內(nèi)生細菌S258產(chǎn)揮發(fā)性有機物的抑菌促生長活性及其組分分析

羅曉宇，單晨陽，賈召召，張 昕，林 玲

(1.南京農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

細菌能夠產(chǎn)生特有的氣味-揮發(fā)性有機物(Volatile organic compounds，VOCs)，能夠影響其他生物的生長代謝，甚至防治植物病蟲害、促進植物生長，進而提高作物的產(chǎn)量[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性有機物在20 ℃和0.01 kPa條件下可快速揮發(fā)進入氣相狀態(tài)，具有良好的細胞膜穿透性以及在空氣和土壤空隙中高效率的擴散能力，從而提高對靶標微生物的抑制作用[3]。目前，既可作為植物病害生物防治因子又可促進植物生長的揮發(fā)性有機物已成為關注的重點。合理利用具抑菌促生長揮發(fā)性有機物的細菌，可減少化肥農(nóng)藥施用量，有助于形成環(huán)境友好的植物生產(chǎn)環(huán)境。

作物枯萎病和黃萎病是2種危害嚴重的維管束病害，其病原菌分別為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)，其中尖孢鐮刀菌又有多個?；?。病原菌能夠在土壤中長期存活，并且從寄主植株根部侵入后，能夠進入植株的維管束中，進而擴展至植株的各個部位。維管束病害的防治非常困難，生物防治則是一條重要途徑。內(nèi)生細菌可在植物體內(nèi)定殖，具有穩(wěn)定的生存空間，從而對防治微管束病害具有獨特的優(yōu)勢，具有良好的應用前景[4-5]。近年來，有關植物內(nèi)生細菌的研究相對較多，已經(jīng)從水稻、棉花、辣椒、向日葵等多種作物中分離獲得內(nèi)生細菌菌株，并且對多種植物病害都顯示出良好的防治效果[5-9]，但對其所產(chǎn)揮發(fā)性有機物的研究較少。菌株S258是江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所從棉花品種泗棉3號的根部分離獲得的一株內(nèi)生細菌，對棉花黃萎菌和棉花枯萎菌具有拮抗活性，具有產(chǎn)水解酶活性和產(chǎn)嗜鐵素活性[10]。本研究通過二分格培養(yǎng)皿對峙培養(yǎng)法測定菌株S258產(chǎn)生揮發(fā)性有機物對棉花黃萎菌和西瓜枯萎菌的抑菌活性以及對擬南芥的促生長作用，并且用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分析菌株S258揮發(fā)性有機物的組成，以期為菌株S258在病害生物防治上的應用提供理論依據(jù)，為生物農(nóng)藥的研究與利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 內(nèi)生細菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)S258，對照細菌菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，病原真菌為棉花黃萎菌(Verticilliumdahliae)V08DF1和西瓜枯萎菌(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)GY16，所有菌株均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所保存。

1.1.2 供試植物 Columbia 生態(tài)型擬南芥，種子購自上海鈺博科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 細菌菌株用25%甘油-70 ℃保存，常規(guī)活化采用 LA 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng) 24 h后，挑取單克隆，轉(zhuǎn)接于 LB 培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h 后獲得發(fā)酵液，用無菌水稀釋到1×108cfu/mL，備用。病原真菌采用PDA 培養(yǎng)基活化，28 ℃分別培養(yǎng)7，3 d 后備用。

1.2.2 抑菌效果測定 參照毛黎娟等[11]的方法，采用二分格平皿對峙培養(yǎng)法進行抑菌效果的測定。在直徑9 cm的二分格培養(yǎng)皿的一格中加入8 mL PDA 培養(yǎng)基，另一格中加入8 mL LA 培養(yǎng)基。在LA的一側(cè)涂布20 μL內(nèi)生細菌S258的發(fā)酵液(1×108cfu/mL)，28 ℃黑暗條件培養(yǎng) 24 h后，在PDA的一側(cè)中央接種取自菌落邊緣的病原真菌的菌餅(Φ=5 mm)，用Parafilm膜封口，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。由于不同病原真菌的生長速率不同，后續(xù)培養(yǎng)時間也不同。病原真菌為棉花黃萎菌時，繼續(xù)培養(yǎng)7 d；病原真菌為西瓜枯萎菌時，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。觀察病原真菌的生長情況，并測量病原真菌的菌落直徑，計算抑菌率。以涂布大腸桿菌DH5α的平板為對照。每處理3次重復。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差分析。各處理的平均值用Duncan新復極差法進行組間差異顯著性比較。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.2.3 對擬南芥的促生長效果測定 擬南芥種子種植前按照Ryu等[12]的方法進行表面消毒處理，然后4 ℃ 春化 2 d。參照Ryu等[12]的方法，采用二分格平皿對峙培養(yǎng)法進行促生長效果的測定。在直徑9 cm的二分格培養(yǎng)皿的一格中加入8 mL LA培養(yǎng)基，另一格中加入8 mL MS培養(yǎng)基。將春化后的擬南芥種子置于MS培養(yǎng)基上，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，培養(yǎng)條件為22 ℃，16 h/8 h 光暗周期，光照強度6 000～8 000 lx。待擬南芥種子萌發(fā)后，在LA的一側(cè)滴加8 μL內(nèi)生細菌S258的發(fā)酵液(1×108cfu/mL)，用Parafilm膜封口，放入光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，測定擬南芥的鮮質(zhì)量。以不滴加細菌的平板為空白對照。每處理3次重復。

