嗜酸性粒細胞通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷

李 紅 李雅慧

（1 寧夏吳忠市人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，全科醫(yī)學(xué)科，吳忠 751100；2 解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四二醫(yī)院內(nèi)分泌風(fēng)濕免疫科，銀川 750004）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是急性呼吸窘迫綜合征的早期表現(xiàn)，病死率高達30%～40%，在老年患者中甚至高達60%[1]。目前認為，巨噬細胞是參與ALI進展的關(guān)鍵效應(yīng)細胞，其對環(huán)境刺激表現(xiàn)出高度的可塑性和異質(zhì)性，并可誘導(dǎo)分化為2種不同的極化狀態(tài)：典型激活型（M1型）和交替激活型（M2型）[2]。M1巨噬細胞通過分泌各種細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6和IL-12發(fā)揮促炎作用；相反，M2型巨噬細胞則產(chǎn)生抗炎細胞因子如IL-10和IL-13[3]。調(diào)節(jié)巨噬細胞極化會影響ALI的炎癥反應(yīng)，但其機制復(fù)雜。嗜酸性粒細胞（eosinophil，Eos）通常被認為是輔助性T細胞2效應(yīng)細胞。研究顯示，用IL-4和IL-10刺激的M2型巨噬細胞可以誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞浸潤[4]。脂肪組織嗜酸性粒細胞可通過IL-4和IL-13加速M2型巨噬細胞的極化來減少炎癥反應(yīng)[5]。最近一項臨床評估表明嗜酸性粒細胞在ALI中具有潛在的抗炎作用[6]。為了確定嗜酸性粒細胞在ALI中的作用，本研究觀察體外嗜酸性粒細胞對巨噬細胞極化的影響，以及體內(nèi)注射嗜酸性粒細胞是否能改善ALI及其相關(guān)機制，旨在為ALI中嗜酸性粒細胞和巨噬細胞極化之間的相互作用提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物

Balb/c雄性小鼠（6周齡，體質(zhì)量22～25 g）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（SCXK（京）2016-0011）。將小鼠飼養(yǎng)在聚碳酸酯籠中，每籠5只，在無病原體和溫度控制（25℃）的環(huán)境中進行嚴格的12 h光照/黑暗循環(huán)飼養(yǎng)，自由進食和水。

1.2 嗜酸性粒細胞的體外分離和擴增

參照文獻[7]方法，從骨髓中分離并擴增嗜酸性粒細胞。取BALB/c小鼠股骨和脛骨，然后用10 mL的RPMI1640培養(yǎng)基沖洗以收集骨髓細胞。裂解紅細胞后，骨髓細胞在含有100 ng/mL FLT3配體（以色列ProSpec公司）和100 ng/mL小鼠干細胞因子（以色列ProSpec公司）的改良RPMI1640培養(yǎng)基中重新懸浮。第4天，加入10 ng/mL重組小鼠IL-5（美國BioVision公司），每隔2 d用新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)基。第10天采集細胞，通過FAS-Calibur流式細胞儀（美國BD Biosciences公司）鑒定嗜酸性粒細胞。

1.3 巨噬細胞與嗜酸性粒細胞共培養(yǎng)

小鼠腹腔注射3%無菌硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher Scientific公司），3 d后頸椎脫臼法處死小鼠。在無菌條件下打開腹腔，并用15 mL預(yù)冷的無血清RMPI1640沖洗。通過離心收集腹膜灌洗液中的細胞，并將其重懸在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素（美國Gibco公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司）中。將細胞以1×106/孔的密度接種在12孔板中，并在37℃下孵育2 h，去除非貼壁細胞，貼壁細胞融合率達到80%時，以1×106/mL的密度接種在48孔板中，用5 μg/mL LPS和100 U/mL重組小鼠γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）（美國Bio-Basic公司）刺激3 h，然后與不同比例的嗜酸性粒細胞（1∶5、1∶10、1∶20）共培養(yǎng)24 h，測定巨噬細胞極化。

