程序性死亡因子4 對(duì)“瘀毒”型冠心病及冠狀動(dòng)脈血管病變的診斷價(jià)值

胡夢(mèng)弦，何貴新，袁冬梅，馮雨菲，秦偉彬，王明遠(yuǎn)，鄭國(guó)坤，甲子永

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530299；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科二區(qū)，廣西 南寧 530023）

慢性炎癥［1］是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的主要影響因素，現(xiàn)代微觀病理研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥類(lèi)似于中醫(yī)的瘀毒理論，痰瘀日久不化，阻滯血脈醞釀成毒邪損傷脈絡(luò)［2］，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板聚集及炎癥因子的趨附，最終導(dǎo)致斑塊的形成。前期研究［3］發(fā)現(xiàn)痰瘀型不穩(wěn)定性心絞痛患者較其他中醫(yī)證型斑塊更易發(fā)生破裂，從而導(dǎo)致急性心肌梗死等不良心血管事件的發(fā)生。程序性死亡因子4（programmed cell death factor-4，PDCD4）作為一種腫瘤抑制因子，可通過(guò)調(diào)控各種炎癥因子的表達(dá)水平影響斑塊的形成。因此，本文通過(guò)研究PDCD4 的表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈狹窄程度和與中醫(yī)胸痹“瘀毒”亞型間的關(guān)聯(lián)，為冠心病的治療提供臨床參考依據(jù)，同時(shí)為中醫(yī)學(xué)對(duì)瘀毒型不穩(wěn)定性心絞痛患者的辯證提供血清學(xué)診斷指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選 取2019 年9 月～2020 年9 月 廣 西 中 醫(yī) 藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管二區(qū)118 例患者，這些患者都被診斷為不穩(wěn)定性心絞痛且行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈造影術(shù)，其中符合中醫(yī)辯證分型者80例，不穩(wěn)定性心絞痛診斷標(biāo)準(zhǔn)符合美國(guó)心臟病學(xué) 院（ACC）/美 國(guó) 心 臟 協(xié) 會(huì)（AHA）制 訂 的acute coronary syndrome（ACS）診 斷 和 治 療 指南［4］中 關(guān) 于 不 穩(wěn) 定 性 心 絞 痛（unstable angina pectoris，UAP）的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)?！疤叼觥毙托乇灾嗅t(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)以《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［5］中相關(guān)內(nèi)容為診斷標(biāo)準(zhǔn)，癥狀主要包括：胸部悶痛，以刺痛為主，疼痛部位固定，兼見(jiàn)氣短喘促、倦怠、納呆便溏、口黏、惡心；舌質(zhì)紫或見(jiàn)瘀斑，苔白膩或白滑，脈細(xì)澀或滑?！梆龆尽毙鸵躁惪杉街贫ǖ囊蚨局虏∞q證診斷量化標(biāo)準(zhǔn)［6］為診斷標(biāo)準(zhǔn)，癥狀主要包括：中重度胸悶痛或刺痛，或伴重度口苦、舌青或青紫、剝苔及舌下脈絡(luò)紫紅或絳紫。中醫(yī)辯證分析由2 名副高級(jí)心血管專(zhuān)科臨床主任醫(yī)師進(jìn)行，兩者診斷意見(jiàn)結(jié)果一致則納入，不一致則由一名正高級(jí)心血管專(zhuān)科臨床主任醫(yī)師進(jìn)行辯證分析。辯證結(jié)果為“瘀 毒”組40 例，“痰 瘀”組40 例。本 研 究 獲得所有研究對(duì)象的知情同意，且通過(guò)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述西醫(yī)及中醫(yī)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：心源性休克或急性心功能不全、難治性心力衰竭者；處于妊娠期患者；嚴(yán)重肝腎功能不全（轉(zhuǎn)氨酶大于正常上限2 倍或需要透析治療）、嚴(yán)重高血壓、內(nèi)分泌系統(tǒng)或血液系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；存在嚴(yán)重創(chuàng)傷以及腫瘤，近期有重大手術(shù)計(jì)劃；年齡≥85 歲者。

1.3 臨床觀察指標(biāo)

收集一般資料有性別、年齡、吸煙、飲酒；臨床數(shù)據(jù)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（NEUT）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板分布寬度（PDW）、血清肌酐（SCr）、超敏C 反應(yīng)蛋白（H-CRP）、D-二聚體、血清尿酸（UA）、胱抑素（Cystatin）、纖維蛋白原（FIB）、總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載 脂 蛋 白a（APO-a）、載 脂 蛋 白b（APO-b）。

