酚類菊糖衍生物的制備及抗氧化活性

李 青，譚文強(qiáng)，苗 芹，郭占勇

（中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003）

菊糖，又名菊粉，具有調(diào)節(jié)腸胃功能、提高免疫力及促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等多種保健作用，可以用作食品添加劑和膳食補(bǔ)充劑，已有40多個(gè)國(guó)家將其批準(zhǔn)為功能食品，并廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、保健品、食品工業(yè)等領(lǐng)域[1-3]。在我國(guó)菊糖也正在被大眾所認(rèn)知，菊糖生產(chǎn)及其相關(guān)行業(yè)迅速增長(zhǎng)。菊糖具有一定的生物活性，作為一類可再生、無(wú)毒、生物相容性好的天然多糖，來(lái)源豐富，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，且有可修飾的羥基，具有較大的結(jié)構(gòu)修飾空間。因此，通過(guò)化學(xué)修飾對(duì)菊糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)改性提高其生物性能的相關(guān)研究備受關(guān)注。目前在天然多糖化學(xué)修飾的相關(guān)研究中，殼聚糖和甲殼素等報(bào)道較多[4-8]，而針對(duì)菊糖的結(jié)構(gòu)改性及相應(yīng)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)相對(duì)較少。有文獻(xiàn)報(bào)道在菊糖上連接咪唑環(huán)并季銨化后，菊糖衍生物質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基（O－2·）和羥自由基（·OH）的清除率分別為67.8%和86.7%[9]，與菊糖相比有大幅度提高。本課題組前期研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，在多糖上連接活性基團(tuán)可以提高其抑菌性和抗氧化活性。連接三氮唑鎓鹽的殼聚糖衍生物和菊糖衍生物都表現(xiàn)出很高的清除能力（半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）＜0.01 mg/mL），與抗壞血酸相近。由此可見(jiàn)，通過(guò)化學(xué)修飾提高菊糖的抗氧化活性有非常大的潛力。

近些年，氧化應(yīng)激引起的健康問(wèn)題受到很大的重視，其誘導(dǎo)機(jī)體衰老并加劇阿爾茨海默病、心血管疾病、惡性腫瘤等疾病[12]?？寡趸瘎┛梢郧宄^(guò)量的自由基減輕機(jī)體的氧化脅迫損傷，從而有助于延緩衰老，保護(hù)人體免受多種慢性疾病的侵襲[13]；另一方面能夠有效保證藥品品質(zhì)并延長(zhǎng)有效期，因此受到廣泛的關(guān)注，被食品、保健品、化妝品企業(yè)列為重要研發(fā)內(nèi)容[14-15]。自由基清除能力是抗氧化能力的重要指標(biāo)，菊糖本身就有一定的自由基清除能力，而且具有無(wú)毒、無(wú)刺激、生物相容性好、來(lái)源豐富、價(jià)格低廉和易修飾等優(yōu)點(diǎn)，是開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑的優(yōu)良選擇[11,16]。

為開(kāi)發(fā)菊糖衍生物的實(shí)際應(yīng)用性，本實(shí)驗(yàn)選擇兼具高生物活性和安全性的多酚類化合物，對(duì)菊糖進(jìn)行化學(xué)修飾。酚類化合物具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗過(guò)敏等活性[17]。有些酚類化合物在抗氧化、降血脂等方面有很強(qiáng)的藥理作用，被廣泛用于抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、預(yù)防阿爾茨海默癥、抑制血小板聚集等方面[18-21]?；诖?，在前期研究基礎(chǔ)上制備一系列共6 種酚基菊糖衍生物，并測(cè)定其抗氧化活性，以期為開(kāi)發(fā)菊糖衍生物在抗氧化劑或自由基清除劑等方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊糖（分子質(zhì)量8 000～12 000 Da） 西安百川生物科技有限公司；芳香醛（4-羥基苯甲醛、3-羥基苯甲醛、3,4-二羥基苯甲醛、2,3-二羥基苯甲醛、3-甲氧基-4-羥基苯甲醛和3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，純度≤98%）默克生命科學(xué)（上海）有限公司；碘甲烷、碘化鈉、氫氧化鈉、N-溴丁亞胺、三苯基膦、溴化鉀、乙二胺均為分析級(jí) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IS50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 上海賽默飛科技有限公司；AVIII-500核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）光譜儀 瑞士Bruker公司；DNM-9602G酶標(biāo)儀 北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菊糖衍生物的合成