1.4 實時定量PCR檢測促炎及抗炎因子的mRNA表達

用RNA分離試劑盒（美國Invitrogen公司）提取肺組織或細胞總RNA，用cDNA合成試劑盒（日本TaKaRa公司）在37℃下反轉(zhuǎn)錄15 min。然后，使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）和ABI 7500 PCR系統(tǒng)（美國Life Technologies公司）確定靶基因的表達水平。管家基因GAPDH用作內(nèi)部對照。IL-6基因：正向序列 為5'-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3'，反向序列為5'- TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3'；TNF-α基因：正向序列為5'-AAGCCTGTAGCCCA CGTCGTA-3'，反向序列為5'-GGCACCACTAGT TGGTTGTCTTTG-3'；IL-10基因：正向序列為5'-G CTCTTACTGACTGGCATGAG-3'，反向序列為5'-C GCAGCTCTAGGAGCATGTG-3'；重組人精氨酸酶1、（recombinant arginase 1，Arg1）基因：正向序列為5'-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3'，反向序列為5'-GGAGCTGTCATTAGGGACATCA-3'；iNOS基因：正向序列為5'-CACCAAGCTGAACTTGAGC GA-3'，反向序列為5'-CCATAGGAAAAGACTGCA CCGA-3'；β-actin基因：正向序列為5'-AGTGTGA CGTTGACATCCGT-3'，反向序列為5'-GCAGCT CAGTAACAGTCCGC-3'。使用2-ΔΔCt方法計算靶基因的相對表達值。

1.5 免疫印跡檢測巨噬細胞中過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxidase proliferator-activated receptor γ，PPARγ）蛋白的表達

用冰冷的RIPA裂解緩沖液提取來自肺勻漿和細胞的總蛋白質(zhì)，并使用BCA試劑盒（美國Thermo Fisher公司）測定蛋白質(zhì)含量。通過凝膠電泳將蛋白帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（美國Millipore公司）上，并在4℃下用5%脫脂乳封閉過夜。然后將膜與稀釋的抗PPARγ（1∶500，美國Santa Cruz Biotechnology公司）和抗β-actin抗體（1∶10 000，上海康成生物工程有限公司）在室溫下放置1 h，然后再加入HRP偶聯(lián)的二抗 （1∶2 000，美國Santa Cruz Biotechnology公司），室溫下放置40 min。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白質(zhì)表達水平。

1.6 siRNA轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞

在24孔板中培養(yǎng)的巨噬細胞融合度達到50%時，用含干擾對照RNA（si-NC）或PPARγ siRNA（si-PPARγ）（上海GenePharma公司）轉(zhuǎn)染24 h后，再用5 μg/mL 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和100 U/mL重組小鼠IFN-γ刺激3 h，然后與嗜酸性粒細胞（1∶20）共培養(yǎng)24 h，測定巨噬細胞極化。

1.7 動物分組和給藥治療

將60只Balb/c小鼠隨機分為對照組、ALI組和ALI+Eos組，每組20只。參照文獻[8]方法，ALI組通過氣管內(nèi)注射10 mg/kg LPS誘導(dǎo)ALI；對照組尾靜脈給予相同體積的PBS緩沖液；ALI+Eos組給予尾靜脈注射1×107個嗜酸性粒細胞，監(jiān)測動物7 d的存活情況。在LPS注射后3 h和24 h處死動物，H-E染色評估左肺損傷程度，收集右肺檢測促炎和抗炎細胞因子mRNA水平。

1.8 肺組織病理學(xué)觀察

將石蠟包埋的肺組織切成5 μm的厚度，用H-E染色，中性樹脂封固，并在BX41顯微鏡（日本Olympus公司）下評估肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。評分內(nèi)容包括間質(zhì)水腫、肺泡水腫、中性粒細胞浸潤和肺泡充血。根據(jù)嚴重程度，評分范圍為0～4分：0分為無病變或非常輕微；1分為輕度病變；2分為中度病變；3分為重度病變；4分為極重度病變。以4項指標的總分平均值作為肺損傷評分。