1.2.4 內(nèi)生細菌揮發(fā)性有機物的收集及組分鑒定 參照王靜等[13]的方法，用頂空-固相微萃取法(Solid phase micro-extraction，SPME)收集內(nèi)生細菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物。固相微萃取儀以及萃取頭(100 μm PDMS，65 μm PDMS/DVB，50/30 μm CAR/DVB/PDMS)都購自美國 Supelco 公司。吸取尚未冷卻的LA 培養(yǎng)基3 mL入15 mL的無菌頂空瓶中，然后將瓶體傾斜15°角靜置，待培養(yǎng)基凝固成LA斜面。吸取100 μL 內(nèi)生細菌S258的發(fā)酵液(1×108cfu/mL)均勻涂布于頂空瓶中的LA斜面上，用含有聚四氟乙烯涂層的瓶蓋封口，28 ℃黑暗條件靜置培養(yǎng)2 d后收集揮發(fā)性有機物。以不涂布細菌懸液的處理為空白對照，從而排除培養(yǎng)基和萃取頭涂層對細菌揮發(fā)性有機物鑒定結(jié)果的干擾。每處理3次重復。收集揮發(fā)性有機物之前，先將頂空瓶置于室溫中平衡20 min，萃取頭按照廠家提供的說明書進行老化，然后將SPME針插入頂空瓶，將萃取頭推入到頂空瓶上部1/3 處，進行細菌揮發(fā)性有機物的收集。采樣時間為30 min，結(jié)束后，收起萃取頭，并拔出針管。

用GC-MS技術(shù)分析內(nèi)生細菌S258的揮發(fā)性有機物組分，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀QP2010購自日本 Shimadzu公司。GC-MS分析的條件按照王靜等[13]的方法進行。數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)為Agilent MassHunter(B.05.02)。結(jié)果經(jīng) NIST 和 WILIY 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫自動檢索，按照匹配率>80進行識別。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性有機物對病原真菌的抑制效果

用二分格平皿對峙培養(yǎng)法測定內(nèi)生細菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物對病原真菌的抑制作用。結(jié)果表明，與陰性對照大腸桿菌DH5α相比，內(nèi)生細菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物對病原真菌具有抑制作用(圖1)。其中，對棉花黃萎菌菌絲生長的抑制率達80.9%，而對西瓜枯萎菌的抑制率僅為10.1%(表1)。

表1 內(nèi)生細菌S258產(chǎn)揮發(fā)性有機物的抑菌活性Tab.1 The antifungal activity of the VOCs from an endophytic bacterium S258

2.2 揮發(fā)性有機物對擬南芥的促生長效果

采用二分格平皿對峙培養(yǎng)法測定內(nèi)生細菌S258所產(chǎn)揮發(fā)性有機物對擬南芥的促生長作用。結(jié)果表明，在不加細菌的空白對照中，擬南芥每株鮮質(zhì)量為6.0 mg，而內(nèi)生細菌S258的揮發(fā)性有機物對擬南芥的生長具有很強的促進作用，單株鮮質(zhì)量達到32.0 mg，是空白對照的5.3倍(圖2)。

2.3 揮發(fā)性有機物的組分分析

用頂空-固相微萃取法收集內(nèi)生細菌S258所產(chǎn)揮發(fā)性有機物，并用GC-MS分析其揮發(fā)性有機物的組成。經(jīng) NIST 和 WILIY 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫自動檢索，鑒定得到菌株S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物包含30 種單體化合物，分別屬于烷烴、烯烴、醇、酮、醚、醛、酯及雜環(huán)類(表2)。根據(jù)總離子流圖的峰面積判斷，主要氣體成分為二甲基二硫醚(Dimethyl disulfide)和吲哚(Indole)。