菊糖衍生物的合成路線如圖1所示。

圖1 菊糖衍生物制備路線Fig. 1 Synthetic routes for the preparation of inulin derivatives

溴代菊糖（化合物1）的合成：按照文獻(xiàn)[22]中所述方法進(jìn)行。以N-溴代丁二酰亞胺（N-bromosuccinimide，NBS）為溴代試劑與菊糖C6位伯羥基反應(yīng)合成溴代菊糖（化合物1）。

化合物2的合成：在室溫下取2 mmol化合物1加入5 mL乙二胺中，在60 ℃攪拌反應(yīng)16 h后將混合物倒入過(guò)量無(wú)水乙醇中，過(guò)濾沉淀，用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌，收集沉淀，冷凍干燥得6-N-(氨基乙基)-6-脫氧菊糖（化合物2）。

化合物3的合成：將1.0 mmol化合物2與1.5 mmol羥基苯甲醛（4-羥基苯甲醛、3-羥基苯甲醛、3,4-二羥基苯甲醛、2,3-二羥基苯甲醛、2-甲氧基-3-羥基苯甲醛和2,4-二甲氧基-3-羥基苯甲醛）加入10 mL二甲基亞砜中，75 ℃氬氣保護(hù)下攪拌20 h，然后將混合物倒入過(guò)量無(wú)水乙醇中，過(guò)濾沉淀，用乙醇反復(fù)洗滌。產(chǎn)物在索氏提取器中用無(wú)水乙醇提取48 h，產(chǎn)物在60 ℃下干燥24 h。

1.3.2 菊糖及其衍生物的FTIR和1H NMR分析

取一定量菊糖及1.3.1節(jié)制備的菊糖衍生物進(jìn)行FTIR分析，KBr壓片，掃描范圍為4 000～500 cm－1。對(duì)1.3.1節(jié)制備的菊糖衍生物進(jìn)行1H NMR分析，頻率500 MHz，溶劑為氘代二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6）。

1.3.3 抗氧化活性測(cè)定1

按照文獻(xiàn)[23]的方法進(jìn)行，并稍加修改。用蒸餾水配制質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.2、0.4、0.8 mg/mL的樣品溶液?！ぴ诜脏毫蛩峒柞ィ╬henazine methosulfate，PMS）-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide ad enine dinucleotide，NADH）體系中產(chǎn)生。用Tris-HCl緩沖液（16 mmol/L、pH 8.0）分別配制NADH（365.7 μg/mL）、硝基藍(lán)四氮（245.3 μg/mL）和PMS（18.38 μg/mL）溶液。分別取0.5 mL NADH、PMS、硝基藍(lán)四氮溶液與不同質(zhì)量濃度樣品溶液混合，使混合溶液中樣品終質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.05、0.1、0.2 mg/mL。按以上方法配制混合溶液，以不加樣品溶液為空白組，不加NADH的溶液為對(duì)照組。室溫反應(yīng)5 min，于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度（A560nm）。清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A樣品表示樣品組溶液A560nm；A對(duì)照表示對(duì)照組溶液A560nm；A空白表示空白組溶液A560nm。

