桃紅四物合劑對兔股動(dòng)脈吻合術(shù)后凝血功能及PI3K/AKT/mTOR 通路的影響

謝心軍，謝先敏，鄺高艷，許曉彤，李梓宸，安建平，王 哲，周 麒，岳凱峰，東智卓瑪

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007）

隨著工業(yè)器械的廣泛使用，斷肢（指）的發(fā)生率逐漸增加，而斷肢（指）再植術(shù)可最大化地保留患者的肢體功能，亦能增加患肢的美觀度。但動(dòng)脈血管危象是影響再植術(shù)肢（指）成活率的主要并發(fā)癥，其多由疼痛、寒冷、吸煙、心理等各種原因引起動(dòng)脈血管痙攣，脈管內(nèi)血液流通受阻引發(fā)血栓形成，最終導(dǎo)致遠(yuǎn)端軟組織缺血缺氧而壞死［1-3］。因此，術(shù)后積極預(yù)防血管危象并對其進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察、發(fā)現(xiàn)和緊急處理，是斷肢（指）再植術(shù)能否成功的關(guān)鍵。

目前對于動(dòng)脈血管危象的處理主要是以抗感染、抗痙攣、抗凝血為主的預(yù)防性藥物治療［4，5］，常見低分子肝素、罌粟堿、低分子右旋糖酐、肝素、前列地爾等，給藥方式多為臀部肌肉注射、局部注射、靜脈注射、和自控型鎮(zhèn)痛泵等。然而，持續(xù)或較大劑量使用傳統(tǒng)“三抗”治療存在多種不良反應(yīng)，包括注射局部皮膚皮疹、疼痛、硬結(jié)，惡心、胸悶，血小板減少、出血［6-8］以及心室纖維顫動(dòng)、心跳驟停等嚴(yán)重不良反應(yīng)［9］。而且由于相關(guān)的抗凝、抗痙攣藥物的藥代動(dòng)力學(xué)差異和患者的個(gè)體差異，其對血管危象的防治效果不甚穩(wěn)定［9，10］，故探索多途徑、多角度、多手段預(yù)防血管危象是非常必要的。有學(xué)者認(rèn)為小劑量抗焦慮藥物［11］、臭氧自體血治療［12］和術(shù)后應(yīng)用保溫技術(shù)、心理護(hù)理［13-15］等治療方案也可降低斷肢（指）再植術(shù)后血管危象發(fā)生率。

而中醫(yī)藥在提高斷肢（指）成活率方面效用明確。多項(xiàng)研究表明［16-19］，中藥可有效防治斷肢（指）再植術(shù)后動(dòng)脈血管危象的發(fā)生，提高臨床療效。中藥復(fù)方桃紅四物湯的藥效研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯抗凝、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、止痛、抗炎等作用，且不良反應(yīng)發(fā)生率低。在防治下肢靜脈血栓、創(chuàng)傷性骨折、膝骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、疼痛等常見骨科疾病及動(dòng)脈硬化、腦梗、心絞痛等心血管疾病中療效顯著［20-24］，而其活血抗凝、抗感染、止痛等相關(guān)藥理作用正適應(yīng)斷肢（指）再植術(shù)后的治療需求。但中藥湯劑存在煎煮耗時(shí)、攜帶困難等不便，為此，我院以清·吳謙《醫(yī)宗金鑒》之桃紅四物湯為基礎(chǔ)方，結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和醫(yī)典醫(yī)案，將方中藥味藥量及配伍加減化裁，利用現(xiàn)代工藝手段制成便于臨床運(yùn)用的桃紅四物合劑，其在臨床干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎、皮瓣移植術(shù)后、肢體缺血再灌注等治療方面的療效確切［23，25，26］；但其對于斷肢（指）再植術(shù)后的治療及相關(guān)機(jī)制尚不明確。

創(chuàng)傷、手術(shù)、炎癥等能夠激活組織細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，此通路通過正性調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α），間接誘導(dǎo)調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、各類趨化因子的釋放增強(qiáng)，達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖生長、血管舒張及血管新生的作用。

