GnIH基因多態(tài)性與鵝產(chǎn)蛋和體組成性狀的關(guān)聯(lián)分析

高廣亮，張克山，許國(guó)洋，趙獻(xiàn)芝，陳主平，周 莉，王啟貴

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市肉鵝遺傳改良工程技術(shù)研究中心，重慶 402460；3.重慶市綦江區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 401420)

鵝是重要水禽資源之一，是肉品、蛋品、羽絨制品和肥肝等產(chǎn)品的重要來(lái)源[1]，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。四川白鵝是肉蛋兼用型優(yōu)良的地方品種之一，具有肉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)豐富，生長(zhǎng)速度快，繁殖力較高、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)。然而季節(jié)性產(chǎn)蛋、就巢性等獨(dú)特的生理特性，造成鵝產(chǎn)蛋性狀不穩(wěn)定，限制了對(duì)鵝產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，目前已有鵝產(chǎn)蛋性狀、飼料營(yíng)養(yǎng)和疫病等重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子標(biāo)記相關(guān)的研究[2-3]，但鮮有對(duì)鵝產(chǎn)蛋和體組成性狀分子標(biāo)記的研究報(bào)道。

促性腺激素抑制激素(Gonadotropin inhibitory hormone，GnIH)，重要的下丘腦生殖調(diào)控激素之一，是由神經(jīng)相關(guān)肽VF基因(Neuropeptide VF precursor，NPVF)編碼的前體蛋白經(jīng)裂解形成的一種神經(jīng)十二肽。自首次在鳥(niǎo)類的下丘腦室旁核發(fā)現(xiàn)GnIH以來(lái)，在哺乳動(dòng)物、兩棲類動(dòng)物等都發(fā)現(xiàn)存在其同源類似物，均作為一種繁殖負(fù)調(diào)控因子通過(guò)其受體(G protein couple receptor 147，GPR147)既可直接作用于垂體抑制促性腺激素的生物合成和釋放[4-5]，又可通過(guò)神經(jīng)突觸投射到正中隆起和GnRH神經(jīng)元抑制垂體前葉促性腺激素釋放[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)：GnIH激素通過(guò)影響血漿中的黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)和促卵泡生成素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)的激素濃度，調(diào)控禽類性行為和采食行為等[9-10]。繁殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用外，GnIH也調(diào)控雛雞和育成期肉種雞的采食量和青春期發(fā)育，外源注射GnIH可提高雛雞和育成期肉種雞的采食量，提高體重，促進(jìn)性成熟[9，11-12]。

GnIH基因堿基突變可引發(fā)多種繁殖相關(guān)疾病，如人的完全性特發(fā)性性腺功能減退癥[13]和Kallmann綜合征[14]等。前期研究發(fā)現(xiàn)，GnIH基因SNPs位點(diǎn)與羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)[15]。GnIH的SNP位點(diǎn)與雞開(kāi)產(chǎn)日齡、初產(chǎn)蛋質(zhì)量、開(kāi)產(chǎn)體質(zhì)量和300日齡產(chǎn)蛋質(zhì)量等性狀顯著或極顯著相關(guān)[16]。操勇清等[17]發(fā)現(xiàn)，GnIH基因C2089T 位點(diǎn)與金定鴨500 日齡產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)。胡彥競(jìng)科等[18]研究結(jié)果證明，該基因SNP位點(diǎn)與四川白鵝產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)，且鵝的GnIH激素血清濃度和基因表達(dá)量在不同繁殖階段差異顯著[19]。因此GnIH的SNP位點(diǎn)可能與動(dòng)物的繁殖性狀相關(guān)。

本研究通過(guò)克隆鵝GnIH基因DNA序列后，與近源物種進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法，在四川白鵝群體中進(jìn)行SNP掃描和個(gè)體基因型分型，并與體組成和產(chǎn)蛋性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，鑒定鵝的體組成和產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)，目的是為上述性狀提供潛在的分子標(biāo)記。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和數(shù)據(jù)采集

