p53和DNA損傷調(diào)節(jié)基因1在口腔癌組織中的表達(dá)及通過Wnt/β-catenin信號途徑對口腔癌細(xì)胞自噬和凋亡的影響*

董慶旭 趙鄭莉

（河南省第二人民醫(yī)院口腔科，鄭州 451100）

口腔癌占全部惡性腫瘤的1.9%～3.5%，頭頸癌的4%～20%，發(fā)病率僅低于鼻咽癌[1]。目前，針對口腔癌的治療方法與其他癌癥類似，包括基因、免疫和腫瘤干細(xì)胞等新型治療方法，但是療效尚不能令人滿意[2]。因此，進(jìn)一步明確定口腔癌治療靶標(biāo)對于開發(fā)特異性分子靶向藥物和評估口腔癌的預(yù)后至關(guān)重要。p53和DNA損傷調(diào)節(jié)基因1（p53 and DNA damage regulated gene 1，PDRG1）與各種細(xì)胞生理活動密切相關(guān)，包括細(xì)胞增殖、生長、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和DNA損傷修復(fù)[3]。研究表明，PDRG1可作為致癌分子，例如，PDRG1在大腸癌組織和胃癌組織中高表達(dá)，同時在結(jié)腸癌的細(xì)胞中沉默PDRG1會影響癌細(xì)胞的生長[4]。Tao等[5]研究表明PDRG1可能通過介導(dǎo)ATM-p53信號通路來影響肺癌細(xì)胞的生長和放射敏感性。但PDRG1是否在口腔癌中表達(dá)和發(fā)揮功能尚不清楚。 因此，本研究檢測了PDRG1在口腔癌組織及口腔癌細(xì)胞系中的表達(dá)，同時觀察沉默PDRG1對口腔癌細(xì)胞增殖、自噬及凋亡的影響，為PDRG1在口腔癌進(jìn)展中的作用及其作為新的治療靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床組織

收集2017年6月至2019年6月在河南省第二人民醫(yī)院60例接受口腔癌切除手術(shù)的患者的癌組織標(biāo)本及配對的癌旁組織，其中男性30例，女性30例；年 齡35～68歲，平均（53.21±5.34）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2010年口腔頜面部惡性腫瘤治療指南，經(jīng)病理診斷確定為口腔癌（不受癌癥分期及組織學(xué)類型限制）；（2）術(shù)前未接受抗腫瘤治療，無其他部位惡性腫瘤，無認(rèn)知功能障礙。所有患者術(shù)前均簽署了知情同意書。所有組織標(biāo)本都保存在-80℃直至使用。

1.2 細(xì)胞和主要試劑

正常人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞（NHOK）和口腔癌細(xì)胞系（SCC-4，SCC-25，SCC-15，SCC-9）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco公司）；TRIzol試劑、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqⅡ試劑盒（日本TaKaRa公司）；shNC和shPDRG1質(zhì)粒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；LipofectamineTM3000（美國Invitrogen公司）；Annexin V/PI試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒、PDRG1抗體（美國Abcam公司）；β-catenin抗體、c-myc抗體、cyclin D1抗體、GAPDH抗體、IgG-HRP抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

NHOK細(xì)胞、SCC-4細(xì)胞、SCC-25細(xì)胞、SCC-15細(xì)胞和SCC-9細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)基。

SCC-15細(xì)胞按照1×105個/孔接種在24孔板中，隨機(jī)分為shNC組（轉(zhuǎn)染shNC質(zhì)粒）和shPDRG1組（轉(zhuǎn)染shPDRG1質(zhì)粒）。待細(xì)胞生長融合至60%時，按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中shNC和shPDRG1的轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L。在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后結(jié)束培養(yǎng)，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 細(xì)胞集落形成實驗檢測細(xì)胞增殖

培養(yǎng)結(jié)束后的各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化以5×102個/孔接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。14 d后，用4%多聚甲醛固定并用0.1%結(jié)晶紫染色，計數(shù)含有≥50個細(xì)胞的集落，顯微鏡拍攝代表性集落并統(tǒng)計。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

培養(yǎng)結(jié)束后的各組細(xì)胞，離心并重懸于緩沖液中。細(xì)胞依次Annexin V溶液10 μL和PI溶液10 μL染色，之后將細(xì)胞在室溫下黑暗環(huán)境中孵育30 min，然后使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.6 電鏡觀察細(xì)胞自噬體的數(shù)量