故本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察兔股動(dòng)脈吻合術(shù)后予以桃紅四物合劑對兔凝血相關(guān)指標(biāo)的影響，明確其是否能夠預(yù)防血管危象，同時(shí)觀察其對PI3K/AKT/mTOR 信號通路的影響，探討其是否能夠促進(jìn)血管新生，并為臨床上應(yīng)用桃紅四物合劑預(yù)防或改善斷肢（指）再植術(shù)后血管危象提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 普通級新西蘭大白兔30 只，3 個(gè)月齡，均為體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購［湖南太平生物科技有限公司，許可證號SCXK（湘）2015-0004］，動(dòng)物飼養(yǎng)室溫（23±2）℃，相對濕度50%～60%。

本實(shí)驗(yàn)獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會準(zhǔn)許，倫理編號LLBH-201907300002，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號：SYXK（湘）2019-0009。

1.1.2 藥物與試劑 桃紅四物合劑為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制（制劑制備字Z202002299000，生產(chǎn)批號20190408）；鹽酸罌粟堿氯化鈉注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H32020967，批號：PH181105）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020657，產(chǎn)品批號：F8042104）；烏來糖（合肥巴斯夫生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：BSF191120）；0.9%氯化鈉注射液（湖南康源制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H43020169，生產(chǎn)批號C20063001d）；PI3K、AKT、mTOR 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為ml360578、ml601105、ml250325，批號均為12/2019）。

1.1.3 儀器 臺式高速冷凍離心機(jī)（湘儀，貨號H1650R），全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（匯松，貨號PW-812），多功能酶標(biāo)分析儀（匯松，貨號MB-530），恒溫培養(yǎng)箱（光明，DHP-500），自動(dòng)平衡離心機(jī)（湘儀，貨號L530）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 將30 只新西蘭大白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，確認(rèn)全部健康。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型對照組、鹽酸罌粟堿注射液組以及桃紅四物合劑低、中、高劑量組，每組5 只。桃紅四物合劑低、中、高劑量組自術(shù)后半小時(shí)開始予以桃紅四物合劑灌胃，給藥量以臨床人與兔體表面積換算［27］，灌胃量分別為2.80、5.61、11.22 mL/kg，中劑量為臨床等效劑量，桃紅四物合劑低、中劑量組與高劑量組補(bǔ)液差額予以中藥灌胃4 h 后差額體積0.9%氯化鈉注射液灌胃（分別為8.42、5.61 mL/kg），連續(xù)灌胃7 d?？瞻讓φ战M、模型對照組及鹽酸罌粟堿注射液組予以0.9% 氯化鈉注射液灌胃11.21 mL/kg。為防止感染，5 組造模實(shí)驗(yàn)兔在術(shù)后3 d 內(nèi)連續(xù)肌肉注射青霉素40 萬U/d［28］。

造模過程中，桃紅四物合劑中劑量組及模型對照組內(nèi)各有1 只實(shí)驗(yàn)兔因?qū)β樗幉荒褪軐?dǎo)致死亡，重新取2 只新西蘭大白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后采用隨機(jī)數(shù)字表法分別補(bǔ)充至上述兩組。

1.2.2 造模及樣本采集 模型對照組、鹽酸罌粟堿注射液組以及桃紅四物合劑低、中、高劑量組實(shí)驗(yàn)兔予以股動(dòng)脈單純間斷端端縫合模型［29］：實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈緩慢推注25%烏來糖1 g/kg 以麻醉，麻醉成功后實(shí)驗(yàn)兔取仰臥位，將兔上切牙及四肢固定在解剖臺上；均取兔右后大腿脫毛，予以常規(guī)消毒、鋪巾；大腿內(nèi)側(cè)根部入路，作一長約3 cm 橫切口，逐層分離，游離并保護(hù)股靜脈及股神經(jīng)，游離出股動(dòng)脈后血管夾夾閉，于中段部位切斷；切斷后在10 倍顯微鏡下進(jìn)行顯微縫合，用兩定點(diǎn)縫合法，以9-0 不可吸收顯微縫線進(jìn)行單純間斷端端縫合；吻合完畢后除掉血管夾，檢查吻合口無漏血，股動(dòng)脈再通良好，證明造模成功；然后關(guān)閉切口，無菌敷料包扎后石膏外固定。

樣本采集：在造模前30 min，造模后1、2、3、7 d 負(fù)壓抗凝試管分別采取各組實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈血2 mL。

1.2.3 檢測APTT，F(xiàn)IB 采血試管對稱位置放入高速臺式低溫離心機(jī)，以3×10 r/min 離心10 min，取上層血漿，按試劑盒操作說明運(yùn)用全自動(dòng)血凝分析儀，檢測APTT、FIB 含量。

