長(zhǎng)活性的物質(zhì)，具體哪種物質(zhì)發(fā)揮了抑菌促生長(zhǎng)作用，還需利用純品化合物進(jìn)行活性驗(yàn)證才能得出結(jié)論，后續(xù)驗(yàn)證工作有待于進(jìn)一步開展。