1.3.3.2 ·OH清除能力

·OH清除能力按照文獻(xiàn)[24]的方法進(jìn)行，并稍加修改。用蒸餾水配制質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.4 mg/mL的樣品溶液，用磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）配制體積分?jǐn)?shù)3% H2O2溶液、360 μg/mL番紅花T溶液和2 mmol/L乙二胺四乙酸-Fe2＋溶液。分別取0.25 mL乙二胺四乙酸-Fe2＋溶液、0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液、0.5 mL番紅花T溶液、0.5 mL H2O2溶液與0.25 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液混合，使混合溶液中樣品終質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 mg/mL。按以上方法配制混合溶液，以不加樣品溶液作為空白組，不加樣品溶液和H2O2溶液作為對(duì)照組。37 ℃反應(yīng)30 min，于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度（A560nm）?！H清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A樣品表示樣品組溶液A560nm；A對(duì)照表示對(duì)照組溶液A560nm；A空白代表空白組溶液A560nm。

1.3.3.3 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力按照文獻(xiàn)[25]的方法進(jìn)行。用蒸餾水配制質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.1、0.2 mg/mL的樣品溶液，用無(wú)水乙醇配制180 μmol/L DPPH溶液。分別取1 mL DPPH溶液和1 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液混合，使混合溶液中樣品終質(zhì)量濃度分別為0.002 5、0.005、0.01、0.05、0.1 mg/mL。按以上方法配制混合溶液，以不加樣品溶液作為空白組，用乙醇代替DPPH溶液作為對(duì)照組。室溫反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處溶液吸光度（A517nm）。DPPH自由基清除率按式（3）計(jì)算。

式中：A樣品表示樣品組溶液A517nm；A對(duì)照表示對(duì)照組溶液A517nm；A空白代表空白組溶液A517nm。

1.3.3.4 還原能力

按照文獻(xiàn)[26]的方法進(jìn)行，并稍加修改[26]。用蒸餾水配制質(zhì)量濃度分別為0.03、0.17、0.33、0.67、1 mg/mL的樣品溶液。分別取0.3 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液與0.3 mL 1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃反應(yīng)20 min，然后加入0.3 mL體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，離心后取上清液加入0.1 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵溶液，室溫反應(yīng)10 min后，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度（A700nm）。用吸光度表示還原能力。

1.3.3.5 Fe2＋螯合能力

Fe2＋螯合能力按照文獻(xiàn)[26]方法進(jìn)行測(cè)定。分別取1.8 mL無(wú)水甲醇、0.05 mL 2 mmol/L氯化亞鐵溶液、0.1 mL 5.0 mmol/L菲洛嗪溶液與0.05 mL不同質(zhì)量濃度（0.04、0.4、2、4、6 mg/mL）的樣品溶液混合，使混合溶液中樣品終質(zhì)量濃度分別為0.001、0.01、0.05、0.1、0.15 mg/mL。按以上方法配制混合溶液，以不加樣品溶液作為空白組。室溫反應(yīng)10 min，于562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度（A562nm）。Fe2＋螯和率按式（4）計(jì)算。

式中：A樣品表示樣品組溶液A562nm；A空白表示空白組溶液A562nm。

抗氧化活性指標(biāo)（還原能力除外）均以IC50表示。

1.3.4 細(xì)胞毒性測(cè)定

以L929細(xì)胞為模型，對(duì)菊糖及其衍生物進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。采用CCK-8法進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)定[23]。L929細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，配制為濃度1.0×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，每孔100 μL。37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入不同質(zhì)量濃度（31.25、62.5、125、250 μg/mL）的菊糖及其衍生物溶液100 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度3～5 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，離心，吸取上層清液，每孔加入100 μL CCK-8試劑，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度（A450nm）。用等體積蒸餾水代替樣品溶液作為對(duì)照組。細(xì)胞存活率按式（5）計(jì)算。

式中：A樣品代表樣品組A450nm；A對(duì)照代表對(duì)照組A450nm。

細(xì)胞培養(yǎng)方法同上。使用不同質(zhì)量濃度的菊糖衍生物化合物3C處理L929細(xì)胞24 h后，用普通光學(xué)顯微鏡在放大20 倍的亮場(chǎng)下觀察L929細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚基菊糖衍生物的合成

