多穗柯總黃酮對db/db小鼠胰高血糖素樣肽-1分泌的影響

陳敬民　李燕婧

摘要：目的 探討多穗柯總黃酮對db/db小鼠腸道胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）分泌的影響。方法 選取db/db雄性小鼠按空腹血糖值隨機(jī)分組，多穗柯總黃酮以100、200 mg/kg劑量灌胃給藥4 w，進(jìn)行糖負(fù)荷GLP-1分泌實驗，然后處死動物，取回腸組織，免疫熒光法檢測分泌GLP-1的細(xì)胞情況，測量食耗量、飲水量、空腹血糖值、血清GLP-1及分泌GLP-1細(xì)胞比例。結(jié)果 多穗柯總黃酮100或200 mg/kg劑量組均能顯著減少db/db小鼠周食耗量（P<0.05或P<0.01）、周飲水量（P<0.01）;降低空腹血糖值（P<0.05或P<0.01）;顯著升高空腹GLP-1水平（P<0.01）。多穗柯總黃酮200 mg/kg劑量組能顯著升高糖負(fù)荷后30、60 min的血清GLP-1水平（P<0.05）;增加分泌GLP-1的細(xì)胞比例（P<0.01）。結(jié)論 多穗柯總黃酮通過減少腸道L細(xì)胞損傷，保護(hù)其分泌GLP-1的功能，增加GLP-1的分泌，發(fā)揮防治糖尿病作用。

關(guān)鍵詞：多穗柯總黃酮;糖尿病;胰高血糖素樣肽-1

中圖分類號：R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2021）10-0079-04

胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是腸道Langerhans細(xì)胞分泌的腸肽類激素，GLP-1能再生和修復(fù)胰島β細(xì)胞，增加β細(xì)胞數(shù)量并抑制其凋亡，提高β細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量，改善β細(xì)胞功能[1]。通過提高體內(nèi)GLP-1水平改善胰島β細(xì)胞功能，進(jìn)而提高胰島素分泌水平，從而達(dá)到防治糖尿病的目的，是藥物治療糖尿病重要作用機(jī)制之一。

多穗柯是殼斗科植物木姜葉柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun.的干燥嫩葉，富含以根皮苷（Phlorizio-1），三葉苷（Trilobation-2），3-羥基根皮苷（3-hydroxy phlorizin-3）為主的黃酮類物質(zhì)[2，3]，具有潤肺鎮(zhèn)咳、滋潤肝腎、清熱利尿等效用，系廣西瑤族地區(qū)常用于降血糖的民間草藥。本課題組人員曾研究發(fā)現(xiàn)其在治療糖尿病方面有顯著的藥理作用[4]，本實驗利用db/db小鼠糖尿病模型，在考察糖負(fù)荷GLP-1變化基礎(chǔ)上，結(jié)合免疫熒光技術(shù)，探討多穗柯總黃酮防治糖尿病的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級C57、db/db小鼠，雄性，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2016-0010，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥研究院動物房，實驗動物使用許可證號：SYXK桂2016-0006，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，環(huán)境相對濕度（50±5）%，無菌水，標(biāo)準(zhǔn)鼠料，12小時自由進(jìn)食/12小時禁食，自由飲水。本實驗遵守國家有關(guān)實驗動物保護(hù)與使用準(zhǔn)則。

1.2 藥物與試劑 多穗柯來源于廣西百色，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院饒偉源主任中藥師鑒定為殼斗科植物木姜葉柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun.的干燥嫩葉;鹽酸二甲雙胍片（批號：190610），北京京豐制藥集團(tuán)有限公司;卓越金采血糖試紙，羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司;4%多聚甲醛，北京博奧拓達(dá)科技有限公司;小鼠胰高血素樣肽-1（GLP-1）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，上海仁捷生物科技有限公司;Anti-GLP-1 Rabbit pAb抗體，Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（紅色），細(xì)胞核染色劑DAPI，均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 卓越精采血糖儀（羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司）;Thermo 1510酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）;Eclipse Ci-L正置熒光拍照顯微鏡（日本Nikon公司）;Image-pro Plus 6.0圖片分析軟件（美國Media Cybemetics公司）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（x[TX-*3/8]±s）表示，采用單因素方差分析，組間進(jìn)行LSD檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 方法

2.1 多穗柯總黃酮的制備 多穗柯藥材粉碎，70%乙醇溶液以10：1液藥比回流提取2次，每次2 h，提取液濾過，濃縮成稠膏，用溫蒸餾水稀釋，上大孔樹脂，水、乙醇梯度洗脫，收集50%醇洗脫部分，濃縮，冷凍干燥成粉未，284 nm處檢測總黃酮含量為89%。

