新型咪唑類藥物2-咪唑-2,4-戊二烯酮19和44對白念珠菌抗菌效果和作用機(jī)制初步研究

陳 華，劉錦燕,*，李文靜,2，趙珺濤,2，項(xiàng)明潔,2

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗(yàn)科，上海 200020；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025）

近30年來，念珠菌屬在我國乃至全球范圍內(nèi)已成為醫(yī)院內(nèi)侵入性真菌感染的第一大類致病菌[1-2]，其中白念珠菌占比最高[3]。白念珠菌屬于機(jī)會致病菌，當(dāng)宿主免疫功能低下，如精神緊張、接受手術(shù)或器官移植、接受放化療或免疫抑制劑治療、不恰當(dāng)使用抗生素等時，白念珠菌會過度生長，引起局部甚至廣泛感染[4]，其分離率高達(dá)40%～70%[1]，致死率大于50%[5]。

目前，治療白念珠菌的藥物有限[6-7]，國內(nèi)使用較多的是兩性霉素B 和氟康唑，其中兩性霉素B因毒副反應(yīng)大故而使用受到限制，氟康唑雖然安全性良好、藥物毒性低、口服生物利用度較高，但由于近年來反復(fù)、長療程的用藥，導(dǎo)致耐氟康唑的白念珠菌不斷被檢出[8]，將來很有可能會出現(xiàn)無藥可用的情況[9]。鑒于白念珠菌的高感染率、高致死率、藥物選擇面窄、氟康唑耐藥率逐年增加等現(xiàn)實(shí)原因，尋找和研發(fā)廣譜、低毒、高效的抗白念珠菌藥物，對緩解臨床用藥壓力、提高治愈率有著重要的臨床意義。

有文獻(xiàn)顯示，咪唑類藥物具有廣譜和強(qiáng)效的特點(diǎn)，是當(dāng)代抗真菌治療中較有前途和活力的藥物之一[10]。華東理工大學(xué)藥學(xué)團(tuán)隊(duì)與本實(shí)驗(yàn)室合作，篩選華東理工大學(xué)藥學(xué)團(tuán)隊(duì)數(shù)據(jù)庫內(nèi)所有以咪唑類為基礎(chǔ)的藥物，整合藥效基團(tuán)并進(jìn)行藥敏篩選、衍生物合成，最終合成并篩選出新型藥物2-咪唑-2,4戊二烯酮類（以下簡稱新型藥物）19、44。本研究初步觀察了這2 種新型藥物對白念珠菌的作用并分析及其作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)菌株及藥物：本研究所使用的白念珠菌SC5314、ATCC （美國菌種保藏中心）90028 由本實(shí)驗(yàn)室保存，白念珠菌臨床分離株21897、24308、210、141、1964 和725 分離自臨床標(biāo)本。氟康唑購自Sigma 公司；新型藥物19、44 由華東理工大學(xué)藥學(xué)團(tuán)隊(duì)合成并篩選。

2.培養(yǎng)基及培養(yǎng)液：本實(shí)驗(yàn)采用沙氏葡萄糖瓊脂（Sabouraud Dextrose Agar，簡稱SDA）固體培養(yǎng)基。洛斯維·帕克紀(jì)念研究所（Roswell Park Memorial Institute，簡稱RPMI）1640 培養(yǎng)液配置方法為，RPMI 1640 粉末5.2 g 加3-嗎啉丙磺酸粉末17.27 g，加入450 mL 蒸餾水溶解，用配置好的5 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)PH 至7.0，最后用0.22 μm 無菌過濾器過濾。酵母膏-蛋白胨-葡萄糖（yeast extract-peptonedextrose，簡稱YPD）培養(yǎng)液和YPD 固體培養(yǎng)基，配置方法為將酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g 溶于900 mL 水中，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上再加入20 g瓊脂粉，高壓20 min 后冷卻。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.藥敏試驗(yàn)：藥敏試驗(yàn)參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會M27-A3 中的酵母菌微量肉湯稀釋法進(jìn)行操作[11]，藥物用RPMI 1640 培養(yǎng)液倍比稀釋，配置好的肉湯中藥物濃度為0.25～128.00 μg/mL，菌液濃度為2.5×103cfu/mL，同時設(shè)陰性對照和空白對照。記錄不同藥物對各菌株的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）

