解脂耶氏酵母作為微生物細(xì)胞工廠的應(yīng)用研究進(jìn)展

趙 禹，劉士琦，李 建，李圣龍，趙雅坤，肖冬光，于愛群,2,

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457）

合成生物學(xué)是近年發(fā)展起來的一門新興分支學(xué)科，其將工程、數(shù)學(xué)、生物學(xué)和化學(xué)等多個學(xué)科的研究理論和方法結(jié)合并應(yīng)用于生物系統(tǒng)，基于此提高生物系統(tǒng)的可控性[1-2]。經(jīng)過近20 年的快速發(fā)展，合成生物學(xué)已在能源、環(huán)境、食品、醫(yī)療和農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用，吸引了越來越多研究者的關(guān)注，發(fā)展前景極為廣闊[3-4]。解脂耶氏酵母于1942年被首次分離，先后被命名為Candida lipolytica、Endomycopsis lipolytica、Saccharomycopsis lipolytica，最終定名為Yarrowia lipolytica[5]。該酵母通常分布于富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的底物中，如奶制品或香腸等；并且已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證為公認(rèn)安全的微生物[6]。解脂耶氏酵母是目前研究最多、應(yīng)用最廣泛的非常規(guī)酵母之一，與常規(guī)酵母釀酒酵母相比，該酵母具有多種獨特的生化和代謝特征。第一，解脂耶氏酵母是典型的二型性酵母；第二，它是一種嚴(yán)格的好氧菌，基本不產(chǎn)乙醇[5]；第三，其胞內(nèi)具有高效的乙酰輔酶A代謝通路和較高的三羧酸循環(huán)通量，脂質(zhì)的積累量可達(dá)77%，因此非常適合有機(jī)酸、脂質(zhì)及其衍生物的工業(yè)生產(chǎn)[7-9]；第四，其可以分解油脂類化合物，在廢油污染的環(huán)境修復(fù)方面有重要作用。此外，解脂耶氏酵母可以在較低pH值（3～6）和較高的滲透壓條件下生長，并且其還可以利用多種碳源、蛋白質(zhì)和疏水性底物，如糖類、烴類、醇類、脂類等[5]，因此其對生長環(huán)境要求不嚴(yán)格，可在各種環(huán)境條件下生長，具有良好的工業(yè)應(yīng)用基礎(chǔ)。

近年來，解脂耶氏酵母全基因組序列已經(jīng)被公布，并且隨著合成生物學(xué)和基因編輯技術(shù)在解脂耶氏酵母中的不斷應(yīng)用與快速發(fā)展以及其表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化方法的不斷完善，研究者們利用解脂耶氏酵母作為底盤細(xì)胞進(jìn)行合成生物學(xué)的研究也取得了迅猛發(fā)展，這就進(jìn)一步擴(kuò)大了該酵母的工業(yè)應(yīng)用范圍。比如，研究者們利用合成生物學(xué)技術(shù)已實現(xiàn)了多種脂肪酸合成途徑在解脂耶氏酵母底盤中的重構(gòu)與優(yōu)化，如油酸[10]、蓖麻油酸[11]、共軛亞油酸[12]、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）[13]等。其中，美國杜邦公司已經(jīng)成功改造解脂耶氏酵母底盤，實現(xiàn)了對具有抗血栓、疏通血管和改善高血壓等作用EPA的異源工業(yè)化生產(chǎn)。此外，研究人員也利用解脂耶氏酵母作為工程菌株合成了其他高附加值產(chǎn)品，如生物材料、生物燃料、生物化學(xué)品、香料、藥物、工業(yè)酶和藥用蛋白等[14-26]。這些成功案例說明解脂耶氏酵母在上述行業(yè)中具備工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

綜上，對解脂耶氏酵母這一新型非模式微生物底盤的應(yīng)用和開發(fā)正在成為合成生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。本文主要介紹了解脂耶氏酵母在合成生物學(xué)和基因編輯技術(shù)方面的最新研究進(jìn)展，包括合成生物學(xué)元件、基因表達(dá)載體、基因組編輯方法等內(nèi)容；同時，也對近年來以解脂耶氏酵母作為底盤細(xì)胞生產(chǎn)具有代表性高附加值產(chǎn)品的研究進(jìn)行了全面總結(jié)；最后，對解脂耶氏酵母相關(guān)發(fā)展前景做出展望，以期為從事相關(guān)研究的人員提供有用信息。

1 解脂耶氏酵母基因表達(dá)系統(tǒng)及合成生物學(xué)元件研究進(jìn)展

通過對生物體內(nèi)源或外源基因的表達(dá)進(jìn)行精確的人工調(diào)控來平衡目標(biāo)途徑中不同酶的表達(dá)水平，并使代謝通量最大化，最終降低目的產(chǎn)物的合成成本是合成生物學(xué)的重要研究內(nèi)容之一。代謝途徑中酶的表達(dá)可以通過不同方式控制，如調(diào)控基因拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄活性、mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等。本文主要介紹解脂耶氏酵母中可用于有效控制外源基因轉(zhuǎn)錄的最基本也是最重要的合成生物學(xué)元件（啟動子、終止子）以及相關(guān)表達(dá)系統(tǒng)。