以菊糖為原料通過(guò)簡(jiǎn)單的三步反應(yīng)合成酚類菊糖衍生物。首先，以NBS為溴代試劑與菊糖C6位伯羥基反應(yīng)合成溴代菊糖（化合物1），因?yàn)樵谌交⒋嬖谙翹BS可以選擇性地與伯羥基反應(yīng)[11]；然后，通過(guò)乙二胺與溴代菊糖的親核反應(yīng)將乙基氨基引入菊糖，制備6-N-(氨基乙基)-6-脫氧菊糖（化合物2）；最后，羥基苯甲醛與化合物2末端基團(tuán)氨基反應(yīng)，在菊糖上引入具有C＝N結(jié)構(gòu)的酚基（化合物3）。

圖3 菊糖衍生物的1H NMR圖Fig. 3 1H NMR spectra of inulin derivatives

化合物3根據(jù)合成后R取代基的不同分為6 種，即化合物3A～F。對(duì)化合物2和化合物3A～F進(jìn)行FTIR分析和1H NMR分析（圖2、3）。

圖2 菊糖及其衍生物的FTIR圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of intermediate products and inulin derivatives

化合物2：FTIR：3 353（－NH2和－OH）、1 648 cm－1（－NH2）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.51（CH2－NH2）、2.62（CH2－NHCH2）和δ3.51、3.58（NH－CH2－CH2）。

化合物3A：FTIR：3 356（－NH2和－OH）、1 647 cm－1（N－H）和1 605、1 586 cm－1（苯環(huán)C＝C）以及838 cm－1（苯環(huán)C－H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.77、2.86（CH2－NH－CH2），δ6.80、7.56（苯環(huán)－H）以及δ8.16（CH＝N）。

化合物3B：FTIR：3 363（－NH2和－OH）、1 647（－NH－）、1 596 cm－1（苯環(huán)C＝C）和873、790、693 cm－1（苯環(huán)C－H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.79、2.90（CH2－NH－CH2），δ7.01、7.2（苯環(huán)－H）和δ8.15（CH＝N）。

化合物3C：FTIR：3 373（－NH2和－OH）、1 648（－NH－）、1 601（苯環(huán)C＝C）、823 cm－1（苯環(huán)C－H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.78、2.85（CH2－NH－CH2），δ6.76～7.18（苯環(huán)－H），δ8.09（CH＝N）。

化合物3D：FTIR：3 362（－NH2和－OH）、1 636 cm－1（－NH－）和784、737 cm－1（苯環(huán)C－H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.79、2.89（CH2－NH－CH2），δ6.57～6.82（苯環(huán)－H）和δ8.47（CH＝N）。

化合物3E：FTIR：3 373（－NH2和－OH）、1 647（－NH－）、1 594 cm－1（苯環(huán)C＝C）和877、827 cm－1（苯環(huán)C－H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.81、2.89、3.10（CH2－NH－CH2），δ3.67（OCH3），δ6.82～7.31（苯環(huán)－H）和δ8.19（CH＝N）。

化合物3F：FTIR：3 385（－NH2和－OH）、1 644（－NH－）、1 605（苯環(huán)C＝C）、835 cm－1（苯環(huán)C＝H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.82、2.91（CH2－NH－CH2），δ3.44（OCH3），δ7.01（苯環(huán)－H）和δ8.15（CH＝N）。

在FTIR圖譜中，與菊糖相比，終產(chǎn)物菊糖衍生物3A～F在1 600 cm－1附近出現(xiàn)新的振動(dòng)吸收峰，為苯環(huán)C＝C鍵的伸縮振動(dòng)峰，700～900 cm－1之間出現(xiàn)的新的吸收峰為苯環(huán)上C－H變形振動(dòng)峰。這些峰都是苯環(huán)的特征吸收峰，由此表明酚基菊糖衍生物制備成功。在1H NMR譜圖中，在δ3.0～5.0處的信號(hào)峰主要為糖骨架的氫峰，δ2.7～2.9之間的信號(hào)峰為亞胺及相連的亞甲基的氫峰，δ6.5～7.3之間為苯環(huán)上氫質(zhì)子的信號(hào)峰；δ8.1附近的信號(hào)峰為C＝N上的氫峰。δ2.7～2.9、6.5～7.3和δ8.1附近的3 組峰均為苯環(huán)及C＝N的特征峰，進(jìn)一步證明酚基成功連接到菊糖上。