1.2.4 ELISA Kit 檢測PI3K、AKT、mTOR 蛋白表達(dá)濃度 采血試管對稱位置放入高速臺式低溫離心機(jī)，4 ℃1 000g離心15 min ，取上清進(jìn)行分裝并－20 ℃保存標(biāo)本，解凍后的樣品再次離心后按試劑盒操作說明檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，6 組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，均采用（±s）表示。各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性時(shí)，6組組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法；各組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。設(shè)定檢驗(yàn)水平α＝0.05，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物合劑對兔股動(dòng)脈吻合術(shù)后APTT 及FIB 的影響

與空白對照組血漿APTT 相比，模型對照組于術(shù)后1～7 d 均明顯縮短（P＜0.05）；與模型對照組血漿APTT 相比，桃紅四物合劑低、中、高劑量組于術(shù)后1～7 d 均明顯延長（P＜0.05），鹽酸罌粟堿注射液組于術(shù)后2～7 d 均明顯延長（P＜0.05）；與鹽酸罌粟堿注射液組血漿APTT 相比，桃紅四物合劑中劑量組于術(shù)后2～7 d 均明顯延長（P＜0.05），桃紅四物合劑高劑量組于術(shù)后1～7 d 均明顯延長（P＜0.05）。見表1。

表1 6 組治療前后APTT 比較（s，n=5，±s）Tab 1 Comparison of APTT before and after treatment in six groups（s，n=5，±s）

表1 6 組治療前后APTT 比較（s，n=5，±s）Tab 1 Comparison of APTT before and after treatment in six groups（s，n=5，±s）

注：與模型對照組比較，#P＜0.05；與鹽酸罌粟堿注射液組比較，▲P＜0.05。

7 d 23.52±3.16#18.40±3.06▲24.16±3.33#25.98±3.50#28.70±3.22#▲32.62±1.97#▲14.082＜0.001組別空白對照組模型對照組鹽酸罌粟堿注射液組桃紅四物合劑低劑量組桃紅四物合劑中劑量組桃紅四物合劑高劑量組FP手術(shù)前23.58±4.33 23.40±2.97 23.62±3.16 23.90±3.01 23.46±3.21 23.36±2.48 0.025 1.000 1 d 23.76±3.09#15.36±2.35▲18.58±2.52 18.94±2.56#21.42±3.05#24.04±3.02#▲8.630＜0.001 2 d 23.86±2.77#12.16±1.35▲23.26±3.47#23.58±2.25#27.16±2.82#▲27.94±1.88#▲30.046＜0.001 3 d 23.68±2.80#10.08±1.61▲27.44±3.78#27.94±2.62#32.40±1.89#▲34.14±1.03#▲74.652＜0.001

與空白對照組血漿FIB 值相比，模型對照組于術(shù)后1～7 d 均明顯增高（P＜0.05）；與模型對照組血漿FIB 值相比，桃紅四物合劑中、高劑量組于術(shù)后1～7 d 均明顯減小（P＜0.05），桃紅四物合劑低劑量組于術(shù)后2～7 d 均明顯減?。≒＜0.05），鹽酸罌粟堿注射液組于術(shù)后2～7 d 均明顯減?。≒＜0.05）；與鹽酸罌粟堿注射液組血漿FIB 值相比，桃紅四物合劑中、高劑量組于術(shù)后1～7 d 均明顯減?。≒＜0.05）。見表2。

表2 6 組治療前后FIB 比較（g/L，n=5，±s）Tab 2 Comparison of FIB before and after treatment in six groups（g/L，n=5,±s）

表2 6 組治療前后FIB 比較（g/L，n=5，±s）Tab 2 Comparison of FIB before and after treatment in six groups（g/L，n=5,±s）

