基于生物信息學(xué)的心梗患者血小板中差異基因篩選及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

崔勝宇，徐 林，浦 湧，夏 豪

（1. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢大學(xué)心血管病研究所，心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 武漢 430060；2. 武漢市漢南區(qū)人民醫(yī)院，武漢大學(xué)人民醫(yī)院漢南醫(yī)院，湖北武漢 430060）

心肌梗死（MI）是最嚴(yán)重的心血管疾病之一，發(fā)病率和死亡率很高［1］，主要是由于多種原因包括冠狀動脈內(nèi)血栓形成導(dǎo)致的冠脈長時間閉塞，引起心肌細(xì)胞缺血缺氧后壞死。血小板在冠脈內(nèi)血栓形成過程中發(fā)揮重要作用，血小板的聚集和功能活化是導(dǎo)致MI 的重要原因之一，因此臨床針對心血管疾病的治療最常見的手段之一就是抗血小板治療。相關(guān)研究表明，檢測分析血小板RNA 的表達(dá)可以為血小板的正常止血和血栓形成功能，以及血小板如何參與心梗發(fā)作，反應(yīng)和預(yù)后提供新的見解［2］。本文通過檢索挖掘GEO 數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)的相關(guān)方法，篩選心梗患者與正常人血小板miRNA及mRNA 差異表達(dá)基因，構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)功能及信號通路富集分析，揭示血小板的表達(dá)與功能改變。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

在GEO 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）分別檢索心梗病人的miRNA 及mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)。 miRNA 芯片數(shù)據(jù)來源于GSE24548，mRNA 芯片數(shù)據(jù)來源于GSE24519。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選

使用GEO 數(shù)據(jù)庫下的GEO2R 進(jìn)行表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析，GEO2R 是基于R 語言的在線分析工具，使用到Biobase、GEOquery 及l(fā)imma 包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以|logFC|＞1、P＜0.05 為篩選條件進(jìn)行差異miRNA 及mRNA 的篩選。使用R 語言中的ggplot2 包進(jìn)行差異miRNA 的火山圖繪制。

1.3 靶基因的預(yù)測及提取交集

使用FunRich 3.1.3 軟件中的尋找miRNA 靶基因功能進(jìn)行miRNA 的靶基因預(yù)測，而后運(yùn)用Perl語言腳本，對預(yù)測的靶基因與差異mRNA 取交集并與miRNA 交叉匹配，即高表達(dá)的miRNA 與低表達(dá)的mRNA 匹配，低表達(dá)的miRNA 與高表達(dá)的mRNA 匹配，最終得到miRNA-mRNA 對應(yīng)調(diào)控關(guān)系文件。

1.4 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用miRNA-mRNA 對應(yīng)調(diào)控關(guān)系文件在JAVA 環(huán)境下使用Cytoscape 3.8.0 進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化，構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 信號通路及生物學(xué)功能分析

利用和R 語言的clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2 包對交集中的基因進(jìn)行KEGG 富集可視化分析及GO 可視化分析，設(shè)定參數(shù)“Pvalue cutoff ＝0.05，Q value cutoff ＝0.05”。利用Perl 語言腳本和R 語言的digest、GOplot 包對KEGG 富集結(jié)果進(jìn)行圈圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNA 及mRNA 的篩選

miRNA 芯片數(shù)據(jù)（GSE24548）共篩選到差異miRNA 27 種，mRNA 芯片數(shù)據(jù)（GSE24519）共篩選到差異mRNA 2 897 個，圖1 示差異表達(dá)的火山圖。

圖1 miRNA 及mRNA 差異表達(dá)火山圖Fig 1 Volcano map of differentially expressed miRNA and mRNA

2.2 預(yù)測靶基因與差異mRNA 取交集后交叉匹配并可視化

27 種差異miRNA 共預(yù)測到靶基因3 563 個，與差異mRNA 取交集后得到376 個共同基因，這些共同基因與miRNA 交叉匹配后，共得到503 個miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系，在大部分調(diào)控關(guān)系中，miRNA 呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)（綠色），與之對應(yīng)的mRNA呈現(xiàn)上調(diào)（紅色）。使用Cytoscape 3.8.0 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化作圖，見圖2。

圖2 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig 2 miRNA-mRNA regulation network

2.3 miRNA 調(diào)控基因的KEGG 富集分析

對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）中的靶基因進(jìn)行KEGG 富集分析（圖3），結(jié)合富集基因數(shù)及調(diào)整后P值，排名前五的信號通路包括：PI3K-AKT 信號通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、MAPK 信號通路、人乳頭瘤病毒感染、Ras 信號通路，而低表達(dá)的基因中富集結(jié)果主要涉及GAB2、ITGB8、PAK1、LPAR2 基因，主要富集PI3K-AKT 信號通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)兩個通路（圖4）。