2.2 酚基菊糖衍生物抗氧化活性

抗氧化劑的抗氧化活性可以通過(guò)多種途徑實(shí)現(xiàn)，包括清除分子氧或降低分子氧局部濃度、去除金屬離子、捕獲O·或過(guò)氧化氫等活性氧（reactive oxygen species，ROS），清除·OH、RO·或ROO·等可以引發(fā)鏈反應(yīng)的自由基，猝滅氧單質(zhì)[27]。為研究這些酚基菊糖衍生物的抗氧化活性，測(cè)定其自由基清除能力、還原能力和Fe2＋螯合能力。

2.2.1 自由基清除能力

自由基是一類含有一個(gè)或多個(gè)未配對(duì)電子的活性物質(zhì)[12,28]。體內(nèi)的自由基大多是ROS或活性氮。本實(shí)驗(yàn)選擇2 種典型的ROS（O·和·OH）和一種活性氮（DPPH自由基），考察酚類菊糖衍生物的自由基清除能力。

由圖4可知，菊糖與菊糖衍生物對(duì)DPPH自由基的清除能力均隨質(zhì)量濃度的增大而增大。菊糖本身的DPPH自由基清除能力有限，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基清除率最高僅達(dá)到13.9%（0.1 mg/mL），對(duì)·OH清除率最高只有20.68%（0.3 mg/mL），對(duì)O2－·清除率最高只有22.4%（0.2 mg/mL）。與菊糖相比，菊糖衍生物具有更強(qiáng)的自由基清除能力，說(shuō)明酚基的存在增強(qiáng)了菊糖衍生物的自由基清除能力。此外，連接雙酚的菊糖衍生物（化合物3C、3D）較連接單酚的菊糖衍生物（化合物3A、3B和化合物3E、3F）的自由基清除能力高。連接雙酚的化合物3C、3D對(duì)DPPH清除能力的IC50均為0.007 mg/mL，較VE（IC50為0.01 mg/mL[29]）的DPPH自由基清除能力高；化合物3C清除O2－·的IC50為0.042 mg/mL。

圖4 不同質(zhì)量濃度菊糖和菊糖衍生物的DPPH自由基（A）、·OH（B）和O2－·（C）清除能力Fig. 4 DPPH radical (A), ·OH (B) and O2-· (C) scavenging capacity of inulin and inulin derivatives at different concentrations

酚類化合物在清除自由基的過(guò)程中，一般是通過(guò)失去H原子形成芳氧自由基（中間體1、2），H原子在苯環(huán)上相鄰的兩個(gè)氧之間快速交換，共振體的存在降低了體系內(nèi)能，使芳氧自由基更穩(wěn)定。形成的自由基越穩(wěn)定，該化合物的自由基清除能力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)制備的酚類菊糖衍生物中，C＝N與苯環(huán)形成共軛結(jié)構(gòu)，有助于形成穩(wěn)定的芳氧自由基（圖5），相應(yīng)的酚類菊糖衍生物的清除自由基能力就更強(qiáng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，鄰苯二酚是多酚類化合物提供電子或H原子的關(guān)鍵決定因素[30]。

圖5 菊糖衍生物清除自由基的可能機(jī)理Fig. 5 Possible free radical scavenging mechanism for inulin derivatives

2.2.2 Fe2＋螯合能力

過(guò)渡金屬離子可以引發(fā)自由基反應(yīng)并引起脂質(zhì)過(guò)氧化和心血管疾病，造成DNA損傷[31]。螯合劑可以降低氧化還原電位，能作為輔助抗氧化劑控制金屬離子的氧化，并穩(wěn)定金屬離子的氧化形式。因此，對(duì)過(guò)渡金屬離子的螯合能力是與自由基清除能力密切相關(guān)的一種抗氧化能力。從圖6可以看出，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度（0.001～0.15 mg/mL）范圍內(nèi)，菊糖的Fe2＋螯合能力不強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL時(shí)，菊糖的Fe2＋螯合率為14.1%。連接酚基后，菊糖衍生物的Fe2＋螯合能力明顯提高，化合物3B的 Fe2＋螯合能力的IC50能夠達(dá)到0.006 mg/mL。