注：與模型對照組比較，#P＜0.05；與鹽酸罌粟堿注射液組比較，▲P＜0.05。

7 d 2.80±0.42#3.60±0.37▲2.70±0.38#2.68±0.42#2.10±0.48#▲2.06±0.38#▲9.332＜0.001組別空白對照組模型對照組鹽酸罌粟堿注射液組桃紅四物合劑低劑量組桃紅四物合劑中劑量組桃紅四物合劑高劑量組FP手術(shù)前2.76±0.36 2.80±0.39 2.82±0.41 2.82±0.42 2.78±0.54 2.78±0.50 0.015 1.000 1 d 2.78±0.40#3.74±0.46 3.56±0.46 3.44±0.40 2.82±0.47#▲2.68±0.43#▲5.603 0.001 2 d 2.84±0.38#4.26±0.36▲3.30±0.43#3.22±0.40#2.34±0.32#▲2.30±0.27#▲20.222＜0.001 3 d 2.82±0.40#4.48±0.32▲2.78±0.59#2.60±0.48#2.02±0.38#▲1.92±0.18#▲25.192＜0.001

2.2 桃紅四物合劑對兔股動(dòng)脈吻合術(shù)后PI3K、AKT、mTOR 表達(dá)的影響

與空白對照組相比，模型對照組血清PI3K、AKT、mTOR 的表達(dá)濃度在術(shù)后1～7 d 均明顯增高（P＜0.05）。

與模型對照組血清PI3K、AKT、mTOR 表達(dá)濃度相比，桃紅四物合劑低劑量組、鹽酸罌粟堿注射液組均于術(shù)后7 d 明顯增高（P＜0.05），桃紅四物合劑高劑量組于術(shù)后1～7 d 均明顯增高（P＜0.05），桃紅四物合劑中劑量組PI3K 及AKT 表達(dá)濃度于術(shù)后2～7 d 均明顯增高（P＜0.05）、mTOR 表達(dá)濃度于術(shù)后3～7 d 均明顯增高（P＜0.05）。

與鹽酸罌粟堿注射液組血清PI3K、AKT、mTOR 表達(dá)濃度相比，桃紅四物合劑中劑量組于術(shù)后3～7 d 均明顯增高（P＜0.05），桃紅四物合劑高劑量組PI3K 及mTOR 表達(dá)濃度于術(shù)后1～7 d 均明顯增高（P＜0.05）、AKT 表達(dá)濃度于術(shù)后3～7 d 均明顯增高（P＜0.05）；見表3～5。

表3 6 組治療前后PI3K 蛋白表達(dá)濃度比較（pg/mL，n=5，±s）Tab 3 Comparison of PI3K protein expression concentration of six groups before and after treatment（pg/mL，n=5,±s）

表3 6 組治療前后PI3K 蛋白表達(dá)濃度比較（pg/mL，n=5，±s）Tab 3 Comparison of PI3K protein expression concentration of six groups before and after treatment（pg/mL，n=5,±s）

注：與模型對照組比較，#P＜0.05；與鹽酸罌粟堿注射液組比較，▲P＜0.05。

7 d 432.46±12.32#554.83±15.92 574.29±23.03#575.62±11.42#597.47±8.35#▲616.69±9.44#▲104.588＜0.001組別空白對照組模型對照組鹽酸罌粟堿注射液組桃紅四物合劑低劑量組桃紅四物合劑中劑量組桃紅四物合劑高劑量組FP手術(shù)前432.62±13.37 432.07±10.07 431.42±11.58 430.70±13.06 433.42±8.71 431.71±5.97 0.039 0.999 1 d 437.57±14.72#486.95±16.58 490.08±13.44 481.14±15.54 500.79±10.76 517.51±11.47#▲18.595＜0.001 2 d 434.31 ±11.86#522.35±17.71 534.69±11.79 523.42±16.98 545.06±21.37#557.05±15.67#▲36.259＜0.001 3 d 437.42±10.82#540.72±14.84 558.30±18.67 561.00±17.08 583.55±24.96#▲596.15±8.43#▲57.852＜0.001

表4 6 組治療前后AKT 蛋白表達(dá)濃度比較（ng/mL，n=5，±s）Tab 4 Comparison of AKT protein expression concentration of six groups before and after treatment（ng/mL，n=5,±s）

表4 6 組治療前后AKT 蛋白表達(dá)濃度比較（ng/mL，n=5，±s）Tab 4 Comparison of AKT protein expression concentration of six groups before and after treatment（ng/mL，n=5,±s）

