丹參川芎嗪與硫酸鎂對妊娠期高血壓疾病大鼠的治療效果及對胎盤組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α、可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1表達(dá)的影響*

李光苗 陳 飛 王 燕

（邢臺市婦幼保健院婦產(chǎn)科，邢臺 054000）

妊娠期高血壓疾?。╤ypertensive disorders complicating pregnancy，HDCP）是孕婦妊娠時(shí)出現(xiàn)的一種常見疾病，其病情與新生兒不良結(jié)局發(fā)生率呈正相關(guān)，可影響胎兒及新生兒生長發(fā)育，嚴(yán)重者會出現(xiàn)死胎、早產(chǎn)、窒息等合并癥[1]。HDCP隨著時(shí)間推移，孕婦胎盤內(nèi)的絨毛血管結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，絨毛纖維化增多、數(shù)量下降，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)血管閉塞，使得胎盤血流量減少，進(jìn)一步影響胎兒的發(fā)育[2-3]。目前研究表明缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1（soluble fms-like tyrosine kinase receptor 1，sFLT-1）均參與HDCP的發(fā)生，HIF-1α是缺氧狀態(tài)下細(xì)胞分泌的核蛋白，與相關(guān)靶基因VEGF等結(jié)合后可促進(jìn)血管新生，sFLT-1則與其功能相反，可抑制VEGF信號通路活性，導(dǎo)致血管新生障礙，胎盤絨毛完整性、通透性受到影響[4-5]。HDCP臨床治療中主要以硫酸鎂為主，但硫酸鎂毒性較大[6]，因此需要尋找替代硫酸鎂的新型治療藥。丹參川芎嗪注射液具有多種藥理作用[7]，但關(guān)于丹參川芎嗪注射液對HDCP大鼠胎盤組織的作用研究較少。由此，本研究探討丹參川芎嗪與硫酸鎂對HDCP大鼠的治療效果及對胎盤組織中HIF-1α、sFLT-1的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RT-PCR試劑盒（上海 優(yōu)予）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RPMI-1640培養(yǎng)基（上海 一研）。Wistar大鼠雌性80只，雄性40只，體質(zhì)量225 g±26 g，購自南京 CAVENS生物技術(shù)有限公司，11～13周齡。

1.2 HDCP大鼠模型建立及分組

將135只大鼠于干凈環(huán)境下飼養(yǎng)，于大鼠發(fā)情期時(shí)將2只雌鼠與1只雄鼠放于同一籠內(nèi)過夜，第2天清晨發(fā)現(xiàn)陰道栓脫落大鼠記為妊娠第1天，共計(jì)有41只大鼠妊娠成功，妊娠第2天對其中30只大鼠尾靜脈注射一氧化氮合成酶抑制劑（L-NAME）建立妊娠期高血壓大鼠模型，注射持續(xù)至妊娠14 d，期間注射劑量125 mg/kg，1次/日。

將30只HDCP大鼠分為HDCP組、硫酸鎂組，丹參組，每組10只，其余11只作為對照組。HDCP組、對照組大鼠于妊娠第17天于尾靜脈分別腹腔注射5.0 mg·kg-1·d-1生理鹽水、硫酸鎂組大鼠腹腔注射60 mg·kg-1·d-1硫酸鎂，丹參組大鼠腹腔注射10 mg·kg-1·d-1的丹參川芎嗪注射液，持續(xù)至妊娠第19天，記錄3組大鼠妊娠第14天、19天動脈收縮壓及24 h尿蛋白測量結(jié)果，所有大鼠在12～17 d后均表現(xiàn)為收縮壓及24 h尿蛋白升高，大鼠建模后均給予藥物治療。

1.3 胎鼠發(fā)育情況

將飼養(yǎng)至第21天的各組大鼠給予乙醚麻醉，剖宮將胎鼠取出，記錄胎鼠的身長，并對胎鼠、胎盤質(zhì)量和死胎的情況進(jìn)行記錄。

1.4 H-E染色觀察胎盤病理形態(tài)

取大鼠胎盤組織，甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后切片4 μm，中性樹膠封片，蘇木精和伊紅染色液分別復(fù)染6～8 min、10 s，于顯微鏡下觀察各組胎盤組織結(jié)構(gòu)改變情況。

1.5 RT-PCR檢測HIF-1α、sFLT-1 mRNA表達(dá)變化

將胰蛋白酶加入大鼠胎盤組織中進(jìn)行消化反應(yīng)，PBS沖洗，然后滴入0.9%NaCl溶液，采用TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，按試劑盒說明書操作。用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對HIF-1α、sFLT-1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，引物序列見表1，內(nèi)參采用β-actin。PCR反應(yīng)條件為60℃，10 min、95℃、72℃，各 30 s、95℃，5 min，循環(huán)次數(shù)40，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用相對定量2-ΔΔCT計(jì)算HIF-1α、sFLT-1表達(dá)。