1.4 PDCD4 因子檢測(cè)

患者入院后采用EDTA 抗凝管采集靜脈血標(biāo)本，6 mL/人，進(jìn)行2 次離心處理，初次4 ℃，3 000 r/min，10 min，轉(zhuǎn) 移 上 清 至 無(wú)RNA 酶 的EP 管；二 次4 ℃，16 000×g，10 min，將 離 心 后的血漿轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA 酶的無(wú)菌EP 管中，置于—80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)外周血PDCD4，所用試劑均由杭州赫貝生物科技有限公司提供，酶標(biāo)儀為美國(guó) SpectraMax 公司生產(chǎn)的 SpectraMax Plus 384 型微孔板分光光度計(jì)酶標(biāo)儀，操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 冠狀動(dòng)脈狹窄程度及數(shù)目

1.5.1 病變數(shù)目 冠狀動(dòng)脈直徑狹窄所累及主要冠狀動(dòng)脈支數(shù)分為：?jiǎn)沃Р∽?、雙支病變和多支病變，累及左主干時(shí)以同時(shí)累及左前降支和左回旋支計(jì)算。經(jīng)專(zhuān)業(yè)介入醫(yī)師行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈造影術(shù)檢測(cè)并評(píng)估冠狀動(dòng)脈血管病變支數(shù)，結(jié)果統(tǒng)計(jì)有34 例UA 患者為單支病變，23例為雙支病變患者，23 例為三支病變患者。1.5.2 病變程度 以冠狀動(dòng)脈病變近端的動(dòng)脈內(nèi)徑100% 為計(jì)分，輕度病變：狹窄程度為小于50%；中度病變：狹窄程度51%～75%；重度病變：狹窄程度76%～100%。經(jīng)由專(zhuān)業(yè)介入醫(yī)師行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈造影術(shù)檢測(cè)并評(píng)估冠狀動(dòng)脈血管狹窄程度，結(jié)果統(tǒng)計(jì)共有UA 患者20 為輕度狹窄，24 例為中度狹窄，36 例為重度狹窄。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件包行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)變量資料以（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；分類(lèi)變量資料以數(shù)字和百分比表示，組間采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用單因素方差Pearson 直線相關(guān)分析，對(duì)非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行Kruskal -Wallis 檢驗(yàn)。采用logistic回歸模型分析對(duì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素進(jìn)行分析，進(jìn)一步篩選出潛在的獨(dú)立影響因子，建立受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，分析獨(dú)立影響因子對(duì)冠心病“瘀毒”型的診斷價(jià)值。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般臨床資料分析比較

采用單因素方差分析比較兩組受試患者一般資料，兩組性別、年齡、吸煙、飲酒、TC、TG、HDL-C、LDL-C、APO-a、APO-b、WBC、NEUT、PLT、MPV 及PDW 差 異 無(wú) 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P＞0.05）；兩 組D-二 聚 體、H-CRP、SCr、cystatin、UA 及PDCD4 表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且 瘀 毒 組 的D-二 聚 體、H-CRP、SCr、cystatin、UA 及PDCD4 表達(dá)水平均高于痰瘀組。見(jiàn)表1。

表1 兩組間一般資料分析Tab 1 Analysis of baseline information between the two groups

2.2 瘀毒亞型相關(guān)性多因素logistic 回歸分析

以2.1 結(jié)果差異中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素超敏C 反應(yīng)蛋白（賦值：連續(xù)變量）、胱抑素（賦值：連續(xù)變量）、D-二聚體（賦值：連續(xù)變量）和PDCD4（賦值：連續(xù)變量）為自變量。以中醫(yī)亞型（賦值：痰瘀型＝0，瘀毒＝1）為因變量，結(jié)果顯示自變量超敏C 反應(yīng)蛋白、胱抑素及D-二聚體對(duì)冠心病瘀毒亞型的發(fā)生無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而PDCD4 對(duì)中醫(yī)亞型-瘀毒型的產(chǎn)生具有顯著影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 瘀毒亞型相關(guān)性多因素logistic 回歸分析Tab 2 Multivariate logistic regression analysis of the correlation of stasis toxin subtypes and each index