圖6 不同質(zhì)量濃度菊糖和菊糖衍生物的Fe2＋螯合能力Fig. 6 Fe2+ chelating ability of inulin and inulin derivatives at different concentrations

2.2.3 還原能力

化合物的還原能力可以作為評(píng)價(jià)其潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)[32]。由圖7可知，菊糖本身的還原能力很弱，連接酚基之后還原能力有所提高。整體來(lái)看，制備的酚基菊糖衍生物中，化合物3A、3B、3E、3F的還原能力較為接近，化合物3C、3D的還原能力明顯較強(qiáng)。這與自由基清除能力的結(jié)果相似，鄰二雙酚結(jié)構(gòu)的存在使得酚基菊糖衍生物具有更高的還原能力。一方面，鄰位的羥基通過(guò)共軛效應(yīng)供電子使得酚羥基上的氧電負(fù)性增大，還原能力增強(qiáng)；另一方面，分子中活性羥基的數(shù)量也是影響其還原能力的因素。因此，化合物3C和3D的還原能力更強(qiáng)。

圖7 不同質(zhì)量濃度菊糖和菊糖衍生物的還原能力Fig. 7 Reducing power of inulin and inulin derivatives at different concentrations

2.3 菊糖及其衍生物的生物相容性

以小鼠成纖維細(xì)胞L929為模型，通過(guò)CCK-8法測(cè)定菊糖及其衍生物的細(xì)胞毒性，以評(píng)價(jià)其生物相容性。從圖8可以看出，在0～125 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，沒(méi)有觀察到明顯的細(xì)胞毒性，但更高的質(zhì)量濃度（250 μg/mL）會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活率輕微下降（下降約10%）。L929細(xì)胞形態(tài)一般呈特征性紡錘形（圖9A～D），在質(zhì)量濃度為250 μg/mL時(shí)，細(xì)胞形態(tài)部分改變，可以發(fā)現(xiàn)少量溶出物（圖9E），進(jìn)一步證明了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度低于125 μg/mL時(shí)，帶有酚基的菊糖衍生物對(duì)L929細(xì)胞具有良好的生物相容性。這意味著這些菊糖衍生物在不損傷正常細(xì)胞的情況下具有較好的抗氧化活性。有研究[33-35]表明，經(jīng)化學(xué)改性制備的酚類殼聚糖衍生物可以作為具有抗氧化功能的食品添加劑及食品包裝材料。本實(shí)驗(yàn)制備的這些菊糖衍生物在具有優(yōu)良抗氧化活性的同時(shí)也有較好的生物相容性，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為酚類菊糖衍生物在食品中的應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。后期會(huì)繼續(xù)展開(kāi)體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定酚類菊糖衍生物的食品安全性。

圖8 菊糖和菊糖衍生物的L929細(xì)胞毒性Fig. 8 Cytotoxicity of inulin and inulin derivatives to L929 cells

圖9 經(jīng)菊糖衍生物化合物3C處理24 h后L929細(xì)胞的生長(zhǎng)情況Fig. 9 Microscopic images of inulin derivative 3C-treated L929 cells for 24 h

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)化學(xué)修飾在菊糖分子上引入具有高抗氧化活性的酚類基團(tuán)，合成了6 種酚類菊糖衍生物。通過(guò)測(cè)定自由基清除能力、還原能力和Fe2＋螯合能力等，研究酚類基團(tuán)對(duì)菊糖抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，酚基的引入極大地提高了菊糖衍生物的抗氧化活性，且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菊糖衍生物具有良好的生物相容性，有望應(yīng)用于食品和保健品領(lǐng)域。