1.1 宿主菌株

同種微生物不同菌株的基因組間仍存在較多差異基因，進(jìn)而會影響菌株的形態(tài)、生理生化特征和產(chǎn)物生產(chǎn)模式，因此宿主菌株的選擇往往會對最終工程菌株的性能起決定性作用。對于解脂耶氏酵母而言，在基礎(chǔ)研究和實際生產(chǎn)中使用較多的野生型菌株主要包括W29（CLIB89）、H222（DSM 27185）和CBS6124-2等。目前，解脂耶氏酵母的常用參考菌株為E150（CLIB122）（最早完成全基因組測序和注釋），該菌株經(jīng)過W29和CBS6124-2的多次回交獲得。W29的營養(yǎng)缺陷型菌株——Po1d是早期基因工程和代謝工程改造中理想的宿主菌株，其主要有以下優(yōu)勢：1）外源蛋白表達(dá)和分泌水平高；2）整合了來自釀酒酵母的蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因SUC2，使其能以蔗糖為碳源，從而為所構(gòu)建的解脂耶氏酵母工程菌株能夠應(yīng)用糖蜜等廉價碳源進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵奠定基礎(chǔ)；3）內(nèi)源的堿性胞外蛋白酶編碼基因AEP被敲除，這有利于保護(hù)表達(dá)的外源蛋白不被降解。研究人員在Po1d菌株的基礎(chǔ)上開發(fā)出了一系列更適合表達(dá)外源蛋白的宿主菌株（Po1f、Po1g和Po1h），這些菌株已成為目前利用合成生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行異源生物合成等研究中廣泛使用的解脂耶氏酵母底盤細(xì)胞。其中，Po1g菌株更便于高效整合基于質(zhì)粒pBR322的外源質(zhì)粒，分子水平操作更加簡便。研究人員又在Po1d菌株的基礎(chǔ)上構(gòu)建了Y1212菌株，從而促進(jìn)了基于zeta序列（高度保守的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的長末端重復(fù)序列）[5]載體的整合。該菌株中脂肪酶相關(guān)編碼基因（LIP2、LIP7和LIP8）已被敲除，因此有利于在其中構(gòu)建脂質(zhì)代謝途徑[27]。此外，近年來研究者們從海洋環(huán)境中也分離出一些解脂耶氏酵母野生型菌株，如脂質(zhì)含量較高的ACA-DC 50109菌株，其經(jīng)過進(jìn)一步工程改造可用于單細(xì)胞油脂的生產(chǎn)[28]；蛋白含量高的SWJ-1b菌株是生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白或檸檬酸的理想宿主菌株[29-31]。表1主要列出了目前應(yīng)用較為廣泛的解脂耶氏酵母宿主菌株。

表1 常用的解脂耶氏酵母宿主菌株Table1 Most commonly used Y. lipolytica host strains

1.2 表達(dá)載體

表達(dá)載體通常是以天然質(zhì)粒為基礎(chǔ)，再經(jīng)體外人工構(gòu)建而形成的重組質(zhì)粒，需至少含有復(fù)制起始位點、選擇標(biāo)記基因和多克隆位點等功能元件。表達(dá)載體與宿主菌株兩部分一起構(gòu)成了一個完整的原核或真核表達(dá)系統(tǒng)。到目前為止，在解脂耶氏酵母中還尚未發(fā)現(xiàn)任何天然內(nèi)源性質(zhì)粒的存在，但是科學(xué)家們已經(jīng)利用自主復(fù)制序列和著絲粒序列設(shè)計出了可以在解脂耶氏酵母胞內(nèi)染色體外進(jìn)行自主復(fù)制的游離型質(zhì)粒[35-36]。然而，該游離型質(zhì)粒存在拷貝數(shù)較低（1～3 個/細(xì)胞）且易丟失的問題，因此并未得到廣泛應(yīng)用[5,33,37]。緊接著，科學(xué)家們又人工構(gòu)建了解脂耶氏酵母的整合型表達(dá)載體。在不加任何選擇壓力的條件下對工程菌株進(jìn)行連續(xù)傳代100 次以上，質(zhì)粒穩(wěn)定性仍保持在100%，這說明與游離型質(zhì)粒相比，整合型質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性更高。因此，目前用于外源基因表達(dá)的解脂耶氏酵母載體主要以整合型質(zhì)粒為主[38]，已經(jīng)商用的整合型質(zhì)粒主要有中國臺灣Yeastern公司生產(chǎn)的胞內(nèi)表達(dá)載體pYLEX1和分泌表達(dá)載體pYLSC1兩種[39]，其應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)成熟和廣泛。pYLEX1和pYLSC1均能夠通過同源重組的方式整合到解脂耶氏酵母宿主菌株基因組的特定位點上，該步驟的完成需要在序列的5’和3’端分別含有500～1 000 bp的同源臂[5]。然而，解脂耶氏酵母胞內(nèi)會優(yōu)先使用非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）進(jìn)行DNA修復(fù)，這就限制了同源重組的效率[40]。研究者們通過將解脂耶氏酵母表達(dá)宿主菌NHEJ途徑中的關(guān)鍵蛋白Ku70編碼基因進(jìn)行了敲除，成功獲得了同源重組精確率更高的菌株，也保證了表達(dá)載體的定點插入[41-42]。