表2 固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用檢測內(nèi)生細菌S258的揮發(fā)性有機物組分Tab.2 The components analysis of the VOCs from an endophytic bacterium S258 by SPME GC-MS

3 討論

防治困難的維管束病害一直是生物防治應用的重點，受到人們的重視。利用內(nèi)生細菌防治微管束病害，除了因為內(nèi)生細菌能夠在植物體內(nèi)定殖之外，還有一個重要的作用機制就是產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)。先前的學者大多致力于發(fā)掘微生物產(chǎn)生的非揮發(fā)性抗菌物質(zhì)，如抗生素類、抗菌蛋白或細胞壁降解酶類[14-16]，而對揮發(fā)性抗菌物質(zhì)的研究相對較少?，F(xiàn)已證明，能分泌抑菌揮發(fā)性有機物的微生物普遍存在，鏈霉菌、芽孢桿菌屬等多屬的細菌以及真菌都可以產(chǎn)生抗菌性揮發(fā)性有機物[3，17-19]。而且，與非揮發(fā)性抗菌物質(zhì)相比，揮發(fā)性抑菌物質(zhì)更加容易在環(huán)境中滲透和擴散，從而擴展到更遠的距離，并能通過調(diào)節(jié)激素的代謝來調(diào)控植物的生長[20]。Ryu等[12]2003年最早發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物能促進擬南芥生長，隨后又發(fā)現(xiàn)許多根際細菌的揮發(fā)性有機物都能促進植物生長。此外，還有一些細菌如假單胞菌、黏質(zhì)沙雷菌以及寡養(yǎng)單胞菌等可以產(chǎn)生抑制擬南芥生長的揮發(fā)性有機物[21]。那些既可以促進植物的生長又可作為植物病害生物防治因子的揮發(fā)性有機物尤為引人注目。本研究中內(nèi)生細菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物既能強烈抑制棉花黃萎菌菌絲的生長，對西瓜枯萎菌也有一定的抑制作用，同時對擬南芥還具有很強的促生長作用，表明內(nèi)生細菌S258能夠產(chǎn)生具有抑菌促生長活性的揮發(fā)性有機物，是一種可開發(fā)為生防產(chǎn)品的微生物資源。由于擬南芥作為模式植物，可以在培養(yǎng)皿中生長，易于操作，本研究僅測定了內(nèi)生細菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物對擬南芥的促生長效果，對于其他作物的促生長效果還需要進一步檢測。

微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物是成分復雜的混合物，目前，已鑒定超過250 種來自真菌、340種來自細菌的揮發(fā)性有機物成分[21-22]。目前，收集鑒定細菌產(chǎn)揮發(fā)性有機物的常用方法為頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用的方法，不同細菌產(chǎn)生揮發(fā)性有機物包含1～30 種不同的單體化合物[17，23]。本研究中，內(nèi)生細菌S258產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物同時具有抑制病原真菌生長和促進植物生長的作用，顯示出了較高的研究和應用價值。本研究收集并分析了內(nèi)生細菌S258所產(chǎn)揮發(fā)性有機物的組成成分，發(fā)現(xiàn)其包含8類30種單體化合物，主要氣體成分為二甲基二硫醚和吲哚。盡管揮發(fā)性有機物表現(xiàn)出的抑制病原真菌和促進植物生長的活性往往是由混合物中的多種成分共同起作用的結(jié)果，人們還是通過各種方法確定了一些在微生物揮發(fā)性有機物中起作用的單物質(zhì)成分[1，3]。已證實具有抑菌活性的微生物揮發(fā)性有機物組分有二甲基二硫醚(Dimethyl disulfide)、二甲基三硫醚(Dimethyl trisulfide)、2-壬酮(2-nonanone)、2-庚酮(2-heptanone)、2-葵酮(2-decanone)、三甲胺(Trimethylamine)、二乙基己醇(2-ethyl-hexanol)、對羥基苯甲醛(4-hydroxybenzaldehyde)、3-羥基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone)、苯甲醛(Benzaldehyde)、N，N-二甲基辛胺(N，N-dimethyloctylamine)等[24-30]。另外，微生物揮發(fā)性有機物組分中的2，3-丁二醇(2，3-butanediol)、3-羥基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone)已被證實對植物生長有促進作用并且能誘導植物抗病[12，30-31]。在本研究菌株S258所產(chǎn)揮發(fā)性有機物組分中的二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、2-壬酮、2-葵酮是已證實的具有抑菌活性的物質(zhì)，但是不含有已報道的具有促生長活性的物質(zhì)，具體哪種物質(zhì)發(fā)揮了抑菌促生長作用，還需利用純品化合物進行活性驗證才能得出結(jié)論，后續(xù)驗證工作有待于進一步開展。