黃芪保心湯對慢性心力衰竭模型大鼠心室重構(gòu)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的抑制作用

丁宇　趙殿臣　賞楠

摘要 目的：研究黃芪保心湯對慢性心力衰竭模型大鼠心室重構(gòu)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的抑制作用。方法：選取健康雄性SD級大鼠60只進行研究，將其按照隨機抽簽法等分成干預(yù)組、對照組以及模型組，每組20只。干預(yù)組與模型組大鼠建立慢性心力衰竭模型，對照組大鼠予以假手術(shù)處理。造模成功后，干預(yù)組予以黃芪保心湯干預(yù)，模型組、對照組大鼠予以等量生理鹽水注射干預(yù)。比較3組大鼠干預(yù)4周后的心功能，血清NT-proBNP、ST2水平，心肌細胞凋亡率以及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平。結(jié)果：模型組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）、每搏輸出量（SV）水平顯著低于對照組，而左室收縮末期直徑（LVESD）、左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）水平顯著高于對照組;干預(yù)組大鼠LVEF、FS、SV水平顯著高于模型組，且LVESD、LVEDD水平顯著低于模型組（均P<0.05）。模型組大鼠NT-proBNP、ST2水平均顯著高于對照組，而干預(yù)組大鼠N端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、基質(zhì)裂解素2（ST2）水平均顯著低于模型組（均P<0.05）。模型組大鼠的心肌細胞凋亡率顯著高于對照組，而干預(yù)組大鼠的心肌細胞凋亡率顯著低于模型組（均P<0.05）。模型組大鼠心肌Bcl-2蛋白表達水平顯著低于對照組，而Bax以及Caspase-3蛋白表達水平顯著高于對照組;干預(yù)組大鼠心肌Bcl-2蛋白表達水平顯著高于模型組，且Bax以及Caspase-3蛋白表達水平顯著低于模型組（均P<0.05）。結(jié)論：黃芪保心湯可有效抑制慢性心力衰竭模型大鼠心室重構(gòu)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡，其主要作用機制可能和影響心肌Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 慢性心力衰竭;動物實驗;黃芪保心湯;心室重構(gòu);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡;心功能;N端腦鈉肽前體;基質(zhì)裂解素2

Abstract Objective：To investigate the inhibitory effect of Huangqi Baoxin decoction on ventricular remodeling and endoplasmic reticulum stress apoptosis in rats with chronic heart failure.Methods：Sixty healthy male SD rats were selected for the study，and then randomly divided into a intervention group，a control group and a model group，with 20 rats in each.The rats in the intervention group and the model group were treated with sham surgery.After successful modeling，Huangqi Baoxin Decoction was given to the intervention group，and rats in the model group and control group were injected with equal amount of saline.Cardiac function，levels of serum NT-proBNP and ST2，apoptosis rate of cardiomyocytes，expression levels of bcl-2，Bax and caspase-3 were compared after 4 weeks of intervention among the three groups.Results：The levels of LVEF，F(xiàn)S and SV in the model group were significantly lower than those in the control group，while the levels of LVESD and LVEDD were significantly higher than those in the control group; The levels of LVEF，F(xiàn)S and SV in the intervention group were significantly higher than those in the model group，and the levels of LVESD and LVEDD were significantly lower than those in the model group（P<0.05）.The levels of NT-proBNP and ST2 in the model group were significantly higher than those in the control group，while the levels of NT-proBNP and ST2 in the intervention group were significantly lower than those in the model group（P<0.05）.The apoptosis rate of cardiomyocytes in the model group was significantly higher than that in the control group，while that in the intervention group was significantly lower than that in the model group（P<0.05）.The expression level of bcl-2 protein in the model group was significantly lower than that in the control group，while the expression level of Bax and caspase-3 protein was significantly higher than that in the control group.The expression level of bcl-2 protein in rats in the intervention group was significantly higher than that in the model group，and the expression level of Bax and caspase-3 protein was significantly lower than that in the model group（P<0.05）.Conclusion：Huangqi Baoxin decoction can inhibit ventricular remodeling and endoplasmic reticulum stress apoptosis in rats with chronic heart failure，and its main mechanism may be associated with the expression of bcl-2，Bax and caspase-3 in myocardium.