1.3 合成生物學(xué)元件

1.3.1 啟動子

啟動子通常位于結(jié)構(gòu)基因的上游，是與RNA聚合酶特異性結(jié)合的一段DNA序列，可以決定轉(zhuǎn)錄的起始位置并控制轉(zhuǎn)錄起始時間和表達(dá)強(qiáng)度。啟動子是最核心的合成生物學(xué)元件之一，也是構(gòu)建基因表達(dá)載體的基本組件。選擇合適啟動強(qiáng)度的啟動子也是合成生物學(xué)研究控制基因表達(dá)的常用方法[43-44]。然而，對于解脂耶氏酵母而言，近期已有許多研究表明使用強(qiáng)啟動子并不一定能提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[45]。因此，需要進(jìn)一步對解脂耶氏酵母胞內(nèi)啟動子的功能特性進(jìn)行探索，以期為通過分子改造來開發(fā)性能更強(qiáng)、轉(zhuǎn)錄活性范圍更廣的人工合成啟動子和最終實現(xiàn)利用合成啟動子對解脂耶氏酵母中復(fù)雜代謝通路進(jìn)行有效調(diào)控提供指導(dǎo)。

堿性胞外蛋白酶基因的啟動子pXPR2[46]和翻譯延伸因子1-α基因的啟動子pTEF1[47]是從解脂耶氏酵母中最早分離鑒定并廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)盒（包括啟動子、基因編碼區(qū)和終止子）構(gòu)建的啟動子。其中，pXPR2為蛋白胨誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子，pTEF1為組成型強(qiáng)啟動子，這兩種啟動子均已實現(xiàn)了多種異源蛋白的高效表達(dá)。緊接著，許多其他不同類型的內(nèi)源性啟動子也逐漸被克隆與鑒定，并在解脂耶氏酵母基因工程、代謝工程和合成生物學(xué)研究中得到了成功應(yīng)用，如pTDH1、pGPM1、pFBA1、pPOX2、pPOT1、pLIP2、pICL1、pYAT和pEYK1等[13,48-50]。

目前的研究表明，解脂耶氏酵母啟動子功能元件的變化對啟動子活性具有較大的影響。例如，研究人員通過對解脂耶氏酵母pXPR2啟動子進(jìn)行分段功能分析，最終確定了上游增強(qiáng)序列（upstream activating sequence，UAS）1B是對啟動子活性影響最顯著的功能元件。隨后，Madzak等[51]在pLEU2核心啟動子上游串聯(lián)了不同拷貝數(shù)的UAS1B元件，構(gòu)建了人工啟動子文庫（含有php1d、php2d、php3d和php4d4 個啟動子）以進(jìn)一步驗證UAS1B元件的功能。結(jié)果表明，隨著UAS1B拷貝數(shù)的增加，啟動子強(qiáng)度不斷增加。目前，人工合成的組成型強(qiáng)啟動子php4d已經(jīng)成為在解脂耶氏酵母宿主菌中使用最廣泛的啟動子之一。Blazeck等[52]又在pLEU2和pTEF1的核心啟動子上游分別串聯(lián)了32 個和16 個UAS1B元件，改造后的啟動子活性最高提高了8 倍以上；通過將不同的UAS元件（UASTEF和UAS1B）進(jìn)行組合，構(gòu)建的啟動子表達(dá)活性比野生型啟動子提高了7 倍多[53]。此外，研究人員通過啟動子截短分析的方法鑒定出了新的核心啟動子序列，并嘗試對不同啟動子元件（UAS、近端序列、TATA框和核心啟動子序列）進(jìn)行人工重排，結(jié)果證明了核心啟動子序列是決定解脂耶氏酵母啟動子強(qiáng)度的關(guān)鍵因素[54]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，基于內(nèi)含子介導(dǎo)的基因增強(qiáng)效應(yīng)對啟動子的改造有助于提高基因的表達(dá)水平[55]。例如，Hong等[48]在pFBA1啟動子的基礎(chǔ)上構(gòu)建了添加部分內(nèi)含子序列的pFBA1IN啟動子，重組后的啟動子其活性提高了5 倍。Tai等[56]也構(gòu)建了pTEFin啟動子，其表達(dá)水平比無內(nèi)含子的pTEF提高了17 倍。綜上，這種人工合成啟動子的策略顯示出了較好的前景，也為對啟動子元件進(jìn)行進(jìn)一步人工改造提供了有效思路。然而，人工合成啟動子一般都是利用酵母天然啟動子作為骨架進(jìn)行改造，如UAS和核心啟動子，與細(xì)菌相比，改造后的啟動子序列相對較長。因此，通過定向或隨機(jī)突變來篩選表達(dá)范圍更廣的核心啟動子和序列更短、功能更強(qiáng)的UAS元件是將來人工啟動子工程的重要研究方向。