表1 引物序列

1.6 免疫印跡檢測HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)

取胎盤組織，PBS溶液洗滌后，切碎處理加入1 mL裂解液，提取組織中總蛋白測定濃度，在100 V SDS-PAGE對總蛋白進(jìn)行電泳，蛋白樣品采用Bradford法定量，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用10%的山羊血清，封閉0.5 h，分別加入一抗HIF-1α、sFLT-1（1∶2 000）。4℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h（1∶2 000），β-actin 作內(nèi)參，TBST沖洗后，ECL顯色，BOX型凝膠成像系統(tǒng)檢測掃描，檢測HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析或χ2檢驗(yàn)，組間兩兩比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓、尿蛋白比較

與對照組相比，其余3組大鼠血壓、尿蛋白值均升高，說明HDCP建模成功；與HDCP組相比，硫酸鎂組、丹參組大鼠血壓、尿蛋白值下降明顯（P<0.05），硫酸鎂組與丹參組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

表2 各組大鼠血壓和尿蛋白比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠血壓和尿蛋白比較（n=10，±s）

*P<0.05 vs對照組；△P<0.05 vs HDCP組；#P<0.05 vs硫酸鎂組；▲P<0.05 vs同組治療前

組別 血壓（mmHg） 尿蛋白（mg/mL）干預(yù)前 干預(yù)后 干預(yù)前 干預(yù)后對照組 101.77±3.60 101.87±3.37 167.67±12.82 169.06±18.02 HDCP組 143.03±3.84* 142.65±3.42* 630.41±13.11* 628.74±22.21*硫酸鎂組 142.91±3.77* 126.32±3.48*△▲ 629.35±12.75* 449.59±17.23*△▲丹參組 143.06±3.57* 120.61±3.51*△#▲ 629.92±13.03* 428.37±16.39*△#▲

2.2 各組胎鼠發(fā)育情況

對照組胎鼠、胎盤質(zhì)量均高于HDCP組、丹參組（P<0.05）；與HDCP組比較，硫酸鎂組、丹參組胎鼠及胎盤質(zhì)量明顯增加（P<0.05）；對照組無死胎，硫酸鎂組大鼠死胎率為10.5%（9/85），丹參組為6.98%（6/86），均明顯低于HDCP組的19.05%（16/84）（P<0.05）（表3）。

表3 各組胎鼠發(fā)育情況（n=10，±s，g）

表3 各組胎鼠發(fā)育情況（n=10，±s，g）

*P<0.05 vs對照組；△P<0.05 vs HDCP組；#P<0.05 vs硫酸鎂組

組別 胎鼠質(zhì)量 胎盤質(zhì)量對照組 4.55±0.45 0.63±0.10 HDCP組 2.81±0.33* 0.42±0.08*硫酸鎂組 4.33±0.36*△ 0.50±0.09*△丹參組 4.45±0.32*△# 0.58±0.08*△#

2.3 各組大鼠胎盤組織形態(tài)變化

H-E染色結(jié)果顯示，對照組胎盤結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞完整；HDCP組出現(xiàn)胎盤結(jié)構(gòu)萎縮，絨毛數(shù)目顯著減少，有壞死的絨毛纖維素樣出現(xiàn)，細(xì)胞異常增殖；丹參組胎盤組織結(jié)構(gòu)異常減輕，壞死絨毛纖維素樣減少，且優(yōu)于硫酸鎂組（圖1）。

圖1 各組大鼠胎盤組織形態(tài)變化，H-E染色，標(biāo)尺=50 μm

2.4 各組胎盤組織HIF-1α、sFLT-1 mRNA水平變化

RT-PCR法檢測顯示，與對照組比較，HDCP組胎盤組織HIF-1α、sFLT-1 mRNA水平明顯升高（P<0.05）；與HDCP組比較，硫酸鎂組及丹參組HIF-1α、sFLT-1 mRNA水平明顯下降（P<0.05），且丹參組低于硫酸鎂組（P<0.05，圖2）。

圖2 各組大鼠胎盤組織HIF-1α、sFLT-1 mRNA表達(dá)水平變化

2.5 各組胎盤組織HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)變化

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，HDCP組胎盤組織HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與HDCP組比較，硫酸鎂組及丹參組HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.05），且丹參組低于硫酸鎂組（P<0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠胎盤組織HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)水平變化