2.菌絲抑制試驗(yàn)：因白念珠菌SC5314 是全世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛、研究最多的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，本研究比較氟康唑、新型藥物19 和44 對SC5314 菌絲的抑制作用。挑選SDA 培養(yǎng)基上活化后的SC5314 單個菌落，接種于YPD 培養(yǎng)液中，25 ℃下培養(yǎng)48 h，調(diào)整菌液濃度至5×107cfu/mL，取50 μL 菌懸液加入5 mL 含有氟康唑、新型藥物19 和44 的10%小牛血清RPMI 1640 培養(yǎng)液中，至培養(yǎng)液內(nèi)藥物終濃度為0、2.00、8.00、16.00 μg/mL，然后在37 ℃下以300 r/min 的速度震蕩培養(yǎng)6 h，并在倒置相差顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)（400 倍）。

3.結(jié)晶紫染色法測定細(xì)胞數(shù)：選取白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314、ATCC90028 及氟康唑耐藥株141、21897，進(jìn)行菌株活化、接種、調(diào)配、稀釋及藥物的稱量、溶解、倍比稀釋（方法同“藥敏試驗(yàn)”），最終在96 孔板上配置含氟康唑、新型藥物19 和44（2.00、8.00、16.00、64.00 μg/mL）的含菌培養(yǎng)液。將96 孔板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h，讓細(xì)胞貼壁，然后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，用甲醇進(jìn)行固定，行結(jié)晶紫染色后用蒸餾水洗滌、干燥，用醋酸脫色，于570 nm 處測量吸光度。

4.透射電鏡細(xì)胞形態(tài)觀察：挑選SDA 培養(yǎng)基上活化后的SC5314 單個菌落于RPMI 1640 培養(yǎng)液及分別含有氟康唑 （1 μg/mL）、新型藥物19（0.50 μg/mL）和新型藥物44（2.00 μg/mL）的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，調(diào)整菌液濃度至5×107cfu/mL，37 ℃下以300 r/min 的速度震蕩培養(yǎng)16 h，離心、清洗、用PBS 溶液調(diào)整菌液濃度至1×107cfu/mL。前固定使用2%戊二醛PBS 固定液，在4 ℃下固定2 h，離心后棄去上清液，重懸，加入1.5% KMnO4固定后，用PBS 緩沖液洗滌；后固定使用1%鋨酸PBS固定液，4 ℃固定2 h，用PBS 緩沖液洗滌，加入1×PBS 重懸，靜置15 min，離心后棄上清；細(xì)胞用30%、50%、70%乙醇逐級脫水，加入70%乙醇、3%醋酸雙氧鈾4 ℃過夜，再用80%、95%、100%、100%乙醇逐級脫水；用環(huán)氧丙烷置換2 次，每次10 min；用環(huán)氧樹脂618 包埋液與環(huán)氧丙烷1∶1 浸透2 h，加環(huán)氧樹脂618 包埋液與環(huán)氧丙烷2∶1 浸透過夜，在37 ℃下用純環(huán)氧樹脂618 包埋液浸透6 h，置于60 ℃烘箱內(nèi)48 h 包埋，用LKB V 型超薄切片機(jī)切片；用枸櫞酸鉛電子染色后，使用PHLIP（荷蘭飛利浦公司）CM-120 透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

結(jié) 果

一、藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)檢測白念珠菌SC5314、21897、24308、210、141、ATCC90028、1964、725 對氟康唑、新型藥物19 和44 的敏感性見表1。氟康唑?qū)Π啄钪榫鶶C5314、21897、141、725 菌株的MIC 分別為1.00 μg/mL、＞128.00 μg/mL、＞128.00 μg/mL 和4.00 μg/mL；新型藥物19 對這些菌株的MIC 分別為0.50 μg/mL、64.00 μg/mL、64.00 μg/mL 和2.00 μg/mL，表明以上菌株對新型藥物19 的敏感性要優(yōu)于氟康唑。白念珠菌21897、210 和141 均為氟康唑耐藥株，新型藥物44 三者的MIC 分別為8.00 μg/mL、16.00 μg/mL 和16.00 μg/mL，表明新型藥物44 對耐氟康唑白念珠菌21897、210 和141 有抑制效果，敏感性優(yōu)于氟康唑。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（MIC）