2.2 實驗分組與給藥[5] 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，C57小鼠為正常對照組，db/db小鼠尾靜脈針刺取血，血糖儀測空腹血糖值，按血糖值隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍83 mg/kg組、多穗柯總黃酮100和200 mg/kg組，每組8只，每籠2只分籠飼養(yǎng)。各給藥組灌胃給藥，給藥體積為20 mL/kg，連續(xù)28 d，正常對照組及模型組給予蒸餾水，每周均測量各鼠空腹血糖、食耗量及飲水量。

2.3 糖負(fù)荷GLP-1分泌實驗[6-7] 末次給藥前尾靜脈取血，給藥1 h后進(jìn)行實驗，各鼠分別按1 g/kg灌胃給予10%葡萄糖溶液，并于口服葡萄糖后30、60、120 min尾靜脈取血，血液3000 r/min離心10 min，分離血清，測量小鼠血清GLP-1含量，計算各組小鼠血清GLP-1的均數(shù)方差。

2.4 腸組織分泌GLP-1的L細(xì)胞檢測[8-10] 實驗結(jié)束后禁食12 h，脫頸椎處死小鼠，冰臺上清理脂肪，迅速取回腸組織，4℃生理鹽水清洗腸道，置4%多聚甲醛固定24 h，進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)、一抗孵育、二抗覆蓋、DAPI復(fù)染，淬滅封片，熒光拍照顯微鏡下檢查，每張切片選取3個目的區(qū)域200倍成像，拍攝GLP-1及DAPI熒光照片，使用圖片分析軟件分析回腸組織分泌GLP-1的L細(xì)胞及其他細(xì)胞數(shù)，計算分泌GLP-1的L細(xì)胞百分率。

L細(xì)胞百分率=回腸GLP-1染色區(qū)域面積/（GLP-1及DAPI染色區(qū)域面積總和）×100%

3 結(jié)果

3.1 對db/db小鼠食耗量和飲水量的影響 結(jié)果如表1、表2所示，與正常對照組比較，模型組小鼠周食耗量、周飲水量隨時間進(jìn)行性顯著增多（P<0.01）。與模型組比較，多穗柯總黃酮100、200 mg/kg組的周食耗量、周飲水量顯著減少（P<0.05或P<0.01）。

3.2 對db/db小鼠空腹血糖的影響 結(jié)果如表3所示，與正常對照組比較，模型組小鼠空腹血糖隨時間進(jìn)行性顯著增高（P<0.01）。與模型組比較，多穗柯總黃酮以100 mg/kg給藥7、14 d或以200 mg/kg給藥均顯著降低空腹血糖（P<0.05或P<0.01）。

3.3 對db/db小鼠血清胰高血糖素樣肽1（GLP-1）的影響 結(jié)果如表4所示，與正常對照組比較，模型小鼠空腹、口服葡萄糖后血清GLP-1含量明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，多穗柯總黃酮100、200 mg/kg連續(xù)給藥28 d顯著升高空腹血清GLP-1含量（P<0.01），多穗柯總黃酮200 mg/kg連續(xù)給藥28 d能顯著升高口服葡萄糖后0.5、1.0 h的血清GLP-1含量（P<0.05）。

3.4 對db/db小鼠分泌GLP-1細(xì)胞的影響 結(jié)果如表5所示，與正常對照組比較，模型組小鼠回腸分泌GLP-1的L細(xì)胞數(shù)明顯減少，腸組織細(xì)胞中的比例顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，多穗柯總黃酮200 mg/kg連續(xù)給藥28 d明顯增加回腸分泌GLP-1的L細(xì)胞數(shù)，腸組織細(xì)胞中的比例顯著增加（P<0.01）。腸組織免疫熒光檢查結(jié)果如圖1所示，正常對照組腸組織分泌GLP-1的L細(xì)胞層連續(xù)光滑、致密，模型組小鼠腸組織分泌GLP-1的L細(xì)胞層斷續(xù)、離散，多穗柯總黃酮100、200 mg/kg連續(xù)給藥28 d能使db/db小鼠分泌GLP-1細(xì)胞層形態(tài)連續(xù)性、致密度明顯優(yōu)于模型組。

4 討論

db/db小鼠是C57小鼠4號染色體瘦素受體基因定向敲除引起的一種自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠，具有和人類2型糖尿病相似的臨床癥狀，有多飲、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗等特征，是理想2型糖尿病模型[11]。與正常對照組比較，模型組食耗量、飲水量及空腹血糖值顯著增高（P<0.01）;與模型組比較，多穗柯總黃酮連續(xù)給予28 d，db/db小鼠多飲多食的糖尿病癥狀明顯改善（P<0.05或P<0.01），表明多穗柯總黃酮能較好改善db/db小鼠糖尿病癥狀的作用。