注：與模型對照組比較，#P＜0.05；與鹽酸罌粟堿注射液組比較，▲P＜0.05。

7 d 3.32±0.10#4.26±0.23 4.53±0.22#4.58±0.14#4.84±0.24#▲5.11±0.17#▲53.551＜0.001組別空白對照組模型對照組鹽酸罌粟堿注射液組桃紅四物合劑低劑量組桃紅四物合劑中劑量組桃紅四物合劑高劑量組FP手術(shù)前3.35±0.15 3.37±0.18 3.31±0.15 3.28±0.16 3.32±0.24 3.31±0.11 0.176 0.969 1 d 3.35±0.15#3.77±0.33 3.83±0.18 3.70±0.24 4.03±0.36 4.11±0.16#5.822 0.001 2 d 3.36±0.14#3.97±0.31 4.05±0.15 3.90±0.20 4.29±0.26#4.32±0.10#14.160＜0.001 3 d 3.40±0.16#4.14±0.31 4.18±0.16 4.22±0.09 4.50±0.19#▲4.62±0.12#▲26.093＜0.001

表5 6 組治療前后mTOR 蛋白表達(dá)濃度比較（ng/mL，n=5，±s）Tab 5 Comparison of mTOR protein expression concentration of six groups before and after treatment（ng/mL，n=5,±s）

表5 6 組治療前后mTOR 蛋白表達(dá)濃度比較（ng/mL，n=5，±s）Tab 5 Comparison of mTOR protein expression concentration of six groups before and after treatment（ng/mL，n=5,±s）

注：與模型對照組比較，#P＜0.05；與鹽酸罌粟堿注射液組比較，▲P＜0.05。

7 d 33.60±1.51#41.62±1.58 43.78±0.72#43.96±0.94#46.04±1.77#▲48.00±0.51#▲79.156＜0.001組別空白對照組模型對照組鹽酸罌粟堿組桃紅四物合劑低劑量組桃紅四物合劑中劑量組桃紅四物合劑高劑量組FP手術(shù)前33.66±1.45 33.68±1.02 33.34±1.14 33.65±1.29 33.52±1.80 33.35±1.35 0.065 0.997 1 d 33.80±1.42#36.21±1.05 36.46±1.59 35.58±1.32 37.63±2.04 38.68±1.32#▲6.409 0.001 2 d 33.78±1.26#38.29±1.67 39.04±1.24 37.79±1.56 40.10±2.34 41.85±1.66#▲13.315＜0.001 3 d 33.65±1.38#39.85±1.12 40.90±1.48 40.36±1.69 42.81±1.43#▲43.92±1.53#▲30.610＜0.001

3 討論

在中醫(yī)學(xué)理論中，“血管”的概念涵蓋于“脈”之中［30］。由此，現(xiàn)代血管的解剖稱謂在古代文獻(xiàn)中常稱為“脈”，“血脈”，“血絡(luò)”等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，斷肢（指）為外傷致筋骨離斷、血脈受損，筋傷骨折失其連接作用使肢（指）體活動(dòng)障礙，再植后血管危象為血脈受損，或因血溢脈外，或因血滯脈內(nèi)，均凝為瘀血、繼發(fā)氣滯使筋脈失養(yǎng)，總以外傷致筋脈血瘀、氣滯、失養(yǎng)為病機(jī)。故治療應(yīng)以活血行氣、化瘀通脈、養(yǎng)血活血為法［31，32］。

桃紅四物湯首見于清·吳謙《醫(yī)宗金鑒》，方中川芎、當(dāng)歸、白芍、熟地黃、桃仁及紅花相合，共奏養(yǎng)血活血逐瘀之效，為中醫(yī)傳統(tǒng)袪瘀生新的經(jīng)典方劑之一。我院中醫(yī)骨傷科以桃紅四物湯為基礎(chǔ)方研制的桃紅四物合劑不僅功效類似，且在存儲、服用等方面相較于桃紅四物湯更加方便。現(xiàn)代化學(xué)成分及藥理作用研究表明，桃紅四物湯有抗血栓，抑制血小板聚集，快微動(dòng)脈血流，改善局部微循環(huán)［33，34］；延緩股骨頭壞死，促進(jìn)骨折愈合并減少下肢靜脈血栓、腫脹 等并發(fā)癥［35，36］；增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷并增加內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能失調(diào)［37-39］。

現(xiàn)顯微外科縫合技術(shù)成熟、手術(shù)器械先進(jìn)使得血管吻合質(zhì)量顯著提高，術(shù)后護(hù)理模式多樣且全面，均能有效提升再植術(shù)后存活率。因此，外傷、手術(shù)等損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，以及伴隨的炎癥反應(yīng)激活血小板及內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)，血小板凝集、纖維蛋白形成、血液高凝使血小板等在損傷部位發(fā)生粘附，吻合動(dòng)脈管壁血栓形成，吻合血管失通是再植失敗的主要病理原因［40-43］。