二、菌絲抑制試驗(yàn)結(jié)果

采用400 倍相差顯微鏡觀察不同濃度的氟康唑、新型藥物19 和44 對白念珠菌SC5314 菌絲形態(tài)的影響。與無藥對照組相比，在含有氟康唑、新型藥物19 和44 的藥液中，白念珠菌SC5314 的菌絲生長被明顯抑制。在含有新型藥物44 的培養(yǎng)液中，藥物濃度對菌絲形態(tài)影響較大，16.00 μg/mL 的藥液明顯比2.00 μg/mL 的藥液對菌絲的抑制程度更強(qiáng)（見圖1）。

圖1 電鏡下新型藥物44 對SC5314 菌絲抑制作用

三、結(jié)晶紫染色法細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

為了更直觀地觀察氟康唑、新型藥物19 和44對白念珠菌的抑菌能力，選取白念珠菌SC5314、ATCC90028 及氟康唑耐藥株141、21897，檢測菌株在含有不同濃度氟康唑、新型藥物19 和44 的培養(yǎng)液內(nèi)的生長情況。于570 nm 處測量吸光度值（A 值），取3 個A 值的平均值繪制曲線（見圖2）。結(jié)果顯示，藥物濃度越高（64.00 μg/mL），藥物對菌絲生長的抑制效果最強(qiáng)。在2.00、8.00、16.00、64.00 μg/mL 各濃度點(diǎn)上，新型藥物19 和44 作用下白念珠菌ATCC90028 的A 值均小于氟康唑作用下菌株的A 值，說明新型藥物19 和44 對ATCC90028 的抑制作用優(yōu)于氟康唑。在藥物濃度為64.00 μg/mL 時，新型藥物19 和44 作用下的氟康唑耐藥株141 和21897 的A 值均小于氟康唑作用下菌株的A 值，提示新型藥物19 和44 對氟康唑耐藥株也有一定的抑制作用。

圖2 結(jié)晶紫染色法檢測氟康唑、新型藥物19 和44 對白念珠菌抑制作用

四、透射電鏡細(xì)胞形態(tài)觀察

氟康唑（MIC＝1.00 μg/mL）、新型藥物19（MIC＝0.50 μg/mL） 和44 （MIC＝2.00 μg/mL） 作用 于SC5314 菌株16 h 后，制片后經(jīng)透射電鏡觀察。結(jié)果顯示，無藥對照組的菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整（見圖3A），細(xì)胞膜厚薄均一且較為光滑，各細(xì)胞器，如高爾基體、線粒體清晰可見；氟康唑（見圖3B）、新型藥物19（見圖3C）和新型藥物44（見圖3D）作用的細(xì)胞膜厚薄不均且質(zhì)地粗糙，與無藥對照組相比，產(chǎn)生了較明顯的結(jié)構(gòu)差異。

圖3 氟康唑、新型藥物19 和44 作用SC5314菌株后細(xì)胞形態(tài)的改變

討 論

白念珠菌作為侵襲性真菌最常見的病原體，具有高感染率和高致死率的特點(diǎn)，而氟康唑是其最常見、使用最廣泛的治療藥物。但由此導(dǎo)致的氟康唑耐藥一直是一個嚴(yán)重問題[12-13]，故急需尋找和研發(fā)一種廣譜、低毒、高效的抗白念珠菌藥物，以緩解臨床用藥壓力，提高臨床白念珠菌感染的治愈率。

本實(shí)驗(yàn)室前期與華東理工大學(xué)藥學(xué)院合作，最終合成并篩選出2-咪唑-2,4 戊二烯酮類新型藥物19、44，為了探討這2 種藥物對白念珠菌的作用及機(jī)制，本研究主要分為兩大部分，一是開展體外藥敏實(shí)驗(yàn)、菌絲抑制試驗(yàn)以及結(jié)晶紫染色細(xì)胞計數(shù)檢測，以驗(yàn)證與傳統(tǒng)藥物氟康唑相比，新型藥物19、44 是否對白念株菌臨床株有更優(yōu)的敏感性與抑制作用。二是本研究通過透射電鏡直接觀察菌株的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，觀察藥物作用后菌株在電鏡下細(xì)胞膜形態(tài)與細(xì)胞器形態(tài)的改變，推斷咪唑類新型藥物對白念珠菌的作用途徑，以確定進(jìn)一步的研究方向。