選擇重慶市榮昌區(qū)安富水禽實(shí)驗(yàn)基地飼養(yǎng)的同一批次孵化的208只四川白鵝(母鵝)為試驗(yàn)材料。為準(zhǔn)確記錄性狀，鵝孵化出殼后即記錄鵝出生質(zhì)量，并進(jìn)行系統(tǒng)的腳號(hào)和翅號(hào)標(biāo)記。飼養(yǎng)至28周齡，轉(zhuǎn)移到個(gè)體籠(600 mm×800 mm×900 mm)中繼續(xù)飼養(yǎng)，鵝群在個(gè)體籠中飼養(yǎng)至65周(休產(chǎn)期)，期間自由采食和飲水。轉(zhuǎn)移前進(jìn)行翅靜脈血收集，利用血液DNA提取試劑盒(北京天根，DP332)抽提鵝血液基因組DNA，并將其溶解在TE溶液中在-20 ℃保存?zhèn)溆?。每天進(jìn)行2次產(chǎn)蛋數(shù)記錄，最后統(tǒng)計(jì)初產(chǎn)蛋質(zhì)量、48周產(chǎn)蛋數(shù)、64周產(chǎn)蛋數(shù)；鵝群轉(zhuǎn)移出個(gè)體籠后，根據(jù)體組成性狀的測(cè)量方法[20]，利用軟尺測(cè)量每只鵝的成年頸長(zhǎng)、胸寬、半潛水長(zhǎng)、骨盆寬、體斜長(zhǎng)、脛長(zhǎng)、龍骨長(zhǎng)和脛圍等體組成性狀。

1.2 GnIH基因克隆、SNP多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)和分型與遺傳進(jìn)化分析

本研究以四川白鵝的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)合適的PCR引物(表1)，直接測(cè)序法獲得GnIH基因序列、SNP多態(tài)性位點(diǎn)和基因分型結(jié)果。擴(kuò)增體系50 μL：基因組DNA(<1 μg) 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Gflex PCR Buffer 25 μL，Tks Gflex DNA 聚合酶1 μL，ddH2O21 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物鑒定后由Invitrogen公司測(cè)序，用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果序列進(jìn)行比對(duì)分析和SNP掃描，獲得的序列與其他物種的GnIH基因采用Mega 6.0軟件的鄰接法建樹(shù)，分析遺傳進(jìn)化關(guān)系。參照命名系統(tǒng)(www.hgvs.org/mutnomen)對(duì)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)一命名。

表1 四川白鵝GnIH基因引物序列Tab.1 The primer sequences for GnIH sequence cloning in Sichuan white goose

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用單因素方差分析模型分析GnIH基因SNP多態(tài)性位點(diǎn)及其構(gòu)建的單倍型與性狀之間的關(guān)聯(lián)性，模型：Y=μ+Gi+eij，其中Y為性狀觀測(cè)值，μ是群體平均值，Gi為個(gè)體基因型，eij為隨機(jī)誤差。利用JMP(version 13.0)軟件計(jì)算各個(gè)性狀對(duì)應(yīng)的基因型的最小二乘均數(shù)。顯著差異水平為P<0.05，極顯著差異水平為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 GnIH基因克隆和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

PCR克隆獲得了四川白鵝GnIH基因3 735 bp(圖1-A)，該序列包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，并含有完整的CDS區(qū)長(zhǎng)522 bp，編碼一個(gè)含173個(gè)氨基酸的前體蛋白，蛋白包括1個(gè)具有生物活性的十二肽和2個(gè)GnIH相關(guān)肽(GnIH-RP1和GnIH-RP2)，其中活性十二肽GnIH氨基酸序列為：SIKPIANLPLRF(圖1-B)所示。獲得的序列上傳NCBI，序列號(hào)T862215。Mega 6.0對(duì)GnIH基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，四川白鵝與綠頭鴨的GnIH序列的相似性最高，達(dá)到99%，鳥(niǎo)類與哺乳類動(dòng)物的GnIH處在進(jìn)化樹(shù)上的2個(gè)大的分支上(圖1-C)。

2.2 GnIH基因SNP與四川白鵝產(chǎn)蛋和體組成性狀的相關(guān)分析

本研究發(fā)現(xiàn)26個(gè)SNP位點(diǎn)在四川白鵝群體中具有多態(tài)性，g.2164C>G位點(diǎn)突變導(dǎo)致脯氨酸變成精氨酸(P>R)，g.2228T>A位點(diǎn)突變導(dǎo)致酪氨酸變成天冬氨酸(Y>D)(表2)。GnIH基因的多態(tài)性位點(diǎn)與四川白鵝產(chǎn)蛋和體組成性狀的相關(guān)分析結(jié)果表明(表2)：初產(chǎn)蛋質(zhì)量與g.811T>C和g.1892T>C位點(diǎn)顯著相關(guān)(P<0.05)與g.1320G>A位點(diǎn)極顯著相關(guān)(P<0.01)；體斜長(zhǎng)與g.1809G>T位點(diǎn)顯著相關(guān)(P<0.05)；頸長(zhǎng)與g.2164C>G位點(diǎn)極顯著相關(guān)(P<0.01)；胸寬與g.1708A>G和g.2164C>G位點(diǎn)顯著相關(guān)(P<0.05)；脛圍與g.1809G>T、g.1892T>C、g.1929C>A和g.2164C>G位點(diǎn)顯著或極顯著相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，然而與48周產(chǎn)蛋數(shù)、64周產(chǎn)蛋數(shù)、出生質(zhì)量、半潛水長(zhǎng)、龍骨長(zhǎng)、骨盆寬等無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05)。