各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后吸去上清，PBS洗滌，加入2.5%戊二醛固定過夜，再加入1%鋨酸后固定2 h，依次用50%、70%、90%、100%的丙酮脫水，包埋、染色后，用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬體的數(shù)量。

1.7 qRT-PCR檢測PDRG1的mRNA水平

TRIzol試劑提取組織樣本或細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA濃度。使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；使用SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。使用StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。所用引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物

1.8 免疫印跡檢測PDRG1、LC3A/B 、β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白

RIPA裂解液提取組織樣本或者細(xì)胞中的總蛋白，通過BCA法測定總蛋白含量，并將配對的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。樣品經(jīng)變性后，采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，之后將PVDF膜分別與以下抗體在4℃孵育過夜：PDRG1抗體（1∶1 000）、LC3A/B 抗體（1∶1 000）、β-catenin抗體（1∶1 000）、c-Myc抗體（1∶1 000）、cyclin D1抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶2 000）。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，并與IgG-HRP抗體（1∶4 000）孵育1 h，TBST洗滌3次。最后顯影曝光，Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，正態(tài)分布數(shù)據(jù)資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，率的比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PDRG1在口腔癌組織和口腔癌細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，PDRG1 mRNA在口腔癌組織中表達(dá)增加（P<0.01，圖1A）；與NHOK組細(xì)胞相比，PDRG1 mRNA在口腔癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯增加（P<0.01，圖1C）。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，口腔癌組織中PDRG1蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P<0.01，圖1B）；與NHOK組相比，PDRG1蛋白在口腔癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01），其中SCC-15細(xì)胞中PDRG1的表達(dá)水平最高（P<0.01，圖1D），因此后續(xù)實驗選擇SCC-15細(xì)胞。

2.2 在SCC-15細(xì)胞中沉默PDRG1

與shNC組相比，shPDRG1組SCC-15細(xì)胞中PDRG1 mRNA的表達(dá)顯著下降（P<0.01，圖1A），PDRG1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P<0.01，圖1B）。

圖1 PDRG1在口腔癌組織和口腔癌細(xì)胞系中的表達(dá)

圖2 沉默PDRG1在SCC-15細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 沉默PDRG1對SCC-15細(xì)胞增殖能力的影響

細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果顯示（圖3）：與shNC組相比，shPDRG1組SCC-15細(xì)胞的集落數(shù)目明顯減少（P<0.01）。

圖3 沉默PDRG1對SCC-15細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 沉默PDRG1對SCC-15細(xì)胞自噬的影響

免疫印跡結(jié)果顯示（圖4A）：與shNC組相比，shPDRG1組細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例減少（P<0.01）；電鏡結(jié)果顯示（圖4B）：與shNC組比較，shPDRG1組細(xì)胞中自噬體數(shù)量減少。

圖4 沉默PDRG1對SCC-15細(xì)胞自噬的影響

2.5 沉默PDRG1對SCC-15細(xì)胞凋亡率的影響

細(xì)胞流式術(shù)結(jié)果顯示（圖5）：與shNC組相比，shPDRG1組SCC-15細(xì)胞的凋亡率明顯提高（P<0.01）。

2.6 沉默PDRG1對Wnt/β-catenin信號途徑的影響

免疫印跡結(jié)果顯示，與shNC相比，shPDRG1組SCC-15細(xì)胞中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P<0.01）（圖5）。

圖5 沉默PDRG1對SCC-15細(xì)胞凋亡率的影響

圖6 沉默PDRG1對Wnt/β-catenin信號途徑的影響

3 討論

口腔癌是頭頸部腫瘤中常見的惡性腫瘤，是口腔內(nèi)發(fā)生的惡性腫瘤之一，也是預(yù)后差的惡性腫瘤之一[6]。盡管口腔癌的預(yù)后和治療方面取得了巨大進(jìn)步，但該癌癥的5年生存率仍低于63%[7]。研究表明，男性患口腔癌的幾率比女性高，其原因可能是男性吸煙或酗酒史的人群所占的百分比較高。目前，針對口腔癌的治療方法與其他癌癥類似，主要包括手術(shù)切除、放療、化學(xué)療法或中藥治療，但是尚未達(dá)到令人滿意的療效。因此，迫切需要找到新的鑒定口腔癌標(biāo)志物并探索口腔癌治療的新策略。