此外，由于誘導(dǎo)型啟動子能夠基于特定誘導(dǎo)物或阻遏物來調(diào)控目的基因的表達(dá)，因此這類啟動子在解脂耶氏酵母合成生物學(xué)的研究和應(yīng)用中成為一個研究熱點。目前在解脂耶氏酵母宿主菌中可用的誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子主要包括胞外脂肪酶基因啟動子pLIP2、過氧化物酶體?；o酶A氧化酶基因啟動子pPOX2、過氧化物酶體3-酮脂?；鵆oA硫解酶基因啟動子pPOT1、堿性胞外蛋白酶基因啟動子pXPR2和異檸檬酸裂合酶基因啟動子pICL1等[57-58]。表2列出了目前解脂耶氏酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動子，它們也在解脂耶氏酵母的合成生物學(xué)研究中展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。

表2 解脂耶氏酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動子Table2 Most prominently used promoters for heterologous expression in Y. lipolytica

1.3.2 終止子

和啟動子一樣，終止子也是非常重要的合成生物學(xué)元件之一。從作用機(jī)理上來看，終止子可以發(fā)出轉(zhuǎn)錄終止信號，并可以影響mRNA的穩(wěn)定性和半衰期。缺少終止子會使mRNA一直延伸，以至于無法翻譯，影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，終止子對于基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控也至關(guān)重要[63-65]。然而，與啟動子相比，對于解脂耶氏酵母終止子的研究仍然較少。目前解脂耶氏酵母中通常使用ScCYC1t、XPRt和LIP2t等幾種常見終止子。近年來，合成終止子工程也得到快速發(fā)展，人工合成的終止子通常比天然終止子序列更短、效果更好。同時，合成的終止子可以降低同源重組的風(fēng)險，尤其在構(gòu)建較龐大的代謝通路時優(yōu)勢明顯[63]。Curran等[63]在釀酒酵母中表征了30多種終止子，結(jié)果表明，當(dāng)與表達(dá)強(qiáng)度相對較低的啟動子偶聯(lián)時，不同的終止子對基因轉(zhuǎn)錄水平的影響非常明顯；隨后該學(xué)者通過對CYC1t進(jìn)行突變研究，證明了特定的終止子序列也會對基因的表達(dá)水平產(chǎn)生顯著影響。這項工作表明對終止子的改造也能夠有效調(diào)控酵母基因的異源表達(dá)。此外，有研究者還將釀酒酵母的人工合成終止子在解脂耶氏酵母宿主菌中進(jìn)行了功能驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與常用的CYC1t相比，含有合成終止子菌株的綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度增加了60%，這說明該合成終止子在不同酵母間均具有較好效果，表現(xiàn)出較好的種間可轉(zhuǎn)移性[66]。然而，現(xiàn)階段關(guān)于解脂耶氏酵母終止子基因工程的研究還相對較少，已經(jīng)取得的研究結(jié)果都還未證明人工合成終止子在解脂耶氏酵母代謝工程中的普遍適用性。盡管如此，研究者們對解脂耶氏酵母終止子工程的關(guān)注仍越來越多，篩選和構(gòu)建性能更好、功能可控的人工合成終止子將會是未來的重點研究方向，也勢必會推動解脂耶氏酵母表達(dá)系統(tǒng)和合成生物學(xué)研究的快速發(fā)展。

2 解脂耶氏酵母基因編輯方法研究進(jìn)展

近年來，隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的基因編輯方法也在解脂耶氏酵母中得到了開發(fā)應(yīng)用，如CRISPR-Cas、Cre-loxP、Gateway、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶、鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases）、大范圍核酸酶（meganucleases）技術(shù)等。本文主要對在解脂耶氏酵母宿主菌中應(yīng)用前景更好的CRISPR-Cas、CreloxP和Gateway技術(shù)展開討論。

2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)

CRISPR-Cas系統(tǒng)是最近出現(xiàn)的基因組定點編輯技術(shù)，其利用RNA作為指導(dǎo)，使用Cas系列核酸酶對目的基因進(jìn)行剪切。CRISPR于1987年被首次發(fā)現(xiàn)，是Ishino等[67]在大腸桿菌（Escherichia coli）K12堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)的串聯(lián)間隔重復(fù)序列。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)其在細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中也廣泛存在。2002年，Jansen等[68]將其正式命名為規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（custered regularly interspaced short palindromic repeat，

CRISPR）。Cas9是一種由tracrRNA和crRNA介導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶[69]。目前，研究人員通常將crRNA和tracrRNA融合成一條sgRNA，在sgRNA的指導(dǎo)下，由Cas9內(nèi)切酶對DNA進(jìn)行切割（圖1）。此外，在設(shè)計sgRNA時靠近PAM序列的13 個堿基要嚴(yán)格配對，否則將會造成脫靶。相比其他基因編輯方法，CRISPR-Cas系統(tǒng)構(gòu)建簡便，只需設(shè)計正確的sgRNA序列即可實現(xiàn)基因組的快速編輯，一經(jīng)問世就受到廣泛關(guān)注[70]。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的工作原理Fig. 1 General working principle of the CRISPR-Cas system