Keywords Chronic heart failure; Animal experiments; Huangqi Baoxin decoction; Ventricular remodeling; Endoplasmic reticulum stress apoptosis; Cardiac function; N-terminal forebrain natriuretic hormone; Matrix lysin 2

中圖分類號：R285.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.010

隨著近年來人們生活水平的不斷提高以及人口老齡化問題的日益凸顯，慢性心力衰竭的發(fā)病率正呈逐年升高趨勢，該病患者預(yù)后普遍較差，5年生存率不足50%[1-2]。心室重構(gòu)乃是慢性心力衰竭的發(fā)病基礎(chǔ)，其主要表現(xiàn)包括心肌纖維化，其和心肌梗死、瓣膜病以及心肌疾病等密切相關(guān)，往往是由過度的心室負荷和（或）心肌成活細胞大量減少導(dǎo)致[3-4]。心室重構(gòu)的分子機制相對復(fù)雜，細胞凋亡、胚胎基因以及蛋白的再編碼等因素均可能增加心室重構(gòu)的發(fā)生。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)屬于細胞內(nèi)最大細胞器，亦是蛋白質(zhì)修飾、折疊以及鈣儲存的重要場所之一[5-6]。一系列病理因素均可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯折疊蛋白的過度積聚以及鈣穩(wěn)態(tài)失衡，進一步引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，其中持續(xù)過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)會對細胞造成顯著的損害，促使內(nèi)環(huán)境紊亂難以快速恢復(fù)，從而引起信號從促生存向促凋亡機制轉(zhuǎn)變，最終誘發(fā)細胞凋亡[7-8]。鑒于此，本研究通過探討黃芪保心湯對慢性心力衰竭模型大鼠心室重構(gòu)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的抑制作用，旨在明確黃芪保心湯治療慢性心力衰竭的重要機制，繼而為其應(yīng)用于臨床治療中提供理論依據(jù)，現(xiàn)作以下報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取健康雄性SD級大鼠60只進行研究，體質(zhì)量200～220 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：粵監(jiān)證字2012c066。所有大鼠均常規(guī)喂養(yǎng)于室溫20～24 ℃，濕度40%的條件下，只有進食以及飲水。

1.1.2 藥物 黃芪保心湯（江蘇頤海藥業(yè)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號：160601）;水合氯醛（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號：20130426）;肝素鈉注射液骨質(zhì)（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：51605116）。

1.1.3 試劑與儀器 甲醛（南京化學(xué)試劑有限公司，批號：14021810257）;HE染色劑（湖北百奧斯生物科技有限公司，批號：BP0210）;中性樹脂（國藥集團，批號：10004160）;大鼠N端腦鈉肽前體（NT-proBNP）和基質(zhì)裂解素2（ST2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：19021250257）;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物公司，貨號：C0003）;小鼠超敏二步法檢測試劑盒（貨號：D1103）、DAB顯色試劑盒（貨號：S-1503）、檸檬酸鹽緩沖液（貨號：QN0125）購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔抗Bcl-2（貨號：P4768）、Bax（貨號：N3168）、Caspase-3多克隆抗體（貨號：ABP0114）購自英國Abcam公司;RIPA裂解液（貨號：P0013D）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：AR0146）購自碧云天生物技術(shù)有限公司。VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號：Vivid i）;電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，型號：BSA423S）;離心機（Eppendorf公司，德國，型號：iCEN-24R）;超低溫冰箱（Thermo Scientific公司，美國，型號：Lexicon Ⅱ）;CX31顯微鏡（Olympus，日本，型號：CX31）;超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司，型號：KLCZ系列）;電泳儀（BIO-RAD公司，美國，型號：Bio-Rad iQ5）;脫色搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，型號：TS-3）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）大鼠分組：將所有大鼠按照隨機抽簽法等分成干預(yù)組、對照組以及模型組，每組20只。2）大鼠處理：干預(yù)組與模型組大鼠均進行慢性心力衰竭造模：采用3%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉處理，使用劑量為1.5 mL/kg，取腹部正中劍突下作一2 cm的切口，依次切開皮膚、打開腹腔，于左腎動脈上方分離腹主動脈。隨后取0號絲線穿過，取7號手術(shù)針（已區(qū)尖磨鈍）放置在絲線部位，結(jié)扎絲線，抽取手術(shù)針，明確腹主動脈通暢后關(guān)腹。對照組大鼠僅分離腹主動脈，但不結(jié)扎處理。