PI3K/AKT/mTOR 通路是人體內(nèi)參與多種生理和病理狀態(tài)的關(guān)鍵信號通路，通過通路本身及其下游底物HIF-1α、VEGF 等介質(zhì)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖、代謝、存活，是平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生長發(fā)育的必要條件，在血管生成過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)［44-46］，PI3K 是機(jī)體血管病理及生理性生成活動(dòng)過程中尤為重要的信號節(jié)點(diǎn)，通過調(diào)控血管生成過程中毛細(xì)血管周細(xì)胞的增殖和成熟參與血管生成，且Ⅰ類PI3K 中的亞型PI3Kα 是血管內(nèi)皮細(xì)胞生成、生長、凋亡等過程中最相關(guān)的亞型。PI3K 的活化使AKT 發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)KT。研究發(fā)現(xiàn)［47，48］，AKT 具有負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞凋亡機(jī)制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖存活，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活與凋亡之間的平衡協(xié)調(diào)。mTOR 與PI3K/AKT 具有雙向激活 效 應(yīng)，且mTOR 是HIF-1α 促 進(jìn)VEGF 表 達(dá) 之 間的 連 系 點(diǎn)。mTOR 正 性 調(diào) 節(jié)HIF-1α 的 表 達(dá)，HIF-1α 不僅可以直接激活VEGF 的轉(zhuǎn)錄活性，還可以通過缺氧條件下合成NO 使血管通透性增加從而促進(jìn)VEGF 表達(dá)［49-53］。血管新生過程中骨架結(jié)構(gòu)的構(gòu)成、細(xì)胞形態(tài)的伸長、細(xì)胞的遷移增殖等關(guān)鍵環(huán)節(jié)均 是 在VEGF 調(diào) 控 下 完 成［54］。因 此，PI3K/AKT/mTOR 信號通路不僅能夠直接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，還可以通過激活下游HIF-1α 及VEGF 等多層面宏觀調(diào)控血管新生。

本研究結(jié)果顯示，模型對照組實(shí)驗(yàn)兔血清PI3K、AKT、mTOR 的表達(dá)濃度在術(shù)后1～7 d 均明顯高于空白對照組，表明血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、缺血缺氧可以激活PI3K/AKT/mTOR 通路，同上述研究結(jié)果一致。桃紅四物合劑組與模型對照組相比，低劑量組血清PI3K、AKT、mTOR 表達(dá)濃度于術(shù)后7 d 明顯增高，中劑量組PI3K 及AKT 表達(dá)濃度于術(shù)后2～7 d 均明顯增高、mTOR 表達(dá)濃度于術(shù)后3～7 d 均明顯增高，高劑量組于術(shù)后1～7 d 均明顯增高。同時(shí)，桃紅四物合劑與鹽酸罌粟堿注射液組相比，中劑量組血清PI3K、AKT、mTOR 表達(dá)濃度于術(shù)后3～7 d 均明顯增高，高劑量組PI3K 及mTOR 表達(dá)濃度于術(shù)后1～7 d 均明顯增高、AKT 表達(dá)濃度于術(shù)后3～7 d 均明顯增高，表明桃紅四物合劑能夠通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路促進(jìn)血管新生，利于兔股動(dòng)脈吻合術(shù)后再通血管的修復(fù)愈合，利于提高再植術(shù)后成活率。

本研究僅通過ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測PI3K/AKT/mTOR 通路指標(biāo)，方法較為單一，無法判斷除通路指標(biāo)作用外是否有下游產(chǎn)物作用。進(jìn)一步研究將結(jié)合吻合血管病理切片觀察血管再生情況、免疫組化法檢測本通路及其下游指標(biāo)觀察是否有下游指標(biāo)參與、使用PI3K/AKT/mTOR 通路阻斷劑判斷是否為通路直接作用。

作者貢獻(xiàn)度說明：

東智卓瑪：參與全程實(shí)驗(yàn)；謝先敏、李梓宸、許曉彤：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模等；安建平、王哲、周麒、岳凱峰：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃，標(biāo)本采集等；謝心軍：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；鄺高艷：論文指導(dǎo)。