自從2013年CRISPR-Cas系統(tǒng)被首次成功應(yīng)用于對釀酒酵母的基因組編輯以來[71]，該技術(shù)已經(jīng)在其他多種酵母中得到了成功應(yīng)用，如解脂耶氏酵母[72-73]、巴斯德畢赤酵母[74]、乳酸克魯維酵母[75]和粟酒裂殖酵母[76]等。Schwartz等[72]將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白和RNA聚合酶III啟動子表達(dá)的gRNA共轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母中，使單基因的敲除率和同源重組率分別達(dá)到了90%和70%，進(jìn)一步敲除ku70基因以后，同源重組效率可達(dá)100%。Gao Shuliang等[77]將Cas9和gRNA表達(dá)盒插入到同一個載體，然后分別轉(zhuǎn)化到野生型、Δku70缺陷型和Δku70/Δku80雙缺陷型的解脂耶氏酵母菌株中，發(fā)現(xiàn)野生型菌株基因編輯效率達(dá)到85.6%，Δku70/Δku80雙缺陷型菌株基因編輯效率最高可達(dá)94.1%。在此基礎(chǔ)上，還通過NHEJ實現(xiàn)了同時編輯2 個或3 個基因，效率分別為36.7%和19.3%。Holkenbrink等[78]構(gòu)建了EasyCloneYALI系統(tǒng)，利用CRISPR-Cas9技術(shù)可以將基因表達(dá)載體快速整合到特定的基因組位點，然后使用短雙鏈寡核苷酸作為DNA修復(fù)模板可以同時敲除1～2 個基因，單個基因的敲除率為90%，雙基因的敲除率為6%～66%。Gao Difeng等[79]還開發(fā)出一種雙重CRISPR-Cas9策略，構(gòu)建了兩個整合型載體，各自含有一個Cas9表達(dá)框和sgRNA，兩個載體上的sgRNA分別靶向目的基因的起始密碼子上游區(qū)域和終止密碼子下游區(qū)域，利用Cas9蛋白進(jìn)行切割，可以將目的基因完整切除，效率約為20%。隨后，該學(xué)者又構(gòu)建了含有一個Cas9表達(dá)框和兩個sgRNA的載體，并與含有敲入基因的載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，整合效率約為15%～37%。Larroude等[80]使用Golden Gate方法構(gòu)建了一套含有不同標(biāo)記的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，用于解脂耶氏酵母的基因組編輯。該系統(tǒng)中，Cas9蛋白使用不同的啟動子控制，顯著提高了基因編輯效率。Schwartz等[81]開發(fā)出一種可以量化sgRNA切割效率的方法，通過對sgRNA的功能進(jìn)行高通量定量分析，鑒定出可以覆蓋94%基因的高效sgRNA。與傳統(tǒng)的基因編輯方法相比，CRISPR-Cas系統(tǒng)可以對野生型和工業(yè)菌株基因組進(jìn)行快速編輯，并且可以進(jìn)行多個基因的同時編輯。隨著研究人員對CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不斷優(yōu)化，以解脂耶氏酵母為底盤細(xì)胞進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)將變得更加便捷和高效。

2.2 Cre-loxP系統(tǒng)

Cre-loxP系統(tǒng)源于P1噬菌體，由環(huán)化重組酶（cyclization recombination enzyme，Cre）和loxP位點兩部分組成，可在基因組特定位點進(jìn)行基因的敲入、敲除、移位和倒位等操作，目前已成功應(yīng)用于對多種微生物的基因編輯。在解脂耶氏酵母中，Cre-loxP系統(tǒng)通常用于目的基因的敲除，如將攜帶擬敲除基因同源臂的loxP-Maker-loxP片段導(dǎo)入酵母細(xì)胞進(jìn)行同源重組，Cre表達(dá)并識別loxP位點，繼而將loxP位點間的標(biāo)記基因切除。Fickers等[82]利用該方案，使目的基因敲除率達(dá)到45%，Cre表達(dá)以后標(biāo)記基因的切除率可高達(dá)98%。但是，由于標(biāo)記基因切除后基因組上會留下一個loxP位點，新導(dǎo)入的loxP位點與之前的loxP位點可能會發(fā)生錯誤剪切，因此該方案并不適用于對多個基因的連續(xù)敲除。為了解決這一問題，研究人員開發(fā)了一種新的Cre-loxP特異性重組系統(tǒng)（圖2），通過構(gòu)建loxP突變文庫，篩選到反向序列有5 個堿基不同的Lox66和Lox71位點，在Lox66和Lox71位點進(jìn)行剪切重組后會產(chǎn)生突變的Lox72位點并留在基因組上，Cre對該突變位點的識別能力大大降低，因此對后續(xù)基因敲除幾乎沒有影響[83-84]。但是，該連續(xù)敲除方案尚未在解脂耶氏酵母中得到應(yīng)用，因此在解脂耶氏酵母中篩選突變的特異性LoxP位點并深入探究該方案在解脂耶氏酵母中的應(yīng)用潛力，有望實現(xiàn)利用Cre-loxP系統(tǒng)對解脂耶氏酵母基因組進(jìn)行連續(xù)、高效的遺傳修飾。此外，解脂耶氏酵母染色體基因組上遺留的LoxP位點對其他基因的表達(dá)是否會造成影響，需要進(jìn)一步探究。