1.2.2 干預(yù)方式 干預(yù)組大鼠予以黃芪保心湯干預(yù)，及予以黃芪保心湯22.68 g生藥/（kg·d），連續(xù)干預(yù)4周。模型組大鼠和對照組大鼠予以等量生理鹽水注射干預(yù)，使用劑量為12 mL/kg，1次/周，連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.3 心臟超聲檢測 3組大鼠干預(yù)4周后均取仰臥位，以VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀進行掃描，取胸骨旁左室長軸切面，獲取左心室標(biāo)準(zhǔn)區(qū)圖像，分別完成左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮末期直徑（LVESD）、左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左心室短軸縮短率（FS）、每搏輸出量（SV）的測量，結(jié)果均取3個心動周期的平均值。

1.2.4 NT-proBNP、ST2水平檢測 對大鼠實施開腹、分離腹主靜脈處理，取靜脈血5 mL，以3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取血清以ELISA進行檢測，具體操作務(wù)必以試劑盒說明書為主。

1.2.5 心肌細胞凋亡檢測 采用TUNEL染色心肌組織，于光學(xué)顯微鏡下計數(shù)并拍照，遵循一步法TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書完成心肌細胞凋亡情況的檢測。

1.2.6 心肌Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表達檢測 以Western Blotting法完成，具體操作務(wù)必按照試劑盒說明書進行，采用Image J軟件實施灰度分析，檢測蛋白和內(nèi)參β-actin的灰度比值校正誤差，以相對灰度值表示蛋白相對表達水平。

1.2.7 評價標(biāo)準(zhǔn) 慢性心力衰竭大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)如下[9-10]：造模后大鼠常規(guī)喂養(yǎng)逐漸出現(xiàn)呼吸加快、心跳加快以及食欲減退等表現(xiàn)，且LVEF<60%，左心室舒張末壓（LVEDP）≥15 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，予以t檢驗。多組間對比采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心臟彩超指標(biāo)比較 模型組大鼠LVEF、FS、SV水平顯著低于對照組，而LVESD、LVEDD水平顯著高于對照組;干預(yù)組大鼠LVEF、FS、SV水平顯著高于模型組，且LVESD、LVEDD水平顯著低于模型組（均P<0.05）。見表1。

2.2 3組大鼠NT-proBNP、ST2水平比較 模型組大鼠NT-proBNP、ST2水平均顯著高于對照組，而干預(yù)組大鼠NT-proBNP、ST2水平均顯著低于模型組（均P<0.05）。見表2。

2.3 3組大鼠心肌細胞凋亡率比較 模型組大鼠的心肌細胞凋亡率顯著高于對照組，而干預(yù)組大鼠的心肌細胞凋亡率顯著低于模型組（均P<0.05）。見表3。

2.4 3組大鼠心肌Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表達水平比較 模型組大鼠心肌Bcl-2蛋白表達水平顯著低于對照組，而Bax以及Caspase-3蛋白表達水平顯著高于對照組;干預(yù)組大鼠心肌Bcl-2蛋白表達水平顯著高于模型組，且Bax以及Caspase-3蛋白表達水平顯著低于模型組（均P<0.05）。見表4，圖1。