2.3 ROC 曲線分析PDCD4 對(duì)冠心病瘀毒亞型的診斷價(jià)值

采用ROC 曲線分析受試患者外周循環(huán)血中PDCD4 因子表達(dá)水平對(duì)冠心病瘀毒型的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示PDCD4 診斷瘀毒型AUC 面積 為88.6%，95%CI（1.894，2.532）（P＝0.029），具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。見(jiàn)圖1。

圖1 PDCD4 對(duì)冠心病瘀毒亞型診斷價(jià)值的AUC 曲線面積Fig 1 The AUC curve area of PDCD4 for the diagnostic value of blood stasis and toxin subtypes of coronary heart disease

2.4 PDCD4 因子表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈主血管病變支數(shù)間聯(lián)系

比較3 組病變數(shù)目患者間外周循環(huán)血PDCD4表達(dá)水平，3 組間兩兩比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），且PDCD4 因子表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈血管病變支數(shù)成正相關(guān)（r＝0.468，P＜0.001）。見(jiàn)表3。

2.5 PDCD4 因子表達(dá)水平與不同冠狀動(dòng)脈血管狹窄程度間聯(lián)系

比較3 組狹窄程度患者間外周循環(huán)血PDCD4表達(dá)水平，3 組間兩兩比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），且PDCD4 因子表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈血管病變程度成正相關(guān)（r＝0.535，P＜0.001）。見(jiàn)表3。

表3 PDCD4 因子表達(dá)水平與冠脈狹窄程度及病變支數(shù)的關(guān)聯(lián)（±s）Tab 3 Correlation between PDCD4 expression level and coronary stenosis degree and the number of diseased branches（±s）

表3 PDCD4 因子表達(dá)水平與冠脈狹窄程度及病變支數(shù)的關(guān)聯(lián)（±s）Tab 3 Correlation between PDCD4 expression level and coronary stenosis degree and the number of diseased branches（±s）

注：PDCD4：程序性細(xì)胞死亡因子4；與單支病變組比較，*P＜0.05;與雙支病變組比較，#P＜0.05。與輕度狹窄組相比較，aP＜0.05，與中度狹窄組相比較，bP＜0.05。

血管病變數(shù)目n PDCD4 F P 血管狹窄程度n PDCD4 F P單支34 0.685±0.543輕度20 1.567±0.397雙支23 2.120±0.543*82.272＜0.001中度24 1.860±1.062a 17.655＜0.01三支23 3.550±0.893*#重度36 3.260±1.088ab

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展進(jìn)步，人們的生活水平逐漸提高，心血管事件的發(fā)生率也隨之上升［7，8］。因此，積極有效防治心血管疾病對(duì)國(guó)民的健康非常重要。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為冠心病屬于中醫(yī)“胸痹”范疇，不同歷史時(shí)期醫(yī)家對(duì)胸痹的病機(jī)認(rèn)識(shí)各不相同，但“本虛標(biāo)實(shí)”這一基本病機(jī)均被歷代中醫(yī)學(xué)家所接受。本虛以正氣虛衰，無(wú)力鼓動(dòng)陽(yáng)氣抵抗外邪侵襲，標(biāo)實(shí)則氣滯、血瘀、寒凝、痰阻于脈道，導(dǎo)致心脈不通而痛。“痰”、“瘀”作為胸痹中主要的病機(jī)，在古代醫(yī)籍亦有詳盡的描述，如清代龔信在《古今醫(yī)鑒》中指出：“心痹痛者，……素有頑痰死血”，認(rèn)為痰濁、瘀血是胸痹的主要病理因素?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)大家陳可冀院士結(jié)合傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與冠心病的病理生理特點(diǎn)，認(rèn)為“胸痹”中的痰、瘀與冠心病中的動(dòng)脈粥樣斑塊和血栓相吻合，而瘀毒的出現(xiàn)與動(dòng)脈血管內(nèi)膜脂質(zhì)的沉積、血管壁內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥因子的趨附及釋放和纖維蛋白原溶解降低相關(guān)，并進(jìn)一步提出“因瘀致毒”理論［9，10］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)把“毒”分為內(nèi)毒與外毒，外毒為外感六淫之邪氣，內(nèi)毒則是由于機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，陰陽(yáng)失和，導(dǎo)致臟腑功能紊亂，氣血運(yùn)行失常，不能運(yùn)化氣血津液，導(dǎo)致痰濁、水飲、瘀血停滯于體內(nèi)，日久不化則醞釀成毒。此病理過(guò)程與動(dòng)脈斑塊形成過(guò)程相似，在冠心病的發(fā)展過(guò)程中，脂質(zhì)代謝異常沉積于血管內(nèi)膜，導(dǎo)致氧化應(yīng)激異常損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起炎癥因子的趨附及釋放增加。因此，炎癥因子在一定程度上可被認(rèn)為是“內(nèi)生毒邪”的作用因子。