圖2 Cre-loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的特異性重組Fig. 2 Specific recombination mediated by Cre-loxP system

2.3 Gateway技術(shù)

Gateway是由美國Invitrogen公司開發(fā)的一種基因克隆操作技術(shù)，近年來被廣泛應(yīng)用于各種表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。該技術(shù)首先將目的基因克隆到供體載體上，然后依靠載體上特定的att重組位點和重組酶，快速、高效地將目的基因克隆到目的載體上（圖3）。該技術(shù)可以縮短亞克隆操作時間，并且可以將目的基因快捷地克隆至多個不同的表達(dá)系統(tǒng)，如細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動物等。Gateway技術(shù)已成功應(yīng)用于解脂耶氏酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，如Leplat等[85]利用Gateway載體將URA3標(biāo)記、pTEF1啟動子、LIP2t終止子和zeta序列組成的表達(dá)盒整合到解脂耶氏酵母基因組中，通過在96 孔板中應(yīng)用高通量轉(zhuǎn)化的方法獲得了過表達(dá)堿性胞外蛋白酶的突變體文庫。另外，作者還使用該技術(shù)構(gòu)建了150多個過表達(dá)單個轉(zhuǎn)錄因子的菌株，以識別參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)因子[86]。Dulermo等[45]利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入解脂耶氏酵母中，然后通過更換不同的啟動子驗證熒光蛋白RedStar2、葡萄糖淀粉酶和木聚糖酶C的表達(dá)程度。盡管從嚴(yán)格意義上來說，Gateway技術(shù)不屬于高通量整合方法，但是由于其克隆效率可高達(dá)95%并且具有將單個目的基因同時克隆至多個不同載體的優(yōu)勢，因此可實現(xiàn)目標(biāo)重組載體的快速構(gòu)建和外源基因的快速表達(dá)。目前，該技術(shù)也已在解脂耶氏酵母中得到了廣泛使用，應(yīng)用前景極為廣闊。

圖3 Gateway技術(shù)的工作原理Fig. 3 General working principle of the Gateway technology

3 代謝工程改造解脂耶氏酵母生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品應(yīng)用實例

解脂耶氏酵母作為一種產(chǎn)油酵母，其胞內(nèi)脂質(zhì)積累量極高，因此是脂質(zhì)生產(chǎn)的優(yōu)良菌種。此外，其蛋白酶和脂肪酶的分泌能力較強(qiáng)，因此也是蛋白質(zhì)生產(chǎn)中最有潛力的微生物[39]。本節(jié)主要對近年來以解脂耶氏酵母為細(xì)胞工廠生產(chǎn)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他高附加值非天然產(chǎn)物的應(yīng)用實例進(jìn)行了總結(jié)。

3.1 蛋白質(zhì)

異源蛋白的生產(chǎn)是非常有研究意義的領(lǐng)域，具有較高的學(xué)術(shù)和商業(yè)應(yīng)用價值。最初一般利用大腸桿菌來進(jìn)行異源蛋白的生產(chǎn)，但是由于大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)容易錯誤折疊形成包涵體、復(fù)雜蛋白質(zhì)需求量不斷增加以及酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)迅速發(fā)展，基于酵母的蛋白表達(dá)系統(tǒng)展現(xiàn)出了更多優(yōu)勢。然而釀酒酵母作為最常用的蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌株也存在一定缺陷，比如糖基化程度高、蛋白質(zhì)產(chǎn)率和分泌水平較低等。解脂耶氏酵母在這些方面都存在優(yōu)勢，且?guī)追N內(nèi)源蛋白質(zhì)（如堿性胞外蛋白酶、酸性胞外蛋白酶、脂肪酶和磷酸酶等）的分泌水平較高。XPR2基因在蛋白胨的誘導(dǎo)下表達(dá)，可分泌大量的堿性胞外蛋白酶（1～2 g/L）[5]。因此，堿性胞外蛋白酶成為了蛋白質(zhì)分泌研究的模型，該基因的啟動子也成為了重要的分子生物學(xué)工具，在解脂耶氏酵母異源蛋白生產(chǎn)中具有重要作用。

真核生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)種類成千上萬，且可以在細(xì)胞的各個區(qū)域內(nèi)發(fā)揮作用，因此必然存在不同的機(jī)制確保蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，主要包括共翻譯轉(zhuǎn)運和翻譯后轉(zhuǎn)運兩種。研究表明翻譯后轉(zhuǎn)運途徑在釀酒酵母細(xì)胞中占主導(dǎo)地位，而在解脂耶氏酵母細(xì)胞中共翻譯轉(zhuǎn)運途徑比翻譯后轉(zhuǎn)運途徑更具優(yōu)勢[87]，這也是解脂耶氏酵母可以高效生產(chǎn)復(fù)雜外源蛋白的另一個重要原因。

早在1991年，Buckholz等[88]便列舉出了利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)的5 種異源蛋白。近年來，以解脂耶氏酵母作為宿主菌生產(chǎn)的異源蛋白種類不斷擴(kuò)大，活性和產(chǎn)量也不斷增加，到目前為止，利用解脂耶氏酵母作為細(xì)胞工廠已經(jīng)生產(chǎn)出150多種重組蛋白。