圖3 靶基因KEGG 富集分析Fig 3 KEGG enrichment analysis of target genes

圖4 KEGG 富集分析圈圖Fig 4 Circle graph of KEGG enrichment analysis

2.4 miRNA 調(diào) 控 基 因 的GO 分 析

對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）中的靶基因進(jìn)行GO 分析（圖5），展示了生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）的前10 個最顯著的GO Term。 BP中靶基因主要涉及軸突發(fā)生、軸突樹突狀蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、基于微管的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架依賴性細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、呼吸管發(fā)育、沿微管運(yùn)輸、發(fā)育參與形態(tài)發(fā)生、高爾基小泡運(yùn)輸、在子宮內(nèi)胚胎發(fā)育中、突觸組織。CC中靶基因主要涉及神經(jīng)脊柱、樹突棘、突觸后膜、突觸后專業(yè)化、突觸后密度、不對稱突觸、神經(jīng)元到神經(jīng)元突觸、突觸膜、突觸前、網(wǎng)格蛋白包被的囊泡膜。MF 主要涉及蛋白質(zhì)大分子銜接子活性、分子銜接子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄阻遏物活性等。

圖5 靶基因GO 分析Fig 5 GO analysis of target genes

3 討論

心肌梗死的發(fā)生與粥樣斑塊破裂繼發(fā)的血栓形成關(guān)系密切，血小板在血栓形成中又起主導(dǎo)作用，因此，探尋心梗病人血小板中基因的差異表達(dá)就顯得很有意義。本研究比較了急性心梗病人血小板中差異表達(dá)的miRNA，由于miRNA 主要發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因的作用［3］，因此我們通過預(yù)測軟件進(jìn)行了其靶基因的預(yù)測，并與芯片數(shù)據(jù)篩選出的差異mRNA 取交集，再通過Cytoscape 基因互作分析軟件做出了miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，最后通過R 語言的方法繪制出了靶基因富集的的KEGG與GO 分析，揭示了血小板基因在心梗中的差異表達(dá)及可能作用，為可能的靶向干預(yù)治療提供了一個方向。

經(jīng)火山圖可以看出，miRNA 芯片數(shù)據(jù)大部分呈現(xiàn)低表達(dá)，mRNA 芯片數(shù)據(jù)大部分呈現(xiàn)高表達(dá)，說明兩芯片數(shù)據(jù)較為一致。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的miRNA 與心 血 管 疾 病 密 切 相 關(guān)：Zhou 等［4］的 研 究 發(fā) 現(xiàn)miR-29b-3p 可通過調(diào)節(jié)TGFβ1/Smad3 通路在缺氧的心肌細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用；miR-19a-3p 被報道在缺血性腦卒中中參與了炎癥反應(yīng)，血液凝固和血小板活化［5］；miR-32-5p 可調(diào)控人心臟成纖維細(xì)胞的凋亡，增殖和表型變化［6］；miR-142-3p 可從活化的血小板經(jīng)血小板衍生微粒傳遞到內(nèi)皮細(xì)胞中促進(jìn)高血壓中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖［7］；循環(huán)中miR-133b 的水平也被證實(shí)與接受冠脈介入治療的心?；颊叩呐R床預(yù)后 密 切 相 關(guān)［8］；此 外，Weng 等［9］的 研 究 發(fā) 現(xiàn) 抑 制miR-34a-5p 可能通過刺激CTRP9 的表達(dá)促進(jìn)脂肪干細(xì)胞對心梗損傷的保護(hù)功能。

對網(wǎng)絡(luò)圖中的靶基因進(jìn)行KEGG 富集分析顯示，靶基因主要參與PI3K-AKT 信號通路。PI3K-AKT 通路已被報道廣泛參與各種原因所致的血小板的活化過程并直接參與整聯(lián)蛋白功能的調(diào)節(jié)［10-12］，在心梗發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。MAPK信號通路也被報道廣泛參與血小板的聚集、鈣動員、顆粒分泌和纖維蛋白原與整聯(lián)蛋白αIIbβ3 的結(jié)合［13，14］。同樣的，Ras 信號通路與血小板的活化也密切相關(guān)［15］。血小板的活化在心梗發(fā)生過程中占據(jù)重要作用，其活化后通過黏附、聚集、釋放等機(jī)制參與血栓形成。因此，針對這些富集的通路，我們應(yīng)該可以調(diào)控血小板活化進(jìn)程，對血栓的形成進(jìn)行靶向干預(yù)。

對網(wǎng)絡(luò)圖中的靶基因進(jìn)行的GO 分子功能分析顯示，靶基因主要涉及蛋白質(zhì)大分子銜接子活性、分子銜接子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄阻遏物活性等功能，這些功能都提示了血小板的活化過程，揭示了血小板的激活在心梗發(fā)生過程中的重要作用。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)的方法篩選出了心梗病人血小板中差異表達(dá)的miRNA，構(gòu)建了miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步對網(wǎng)絡(luò)中的靶基因進(jìn)行通路和功能分析，揭示了血小板中miRNA及相關(guān)基因在心梗發(fā)生中的重要作用，為今后的干預(yù)治療及靶點(diǎn)選擇提供了新的見解。