3 討論

隨著近年來中醫(yī)藥在臨床慢性心力衰竭中的應(yīng)用日益廣泛，因其具有多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)以及安全性較高等特點，從而受到國內(nèi)外的重點關(guān)注[11-12]。黃芪保心湯是我國張培影教授通過多年的臨床經(jīng)驗總結(jié)，綜合中醫(yī)經(jīng)典理論以及現(xiàn)代藥理學(xué)研究，精心化裁組方而來，且應(yīng)用于臨床疾病的治療中時間較長，療效明顯[13-15]。迄今為止，臨床上尚未見到黃芪保心湯治療慢性心力衰竭大鼠模型的相關(guān)研究。鑒于前期臨床以及基礎(chǔ)工作，設(shè)想黃芪保心湯可能抑制抑制神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活，繼而逆轉(zhuǎn)慢性心力衰竭心室重構(gòu)的發(fā)生，其分支作用機制可能和抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與的心肌細胞凋亡密切相關(guān)。故此，本研究通過建立慢性心力衰竭大鼠模型，探討黃芪保心湯改善大鼠心室重構(gòu)的作用，并分析其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的抑制作用，旨在明確黃芪保心湯抑制慢性心力衰竭大鼠心室重構(gòu)的分子機制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的心功能相較于對照組明顯更差，而干預(yù)組大鼠心功能明顯優(yōu)于對照組。這表明了黃芪保心湯應(yīng)用于慢性心力衰竭模型大鼠中的效果顯著，可促進大鼠心功能的恢復(fù)。分析原因，可認(rèn)為黃芪保心湯以黃芪、黨參為君藥，具有健脾益氣以及滋養(yǎng)五臟的功效;以鱉甲、當(dāng)歸、丹參以及連翹作為臣藥，具有養(yǎng)陰助黃芪、黨參兩君藥扶正，亦可發(fā)揮解毒化瘀的功效;麥冬、五味子乃是佐藥，可輔助君臣發(fā)揮益氣生津以及養(yǎng)心安神的功效;桂枝以及茯苓屬使藥，主要是發(fā)揮中陽得運、水濕得利的功效[16]。諸藥共用，可達益氣養(yǎng)陰、祛邪扶正、解毒化瘀的功效，使固五臟之本，貫通心脈、血運不息，邪去乃心安[17-19]。此外，黃芪保心湯干預(yù)可顯著降低慢性心力衰竭模型大鼠NT-proBNP、ST2水平。這表明了黃芪保心湯可有效抑制慢性心力衰竭模型大鼠心室重構(gòu)。究其原因，可認(rèn)為NT-proBNP是自體心室細胞所分泌而來的一種激素，其濃度的高低可反映心力衰竭程度以及評估預(yù)后，乃是公認(rèn)的心力衰竭評價指標(biāo)[20-22]。ST2主要是心肌遭受機械刺激后，在相應(yīng)的應(yīng)變力狀態(tài)下自發(fā)產(chǎn)生的蛋白之一，其可通過成纖維細胞以正常細胞進行表達，可作為心肌肥厚以及心肌纖維化的指標(biāo)，且不會受到腎功能、年齡、體質(zhì)量等因素的影響[23-24]。另外，黃芪保心湯干預(yù)可有效抑制慢性心力衰竭大鼠的心肌細胞凋亡。其中主要原因可能在于：黃芪保心湯有效改善慢性心力衰竭大鼠心臟擴大、纖維化以及心功能異常，通過調(diào)節(jié)氧化因子、抑制RAAS神經(jīng)內(nèi)分泌因子激活，繼而發(fā)揮抑制心室重構(gòu)的作用。另外，黃芪保心湯干預(yù)可明顯上調(diào)慢性心力衰竭模型大鼠的心肌Bcl-2蛋白表達，同時下調(diào)Bax以及Caspase-3蛋白表達。其中Bcl-2是最早被證實和凋亡密切相關(guān)的基因之一，其具有差異性Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域，且對多種因素導(dǎo)致的細胞凋亡均具有顯著的抑制作用，其可作為凋亡各種信號途徑存在共有通路以及節(jié)點，對細胞凋亡具有調(diào)控作用[25-26]。Bax基因則和Bcl-2存在相反的作用，其轉(zhuǎn)錄的Bax蛋白和Bcl-2蛋白存在同源性，上述2種蛋白和結(jié)合形成異二聚體，從而對Bcl-2的抗凋亡作用產(chǎn)生抑制[27-28]。由此可見，Bax蛋白的高表達可促進細胞凋亡的發(fā)生，而Bcl-2的高表達可抑制細胞的凋亡，二者表達水平的平衡是細胞凋亡程度調(diào)控的重要機制，共同決定著細胞的命運。而Caspase-3參與了心肌凋亡的死亡受體途徑以及線粒體途徑，其不但可接收上游傳導(dǎo)的凋亡信號，而且可作為最終凋亡效應(yīng)因子，從而執(zhí)行細胞凋亡，是凋亡過程中最為重要的一種蛋白酶，其在心肌組織中的表達水平可在一定程度上反映心肌細胞凋亡程度[29-30]。這充分說明了黃芪保心湯有效抑制慢性心力衰竭大鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡，其主要作用機制可能和影響心肌Bcl-2、Bax以及Caspase-3蛋白表達有關(guān)。然而，本研究尚且存在一定的局限性，如實驗未開展多個干預(yù)時間點的比較研究，且未對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路進行全面研究等。這為我們今后的研究提供了新的方向和思路。

綜上所述，黃芪保心湯可通過抑制慢性心力衰竭模型大鼠心室重構(gòu)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡，繼而促進心功能的恢復(fù)。

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（2020-01-07收稿 責(zé)任編輯：王明）