3.2 脂質(zhì)

近年來，研究人員通過不同的工程策略大大提高了解脂耶氏酵母中脂質(zhì)的生產(chǎn)量。其中，敲除脂質(zhì)降解途徑的相關(guān)基因是脂質(zhì)積累的常用策略。例如，MFE2基因的敲除使脂質(zhì)的積累量明顯增加[89]；過氧化物酶體生成蛋白基因PEX3、PEX10和PEX11的敲除完全抑制了β-氧化，也使得脂質(zhì)的積累量明顯增加[13,90]。此外，代謝調(diào)控因子SNF1的敲除也會對脂質(zhì)的積累有非常明顯的影響。例如，敲除了SNF1的解脂耶氏酵母工程菌株脂肪酸的積累量比野生型高2.6 倍，此外，對生產(chǎn)EPA的菌株中敲除SNF1后，EPA的產(chǎn)率提高了52%，占細(xì)胞干質(zhì)量的7.6%[91]。

此外還可通過利用低成本原料底物來進(jìn)行脂質(zhì)的生產(chǎn)，如以甘油為底物脂質(zhì)產(chǎn)率可達(dá)43%（以細(xì)胞干質(zhì)量計，后同）[92]，以甘蔗渣水解液為原料產(chǎn)率可達(dá)58.5%[93]。Niehus等[94]通過過表達(dá)外源基因構(gòu)建了解脂耶氏酵母工程菌株，以木糖為碳源，最終脂質(zhì)產(chǎn)率達(dá)到67%。研究人員通過工程改造甘油-3-磷酸穿梭途徑增加甘油-3-磷酸的含量，然后通過弱化β-氧化途徑增加三酰甘油和游離脂肪酸含量，使最終脂質(zhì)產(chǎn)率高達(dá)65%～75%[95]。

3.3 其他高附加值非天然產(chǎn)物

解脂耶氏酵母除了是生產(chǎn)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的重要宿主菌外，還可用于各種高附加值非天然產(chǎn)物的生產(chǎn)，如生物材料、生物燃料、生物化學(xué)品、香料和藥物等。本文舉例介紹了利用合成生物學(xué)技術(shù)以解脂耶氏酵母為底盤所生產(chǎn)的一些比較有代表性的高附加值產(chǎn)物。

3.3.1 多不飽和脂肪酸

多不飽和脂肪酸是指碳鏈長度在18～22 個碳原子之間并且含有兩個或兩個以上雙鍵的直鏈脂肪酸，經(jīng)常被用作食品和飼料添加劑，近年來，已經(jīng)利用解脂耶氏酵母對多種人體必需的多不飽和脂肪酸進(jìn)行了生產(chǎn)，如γ-亞麻酸（gamma linolenic acid，GLA）、EPA等。Sun Meili等[96]在強(qiáng)啟動子php4d的控制下，將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的高山被孢霉Δ6-脫氫酶引入解脂耶氏酵母基因組，最終在生物反應(yīng)器中獲得71.6 mg/L的GLA。EPA可以改善心血管問題，研究人員將Δ12-脫氫酶基因、Δ9-脫氫酶基因和C16延長酶基因插入解脂耶氏酵母LEU2基因座，然后表達(dá)了Δ5、Δ8和Δ17脫氫酶，并敲除了PEX10、LIP1和SCP2基因，使得EPA產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞干質(zhì)量的15%，占總脂質(zhì)含量的56.6%[13]。

3.3.2 類胡蘿卜素

類胡蘿卜素一般用于制造食品、藥品、化妝品和飼料添加劑等。目前已知的類胡蘿卜素達(dá)到600多種，它們都是以類異戊二烯途徑中八氫番茄紅素作為中間體產(chǎn)生的，如β-胡蘿卜素、番茄紅素和蝦青素等。β-胡蘿卜素是一種自然界中普遍存在的天然色素，Larroude等[97]開發(fā)了可以生產(chǎn)β-胡蘿卜素的解脂耶氏酵母工程菌株，其使用Golden Gate技術(shù)篩選β-胡蘿卜素途徑中基因和啟動子的最佳組合，再經(jīng)過補(bǔ)料分批發(fā)酵，最終β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到6.5 g/L（90 mg/gmd），同時產(chǎn)生了42.6 g/L的脂質(zhì)。番茄紅素是存在于植物中的一種深紅色針狀結(jié)晶的類胡蘿卜素，對心臟和血管等功能的改善有明顯益處[98]。Schwartz等[99]利用合成生物學(xué)的方法構(gòu)建了番茄紅素生產(chǎn)菌株，然后在生物反應(yīng)器中通過補(bǔ)料分批發(fā)酵使番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到21.1 mg/gmd。蝦青素是一種于水生生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的紅色類胡蘿卜素，具有極強(qiáng)的抗氧化性，在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)被廣泛應(yīng)用。Kildegaard等[100]構(gòu)建了工程化解脂耶氏酵母以生產(chǎn)蝦青素，所得蝦青素產(chǎn)量為（10.4±0.5）mg/L，在優(yōu)化了crtZ和crtW的拷貝數(shù)后于微量滴定板上培養(yǎng)，最終蝦青素產(chǎn)量達(dá)到了54.6 mg/L。