表2 GnIH突變位點(diǎn)對(duì)四川白鵝產(chǎn)蛋性狀和體組成性狀的影響(P值)Tab.2 The effect of GnIH mutations on egg weight and body measurement traits in Sichuan white goose

表2(續(xù))

SNP位點(diǎn)基因型多重比對(duì)結(jié)果表明：g.811T>C、g.1320G>A和g.1892T>C的CC、GG和CC基因型的個(gè)體的初產(chǎn)蛋質(zhì)量均極顯著高于其他基因型個(gè)體(P<0.01)(表3)；g.1809G>T的GG基因型個(gè)體的體斜長(zhǎng)極顯著高于TT基因型個(gè)體(P<0.01)；g.2164C>G位點(diǎn)GG基因型個(gè)體的頸長(zhǎng)顯著低于CC基因型個(gè)體(P<0.05)；g.1708A>G位點(diǎn)的GG基因型個(gè)體的胸寬顯著高于AG和AA基因型個(gè)體，而g.2164C>G位點(diǎn)的AA基因型個(gè)體的胸寬極顯著高于其他基因型(P< 0.01)；對(duì)于脛圍性狀，g.1809G>T 的GT性狀顯著低于其他基因型(P< 0.05)，g.1809G>T、g.1892T>C、g.1929C>A和g.2164C>G位點(diǎn)的GG、TT、AA和CC基因型個(gè)體的脛圍極顯著高于其他基因型(P<0.01)(表3)。

表3 GnIH 不同基因型對(duì)鵝產(chǎn)蛋和體組成性狀的影響Tab.3 The effect of genotypes of GnIH on the egg-laying traits and body measurement traits

3 討論與結(jié)論

3.1 關(guān)于四川白鵝GnIH基因序列結(jié)構(gòu)的討論

本研究發(fā)現(xiàn)：GnIH成熟十二肽(SIKPIANLPLRF)及其前體蛋白上的2個(gè)相關(guān)肽GnIH-RP-1 和 GnIH-RP-2都擁有保守的C端LPX(L/Q)RF結(jié)構(gòu)，這個(gè)保守基序在其他脊柱動(dòng)物也被發(fā)現(xiàn)，如RFRP1、RFRP3等[21-22]；并發(fā)現(xiàn)鵝GnIH基因與綠頭鴨的GnIH遺傳進(jìn)化關(guān)系最近，相似性達(dá)到99%，鴨和鵝都屬于鴨科動(dòng)物，因此鵝和鴨親緣關(guān)系最近，這也解釋鵝GnIH與其他禽類或鳥(niǎo)類聚在一個(gè)大的分支上。

研究表明，GnIH基因在鳥(niǎo)類、靈長(zhǎng)類或兩棲類動(dòng)物中，其功能都是保守的，通過(guò)調(diào)控激素分析調(diào)節(jié)動(dòng)物繁殖[23-24]。Ubuka等[25]研究了最古老的脊椎動(dòng)物無(wú)頜類GnIH前體基因，免疫組化結(jié)果顯示，GnIH神經(jīng)纖維與GnRH3神經(jīng)元胞體接觸，影響GHTβ的表達(dá)，雖然擁有共同的始祖基因，但在進(jìn)化過(guò)程哺乳類和鳥(niǎo)類GnIH處在進(jìn)化樹(shù)上2個(gè)大的分支上，其可能是因?yàn)橹毕祷蚺韵颠z傳的差異導(dǎo)致[26]。