PDRG1位于20號染色體的長臂上，編碼存在于細(xì)胞質(zhì)中不同亞細(xì)胞區(qū)室的133個氨基酸的蛋白質(zhì)[8]。研究表明，PDRG1在多種惡性腫瘤中的表達(dá)均高于正常組織，比如結(jié)腸癌、直腸癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和子宮癌等[4]。Zhang等[9]研究表明PDRG1基因沉默可能通過激活A(yù)TM/p53途徑抑制胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。Wang等[8]研究表明，miR-214可以下調(diào)癌基因PDRG1從而在膀胱癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用，并為膀胱癌的預(yù)后和治療干預(yù)提供了新指標(biāo)。我們的實驗數(shù)據(jù)表明，PDRG1在口腔癌組織和口腔癌細(xì)胞系中高表達(dá)，接著我們構(gòu)建了PDRG1低表達(dá)的穩(wěn)定SCC-15細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)沉默PDRG1使SCC-15細(xì)胞的增殖能力下降，表明沉默PDRG1可抑制SCC-15細(xì)胞的活力。

自噬是一個吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，借此實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[10]。Lin等[11]研究表明，熊果酸能抑制自噬、誘導(dǎo)凋亡和抑制遷移從而在口腔癌細(xì)胞中發(fā)揮抗增殖作用；Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，乙酰紫草素通過誘導(dǎo)自噬、程序性細(xì)胞死亡和靶向m-TOR/PI3K/Akt信號通路來抑制順鉑耐藥的口腔癌細(xì)胞的體內(nèi)外腫瘤發(fā)生。然而PDRG1在口腔癌細(xì)胞自噬中研究甚少，因此，本實驗進(jìn)行了進(jìn)一步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默PDRG1明顯抑制SCC-15細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)比例的下調(diào)，減少SCC-15細(xì)胞中自噬體數(shù)量，表明沉默PDRG1對SCC-15細(xì)胞自噬有抑制作用。

細(xì)胞凋亡也稱為"固縮壞死"、"程序性細(xì)胞死亡"或"細(xì)胞自殺"，是由基因介導(dǎo)的一系列變化[13]。凋亡最初由特征性的形態(tài)變化來確定，包括：DNA的程序性降解、染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞縮小和碎裂。它可以是生理性的，或由化療藥物及放射誘發(fā)。Li等[14]研究表明，沉默miR-155可上調(diào)Foxo3a表達(dá)，從而抑制口腔癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)口腔癌細(xì)胞中的DDP敏感性。因此，本實驗也檢測了沉默PDRG1對SCC-15細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果表明，沉默PDRG1明顯促進(jìn)SCC-15細(xì)胞的凋亡率，但是具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Wnt/β-catenin信號通路是一種高度保守的分子機(jī)制，在形態(tài)發(fā)生、基因轉(zhuǎn)錄、分化和增殖的發(fā)育中起關(guān)鍵作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路在各種類型的腫瘤和癌癥中均被異常激活[16]，可能通過調(diào)節(jié)其下游靶標(biāo)如cyclin D1，c-Myc，GSK-3等因子參與調(diào)控。此外，Wnt/β-catenin信號通路活性的改變與細(xì)胞自噬和凋亡有關(guān)[17]。近幾年在口腔癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)[18]。但是PDRG1是否通過Wnt/β-catenin信號通路在口腔癌細(xì)胞中發(fā)揮作用尚未報道。因此，本研究結(jié)果顯示，沉默PDRG1使SCC-15細(xì)胞中的β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白水平降低。上述結(jié)果表明，PDRG1可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路在口腔癌中發(fā)揮作用。

綜上所述，PDRG1在口腔癌組織和口腔癌細(xì)胞系中高表達(dá)。沉默PDRG1可以抑制SCC-15細(xì)胞的增殖與自噬，并促進(jìn)SCC-15細(xì)胞凋亡，而且抑制Wnt/β-catenin信號途徑的激活。因此，PDRG1具有作為口腔癌診斷生物標(biāo)志物的潛在價值，也可能成為口腔癌治療的希望靶標(biāo)。