3.3.3 類異戊二烯

α-法尼烯又稱為金合歡烯，是最簡單的倍半萜烯之一，在醫(yī)藥等行業(yè)應(yīng)用前景較為廣闊。Liu Yinhang等[101]將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的α-法尼烯合酶基因整合到解脂耶氏酵母基因組上，然后又通過過表達(dá)甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑相關(guān)基因，優(yōu)化發(fā)酵條件，使α-法尼烯產(chǎn)量達(dá)到了25.55 g/L，這是迄今為止解脂耶氏酵母生產(chǎn)萜烯類化合物產(chǎn)量最高的報道。

檸檬烯也是一種重要的單萜類化合物，是許多香料和藥物的前體化合物。Pang Yaru等[25]在解脂耶氏酵母中以MVA途徑為基礎(chǔ)構(gòu)建了一條L/D-檸檬烯代謝途徑，經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，L/D-檸檬烯產(chǎn)量分別達(dá)到11.705 mg/L（得率0.443 mg/g）和11.088 mg/L（得率0.385 mg/g）。然后該學(xué)者又以廚房廢油（waste cooking oils，WCO）作為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵，檸檬烯產(chǎn)量最終達(dá)到了以葡萄糖為碳源產(chǎn)量的70%，這為以解脂耶氏酵母作為細(xì)胞工廠、WCO為底物生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品提供了可行的方案，在廢物轉(zhuǎn)化方面帶來重大突破。Cheng Boqian等[102]除了引入檸檬烯合成途徑外還探究了不同碳源對檸檬烯產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甘油為碳源、檸檬酸為輔助碳源的組合最佳。在此基礎(chǔ)上通過補(bǔ)料分批發(fā)酵，使檸檬烯產(chǎn)量最終達(dá)到了165.3 mg/L，這也是迄今為止利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)檸檬烯產(chǎn)量最高的報道。

表3對解脂耶氏酵母生產(chǎn)的部分具有代表性的外源蛋白、脂質(zhì)和其他高附加值非天然產(chǎn)物進(jìn)行了列舉。

表3 解脂耶氏酵母中生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品實例Table3 Representative examples of high-value products produced by engineered Y. lipolytica

續(xù)表3

4 結(jié) 語

自解脂耶氏酵母被發(fā)現(xiàn)之日起便引起了研究人員的格外關(guān)注，隨后研究人員就開始對其進(jìn)行了廣泛而深入的研究，包括形態(tài)特征、生理生化特性、遺傳特點及代謝調(diào)控等。本文主要總結(jié)了解脂耶氏酵母中常用的合成生物學(xué)元件和基因編輯方法。其中，啟動子是生物合成途徑中啟動和協(xié)調(diào)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因素，終止子在終止轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)mRNA半衰期方面有著不可替代的作用，啟動子和終止子都是合成生物學(xué)研究中最重要的基本元件。之前的工作主要集中在對解脂耶氏酵母啟動子元件的開發(fā)和應(yīng)用，即通過隨機(jī)突變或理性設(shè)計來創(chuàng)建啟動子文庫進(jìn)行研究[51-54]。近年來，終止子的開發(fā)和應(yīng)用也成為了研究熱點[63-66]，下一步工作的重點應(yīng)該是構(gòu)建序列更短、功能更強(qiáng)、轉(zhuǎn)錄活性范圍更廣的啟動子，同時應(yīng)探究解脂耶氏酵母中啟動子和終止子工程的聯(lián)合開發(fā)與應(yīng)用，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建適用于解脂耶氏酵母宿主菌的超級表達(dá)載體，以實現(xiàn)目的基因更加高效的表達(dá)。隨著合成生物學(xué)和基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，CRISPR-Cas、Cre-loxP和Gateway等基因編輯技術(shù)以簡便、高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢實現(xiàn)了對解脂耶氏酵母基因組的快速編輯，加快了工程菌株的開發(fā)進(jìn)程，因此被研究人員廣泛采用。但是對多基因的同時編輯仍存在效率不高和脫靶等問題[78-79]，下一步研究重點應(yīng)集中在提高多基因編輯效率上，實現(xiàn)多基因同時、快速且高效的編輯將會對解脂耶氏酵母合成生物學(xué)的快速發(fā)展做出重大貢獻(xiàn)。盡管近年來解脂耶氏酵母在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和非天然產(chǎn)物的生產(chǎn)上展現(xiàn)出更多優(yōu)勢，但是成本問題依然是困擾科學(xué)研究的難題。針對這個問題，已有研究人員使用價格低廉的糖蜜、廚房廢油和乳清等工業(yè)副產(chǎn)物為底物來進(jìn)行解脂耶氏酵母的發(fā)酵生產(chǎn)，以降低工業(yè)化成本[25,139-140]，通過構(gòu)建環(huán)境友好型微生物細(xì)胞工廠來進(jìn)行廢物轉(zhuǎn)化也將是解脂耶氏酵母合成生物學(xué)發(fā)展的重要研究方向。