3 討論

HDCP是導(dǎo)致孕婦與圍產(chǎn)兒死亡率較高的主要原因之一，其病理表現(xiàn)為水腫、血壓升高、蛋白尿等[8]。目前HDCP的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，國內(nèi)外相關(guān)的研究數(shù)據(jù)也存在差異。因此，產(chǎn)前準(zhǔn)確判斷孕婦是否患有HDCP，可降低孕產(chǎn)婦和新生兒患病概率[9]。目前尚無確切有效的方法治療HDCP，降壓藥物可以有效降低孕婦血壓，但降壓藥物均可通過胎盤被胎兒吸收，影響胎兒妊娠結(jié)局[10-11]。丹參川芎嗪注射液中含有丹參、鹽酸川芎嗪等，均具有明顯降壓、抗炎、抗纖維化作用，近年來在治療HDCP中得到了廣泛應(yīng)用[12]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，其余3組大鼠血壓、尿蛋白值均升高，說明HDCP建模成功。與HDCP組相比，硫酸鎂組及丹參組大鼠血壓、尿蛋白值下降明顯。對照組胎鼠、胎盤質(zhì)量均高于HDCP組、丹參組，與HDCP組比較，硫酸鎂組、丹參組胎鼠及胎盤質(zhì)量明顯增加，且死胎率明顯降低。臨床常用硫酸鎂改善患者血壓，雖然其可以有效降低孕婦血壓，但其藥物成分可通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，對胎兒的發(fā)育產(chǎn)生一定的危害[13-14]。有研究證實(shí)，HDCP患者胎盤功能的異常變化，胎盤血管呈異常收縮痙攣狀態(tài)，對胎兒的發(fā)育造成極大影響，嚴(yán)重時(shí)可能會出現(xiàn)胎死宮內(nèi)[15]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，丹參川芎嗪注射液中的川芎嗪可影響胎盤血流量增加，對影響胎盤發(fā)育的血栓烷A分泌有明顯的抑制作用[16]。川芎嗪是一種從川芎根莖分離的生物堿類，以往研究證實(shí)能夠改善心腦血管疾病，對胎盤組織血流動力學(xué)產(chǎn)生影響，HDCP導(dǎo)致的胎盤組織血氧供應(yīng)不足，川芎嗪能夠滋養(yǎng)細(xì)胞基膜，增加絨毛血管基膜厚度和胎盤組織血流灌注，而丹參是擴(kuò)張血管、促進(jìn)血液循環(huán)的良藥，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性，有利于胎盤發(fā)育，同時(shí)對纖維蛋白溶解有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，改善胎盤血流狀態(tài)及微循環(huán)障礙[17]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相符。

本研究對照組胎盤結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞完整，HDCP組出現(xiàn)胎盤結(jié)構(gòu)萎縮，絨毛數(shù)目顯著減少，有壞死的絨毛纖維素樣出現(xiàn)，細(xì)胞異常增殖，丹參組胎盤結(jié)構(gòu)異常減輕，壞死絨毛纖維素樣減少，且優(yōu)于硫酸鎂組。與對照組比較，HDCP組胎盤組織HIF-1α、sFLT-1 mRNA及蛋白水平明顯升高，與HDCP組比較，硫酸鎂組、丹參組HIF-1α、sFLT-1 mRNA及蛋白水平明顯下降，且丹參組低于硫酸鎂組。有研究證實(shí)，丹參川芎嗪與硫酸鎂對HDCP的治療兩者同樣具有降低大鼠血壓、尿蛋白的作用，改善HDCP造成的胎盤、胎兒發(fā)育異常，降低胎鼠死亡率低，但丹參川芎嗪為中藥成分，其安全性更高[18-19]。有學(xué)者認(rèn)為，VEGF水平下降是血管內(nèi)皮功能障礙及妊娠期血壓升高的重要原因，HIF-1α可與VEGF相關(guān)靶基因結(jié)合后血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，胎盤發(fā)育遲緩，影響新生兒的健康[20]。薛峰等[21]通過對妊娠高血壓孕產(chǎn)婦及健康孕產(chǎn)婦對比研究表明，妊娠高血壓孕產(chǎn)婦血清中sFLT-1、胎盤生長因子（PLGF）水平及sFLT-1/PLGF比值均高于健康孕產(chǎn)婦，提示sFLT-1、PLGF參與妊娠高血壓的發(fā)生及發(fā)展。相關(guān)研究證實(shí)，sFLT-1在血管中新分支生成、重建中扮演重要角色，HIF-1α水平升高造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，參與胎盤組織的結(jié)構(gòu)改變，丹參川芎嗪降壓機(jī)制可能與其擴(kuò)張血管、抑制胎盤組織HIF-1α表達(dá)，同時(shí)具有利尿的功效有關(guān)[22]。

綜上所述，丹參川芎嗪與硫酸鎂均對HDCP大鼠有明顯治療作用，胎鼠妊娠結(jié)局較好，且丹參川芎嗪效果更佳，其作用機(jī)制可能與降低大鼠胎盤HIF-1α、sFLT-1表達(dá)有關(guān)。