一、新型藥物19、44 對白念珠菌的抑菌效果優(yōu)于氟康唑

體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，氟康唑、新型藥物19和44 對白念珠菌均有不同程度的抑制效果，相比氟康唑,白念珠菌對新型藥物19、44 更敏感，其中新型藥物44 對耐氟康唑的白念珠菌21897、210 和141 均有抑菌效果，抑菌效果要優(yōu)于氟康唑。菌絲抑制試驗(yàn)的結(jié)果顯示，在含有氟康唑、新型藥物19和44 的培養(yǎng)液中，白念珠菌SC5314 的菌絲生長被明顯抑制，并且藥物濃度越高（≤64.00 μg/mL）對菌絲的抑制程度越好。結(jié)果提示，新型藥物19 和44 對白念珠菌臨床株有一定的抑菌作用，與傳統(tǒng)藥物氟康唑相比，新型藥物19 和44 對菌株抑制效果更好，甚至對耐氟康唑白念珠菌也有抑菌效果，適用范圍更廣。

二、新型藥物19 和44 的抑菌作用可能通過改變白念珠菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)

PHILIP CM-120 透射電鏡的結(jié)果顯示，與正常對照的SC5314 細(xì)胞結(jié)構(gòu)相比，在含有氟康唑、新型藥物19 和44 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的SC5314 細(xì)胞膜厚薄不均，且質(zhì)地粗糙，與無藥對照株比較產(chǎn)生了明顯的結(jié)構(gòu)差異。由此可以推測，新型藥物19 和44對白念珠菌的作用靶點(diǎn)在細(xì)胞膜上，其作用機(jī)制可能是改變了細(xì)胞膜的成分，從而達(dá)到抑菌效果。氟康唑的主要作用機(jī)制為，抑制羊毛甾醇14α-去甲基化酶（ERG11 基因編碼），從而阻斷真菌細(xì)胞膜中麥角甾醇的生成，破壞真菌細(xì)胞壁的完整性[14]，而藥物靶酶編碼基因ERG11 的改變（突變、過表達(dá)等）是真菌耐藥的一個重要機(jī)制[15]。咪唑是一種五元雜環(huán)藥物[10]，咪唑環(huán)已被證明是許多生物活性分子的通用核心，如抗真菌、抗炎、抗氧化劑、抗腫瘤、抗寄生蟲和抗糖尿病活性[16-17]。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，新型藥物19 和44 造成的白念珠菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)異常與氟康唑類似，而后期菌株基因分析結(jié)果顯示，在新型藥物19 和44 作用下白念珠菌細(xì)胞膜的固醇合成通路受到影響，但未見唑類藥物靶酶ERG11的變化，說明新型咪唑類藥物與氟康唑的細(xì)胞膜作用靶點(diǎn)不同。

白念珠菌對唑類藥物的耐藥率逐年上升，尋找和研發(fā)廣譜低毒、高效的抗白念珠菌藥物，尤其是抗真菌作用機(jī)制與目前已知介導(dǎo)白念珠菌耐藥機(jī)制不同的藥物，對緩解臨床用藥壓力、提高治愈率有著重要的臨床意義[18]。本研究觀察的新型藥物19和44 抗白念珠菌的靶點(diǎn)和作用路徑不同于氟康唑，這一新的抗真菌作用機(jī)制有可能是研究新型藥物的潛在方向。在后續(xù)研究中，本研究團(tuán)隊(duì)將分析細(xì)胞膜的通透性，并聯(lián)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、薄層色譜掃描測定、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分析等進(jìn)一步研究新型藥物19 和44 對白念珠菌細(xì)胞膜的作用靶點(diǎn)以及具體的調(diào)節(jié)機(jī)制。