3.2 關(guān)于四川白鵝GnIH基因多肽性與繁殖性狀關(guān)系的討論

鵝作為一種短日照光周期家禽，在周期性繁殖、繁殖行為調(diào)控中均扮演重要作用[11]。前期研究表明，GnIH在鵝的不同的繁殖階段HPO軸中顯著性差異表達(dá)，進(jìn)一步佐證GnIH參與了鵝的周期性繁殖調(diào)控[19]。初產(chǎn)蛋質(zhì)量是鵝重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)之一，本研究發(fā)現(xiàn)GnIH基因內(nèi)含子1上多個(gè)SNP位點(diǎn)(g.811T>C、 g.1320G>A和g.1892T>C)與初產(chǎn)蛋質(zhì)量顯著或極顯著相關(guān)(P<0.05或P<0.01)。GnIH激素能在下丘腦水平同抑制促卵泡生成素和促黃體素的分泌，間接參與卵巢卵泡的發(fā)育成熟及排卵。除了下丘腦水平的抑制繁殖作用外，GnIH受體也在卵泡顆粒層細(xì)胞表達(dá)，直接參與卵泡的生長(zhǎng)、成熟。此外，貓的腔前卵泡中發(fā)現(xiàn)GnIH的同源類似物RFRP3促進(jìn)卵泡基底膜降解、細(xì)胞凋亡并抑制孕酮分泌，最終導(dǎo)致卵泡閉鎖[27]。卵泡的發(fā)育結(jié)果最終反映在蛋的品質(zhì)、數(shù)量及質(zhì)量上。由此推測(cè)，GnIH基因上的堿基突變可能會(huì)影響卵泡生產(chǎn)成熟、最終影響初產(chǎn)蛋質(zhì)量性狀。

3.3 關(guān)于四川白鵝GnIH基因多肽性與體尺性狀關(guān)系的討論

基因外顯子2上的SNP位點(diǎn)g.2164C>G與體尺性狀的多個(gè)指標(biāo)，如頸長(zhǎng)、胸寬和脛圍均出現(xiàn)顯著性相關(guān)?；蛏系倪@個(gè)突變位點(diǎn)導(dǎo)致外顯子2上編碼的脯氨酸突變?yōu)榫彼幔挥诔墒祀牧呀馕稽c(diǎn)(PEER)旁，這一突變潛在影響GnIH成熟肽的生成。Lima等[28]研究人的GnIH編碼基因NPVF及其受體GPR147基因多態(tài)性與2種促性腺激素釋放激素依賴性青春期疾病(特發(fā)性中樞性早熟和常壓下孤立性促性腺激素低下癥)的發(fā)生的關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)GnIH前體蛋白71位異亮氨酸的缺失與特發(fā)性性早熟顯著相關(guān)。目前，尚沒(méi)有鵝GnIH與體組成性狀關(guān)聯(lián)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但已有研究表明GnIH在攝食、生長(zhǎng)及糖代謝等方面發(fā)揮重要作用[29]，這些環(huán)節(jié)均會(huì)間接影響鵝的體組成性狀。Huo等[30]通過(guò)腹腔注射GnIH同源類似物RFRP3來(lái)觀測(cè)其對(duì)大鼠攝食量、膳食結(jié)構(gòu)、體質(zhì)量和葡萄糖代謝的影響。結(jié)果表明，大鼠腹腔注射RFRP3后，大鼠體質(zhì)量明顯增加，高吞噬、高脂血癥、高血糖、糖耐量低、胰島素低、高血糖、胰島素抵抗，胰島大小和炎癥反應(yīng)顯著增加，推測(cè)RFRP3可作為一種新的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子參與血糖穩(wěn)態(tài)。Gotlieb等[31]研究證實(shí)了在排除卵巢E2負(fù)反饋調(diào)節(jié)的情況下，RFRP3不是通過(guò)mPOAGnRH或RFRP3受體GPR147mrna來(lái)抑制循環(huán)LH排卵峰，而是通過(guò)抑制弓狀核Kiss1mRNA表達(dá)，進(jìn)而直接影響垂體性腺激素。由此推測(cè)，作為繁殖調(diào)控的重要基因GnIH基因能從采食、性激素調(diào)控、血糖調(diào)節(jié)等多個(gè)環(huán)節(jié)參與到鵝生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，影響鵝的體組成性狀。

GnIH基因的SNP位點(diǎn)與初產(chǎn)蛋質(zhì)量、體斜長(zhǎng)、脛長(zhǎng)、胸寬、脛圍等性狀顯著或極顯著相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，而與成48周齡蛋數(shù)、64周齡蛋數(shù)、出生體質(zhì)量、半潛水長(zhǎng)、骨盆寬、龍骨長(zhǎng)等性狀相關(guān)性不顯著(P>0.05)。GnIH基因的SNP位點(diǎn)可作為初產(chǎn)蛋質(zhì)量、體斜長(zhǎng)、脛長(zhǎng)、胸寬、脛圍等性狀的潛在的分子標(biāo)記。