PDCD4 是一種腫瘤抑制因子，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明其通過(guò)各種通路調(diào)控基因和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平在動(dòng)脈斑塊形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［11-13］。PDCD4 在轉(zhuǎn)錄水平上通過(guò)作用于Twist2/cMaf 或ERK/p38 途徑抑制巨噬細(xì)胞凋亡和IL-10的 產(chǎn) 生［14］，且 其 能 夠 被miR-16 和miR-155 靶 向 調(diào)節(jié)，通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB 以及SOCS1-STAT3 信號(hào)，抑制巨噬細(xì)胞分泌的促炎因子IL-6 的表達(dá)，調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化的形成［12］。此外，國(guó)內(nèi)研究表明PDCD4 的表達(dá)水平與血管狹窄嚴(yán)重程度具有顯著的相關(guān)性，可作為判斷冠狀動(dòng)脈狹窄程度的診斷性生物指標(biāo)［15］。本研究再次對(duì)冠心病患者循環(huán)血液中PDCD4 因子進(jìn)行測(cè)定，并結(jié)合CAG 檢查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PDCD4 的表達(dá)水平確實(shí)與冠狀動(dòng)脈血管狹窄程度及病變血管支數(shù)成正比，這一結(jié)論和陸振濤等［16］學(xué)者關(guān)于PDCD4 表達(dá)水平與冠脈病變關(guān)系的研究結(jié)果一致。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)以“望、聞、問(wèn)、切”為手段對(duì)疾病進(jìn)行辯證，但由于缺少實(shí)質(zhì)性相關(guān)的檢測(cè)指標(biāo)，影響了中醫(yī)學(xué)的發(fā)展。本研究初步研究了冠心病“瘀毒”型患者循環(huán)血液中的相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平與“瘀毒”亞型的相關(guān)性，探討相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響冠心病瘀毒型的影響因素，發(fā)現(xiàn)“瘀毒”組中相關(guān)臨床炎癥指標(biāo)如白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、超敏C 反應(yīng)蛋白、胱抑素及D-二聚體等較“痰瘀”組數(shù)值高，且經(jīng)SPASS 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超敏C 反應(yīng)蛋白、胱抑素、D-二聚體和PDCD4 的表達(dá)水平的差異在兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可作為“瘀毒”亞型形成的影響因素。本研究還發(fā)現(xiàn)超敏C 反應(yīng)蛋白和D-二聚體在“瘀毒”組中的表達(dá)水平明顯高于“痰瘀”組，這與張暄堯［17］和王蕓素等［18］的研究結(jié)論一致，進(jìn)一步證實(shí)相關(guān)炎癥細(xì)胞因子可被認(rèn)作是“內(nèi)生毒邪”的物質(zhì)。且經(jīng)多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)PDCD4 是影響“瘀毒”亞型形成的獨(dú)立影響因素，為探索PDCD4 是否能作為“瘀毒”亞型的診斷效能，通過(guò)建立ROC 曲線發(fā)現(xiàn)PDCD4 診斷“瘀毒”亞型的AUC 曲線面積為88.6%，可在一定程度上作為診斷“瘀毒”亞型的新型診斷標(biāo)志物。

綜上所述，本研究首次探討PDCD4 的表達(dá)水平與冠心病“瘀毒”型辯證和冠狀動(dòng)脈血管病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為中醫(yī)辯證提供新的科學(xué)臨床依據(jù)，但由于本研究所納入的樣本量較小，且研究所納入的受試者多為廣西地區(qū)居民，研究結(jié)果具有一定的局限性。研究中團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步開(kāi)展多地區(qū)、多樣本的臨床實(shí)驗(yàn)，從而使本次研究結(jié)論更具有代表性。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

胡夢(mèng)弦、袁冬梅：對(duì)文章進(jìn)行構(gòu)思與設(shè)計(jì)并撰寫(xiě)論文；馮雨菲、秦偉彬、甲子永、鄭國(guó)坤：進(jìn)行文獻(xiàn)和資料的收集、整理；何貴新、王明遠(yuǎn)：進(jìn)行文章的可行性分析及論文的修訂，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。