GLP-1受進(jìn)食、胃腸神經(jīng)等影響，糖類、脂肪營養(yǎng)物質(zhì)刺激腸組織增加GLP-1分泌，使外周血GLP-1濃度增高，發(fā)揮“腸促胰島素”作用，并促進(jìn)胰腺葡萄糖依賴性胰島素釋放，調(diào)節(jié)體內(nèi)餐后葡萄糖達(dá)到穩(wěn)態(tài)[12-14]。本實驗開展口服糖負(fù)荷實驗，與正常對照組比較，模型組糖后血清GLP-1含量明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，多穗柯總黃酮連續(xù)給藥28 d能顯著增加小鼠空腹及糖后血清的GLP-1含量（P<0.05）。表明多穗柯總黃酮通過提高分泌GLP-1基礎(chǔ)值來發(fā)揮GLP-1的降糖作用。

L細(xì)胞是腸道分泌GLP-1的內(nèi)分泌細(xì)胞，2型糖尿病GLP-1分泌水平下降與腸道L細(xì)胞受損有關(guān)[15-16]。本實驗對腸組織進(jìn)行GLP-1免疫熒光分析，正常對照組小鼠分泌GLP-1的L細(xì)胞層連續(xù)、光滑、致密、比例高;與正常對照組比較，模型組小鼠分泌GLP-1的L細(xì)胞層斷續(xù)、疏散、比例低（P<0.01）;與模型組比較，多穗柯總黃酮連續(xù)給藥28 d后，db/db小鼠分泌GLP-1的L細(xì)胞連續(xù)性較好、比例明顯增多（P<0.01）。表明多穗柯總黃酮能提高L細(xì)胞分泌GLP-1的能力，減少糖尿病小鼠L細(xì)胞的損傷。

綜上所述，多穗柯總黃酮能顯著改善db/db小鼠多飲多食的糖尿病癥狀，降低空腹血糖值，提高空腹或餐后血清GLP-1水平，減少分泌GLP-1的腸組織L細(xì)胞的損傷，表明多穗柯總黃酮通過減少腸道L細(xì)胞損傷，保護(hù)其分泌GLP-1的功能，增加GLP-1的分泌，發(fā)揮多穗柯總黃酮防治糖尿病的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]李曉倩，沈山梅.中藥干預(yù)對胰高血糖素樣肽-1水平影響的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，14（4）：257-259.

[2]饒偉源，冉國糧，邱宏聰，等.多穗柯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中南藥學(xué)，2017，15（6）：814-817.

[3]李勝華，伍賢進(jìn)，楊青丹，等.多穗柯化學(xué)成分研究[J].中藥材，2010，33（4）：549-551.

[4]韋寶偉，劉布鳴，曾憲彪，等.木姜葉柯總黃酮對大小鼠血糖和糖耐量的影響[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2012，27（1）：19-22.

[5]唐思夢，李紅枝，陳偉強(qiáng)，等.黃芪多糖與二甲雙胍干預(yù)2型糖尿病大鼠的對比研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2017，23（22）：12-16.

[6]李云鵑，郝二偉，白鋼，等.復(fù)方青芒降糖飲調(diào)節(jié)血糖的作用及其機(jī)制研究[J].中藥材，2019，42（10）：2409-2414.

[7]魏世超，徐麗君，鄒欣，等.黃連有效成分及其組合物對荷糖小鼠胰島素和胰高血糖素樣肽1（GLP-1）分泌影響的初步研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017，37（14）：1343-1347.

[8]楊雪蓉，張振華，徐杰，等.健胰方通過調(diào)控胰高血糖素樣肽-1表達(dá)改善糖尿病大鼠胰島細(xì)胞功能的研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，34（2）：213-218.

[9]藺曉源，鄧娜，蔡瑩.四磨湯有效成分對慢性應(yīng)激小鼠Obestatin及GLP-1的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2015，21（13）：44-51.

[10]王力.MYDGF對2型糖尿病小鼠腸道L細(xì)胞分泌GLP-1的影響及機(jī)制研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2019.

[11]劉靜，陸潔，裴天仙，等.基因缺陷型2型糖尿病模型動物db/db小鼠早期生物學(xué)特性研究[J].藥物評價研究，2013，36（1）：8-12.

[12]Everard A PD cani.Gut microbiota and GLP-1[J].Rev Endoer Metab Disord，2014，15（3）：189-196.

[13]Ezcurra M，Reimann F，Gribble FM，et al.Molecular mechanisms of incretin hormone secretion[J].Curr Opin Pharmacol，2013，13（6）：922-927.

[14]嚴(yán)淋，羅和生.胰高血糖素樣肽-1在胃腸道中的作用及機(jī)制的研究進(jìn)展[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2017，26（8）：944-947.

[15]李靜，張振，姜新魁，等.糖基化終末產(chǎn)物對腸道L細(xì)胞株胰高血糖素肽-1分泌水平及L細(xì)胞凋亡的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2015（7）：1013-1016.

[16]Schonhoff S E，Giel molonev M，Leiter A B.Minireview：development and differentiation of gut endocrine cells[J].Endocrinology，2004，145（6）：2639-2644.[JX*1]

（收稿日期：2021-07-16）