1.9 流式細胞術(shù)檢測肺泡巨噬細胞中iNOS和CD206的百分比

Acutase（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司）消化肺泡巨噬細胞，制成單細胞懸液，再懸浮在染色緩沖液（美國BD Biosciences公司）中。隨后，加入FcR阻斷試劑（美國Miltenyi公司）以提高抗體的特異性。細胞首先用表面標記物（F4/80）染色，用固定/滲透緩沖液（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司）固定和滲透，然后用APC偶聯(lián)的iNOS（M1型標志物）和PE偶聯(lián)的CD206（M2型標志物）（美國Biolegend公司）染色，通過流式細胞儀進行分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用±s表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間使用Bonferroni事后檢驗進行成對比較。計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用對數(shù)秩檢驗分析不同組的存活率。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 嗜酸性粒細胞對巨噬細胞極化的影響

與嗜酸性粒細胞共培養(yǎng)后，用LPS+IFN-γ刺激巨噬細胞，其TNF-α和IL-6 mRNA水平呈劑量依賴性降低，而IL-10 mRNA水平呈劑量依賴性增加（圖1A）。巨噬細胞與嗜酸性粒細胞共培養(yǎng)后，M1型巨噬細胞標志基因iNOS表達增加，M2巨噬細胞標志基因Arg1表達減少，且呈劑量依賴性逆轉(zhuǎn)（圖1B），提示嗜酸性粒細胞促進巨噬細胞向M2表型分化。

圖1 嗜酸性粒細胞體外對巨噬細胞極化的影響

2.2 PPARγ通路參與嗜酸性粒細胞介導(dǎo)的巨噬細胞極化

免疫印跡檢測顯示，嗜酸性粒細胞增加巨噬細胞中的PPARγ活性（圖2A），呈劑量依賴性；且嗜酸性粒細胞顯著增加了LPS+IFN-γ刺激下PPARγ的活性（圖2B）。轉(zhuǎn)染si-PPARγ抑制了嗜酸性粒細胞對巨噬細胞向M2表型分化的促進作用 （圖2C）。

圖2 PPARγ通路參與嗜酸性粒細胞介導(dǎo)的巨噬細胞極化

2.3 嗜酸性粒細胞對LPS致炎性小鼠ALI的影響

7 d存活率監(jiān)測結(jié)果顯示，靜脈注射嗜酸性粒細胞顯著提高了ALI小鼠的存活率（P<0.01）（圖3A）。注射LPS后3 h和24 h，H-E染色顯示小鼠氣管內(nèi)出現(xiàn)嚴重的肺水腫和炎癥浸潤，隨著時間推移組織學(xué)評分明顯增加。嗜酸性粒細胞干預(yù)可顯著改善小鼠的肺損傷，減少組織損傷（圖3B、3C）。

圖3 嗜酸性粒細胞對LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的死亡率和肺損傷的影響

2.4 嗜酸性粒細胞對ALI小鼠肺巨噬細胞極化的影響

在3 h和24 h，LPS增加了肺部促炎性細胞因子IL-6和TNF-α mRNA水平。嗜酸性粒細胞干預(yù)可逆轉(zhuǎn)上述作用。此外，LPS也增加了肺組織中抗炎細胞因子IL-10 mRNA水平，嗜酸性粒細胞干預(yù)則進一步增加了IL-10 mRNA的水平（圖4A）。流式細胞術(shù)分析顯示，LPS增加了肺泡M1型巨噬細胞iNOS的百分比和M2巨噬細胞標志基因CD206的百分比，嗜酸性粒細胞干預(yù)則進一步增加了肺泡CD206的百分比，而iNOS的百分比明顯降低（圖4B、4C）。此外，免疫印跡分析顯示，ALI+Eos組肺組織中的PPAR γ活性顯著高于ALI組（P<0.01）（圖4D）。

圖4 嗜酸性粒細胞對急性肺損傷小鼠肺巨噬細胞極化的影響

3 討論

ALI與高死亡率有關(guān)，尤其是在老年患者中，它涉及由激活的細胞和體液免疫誘導(dǎo)的不受控制的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，炎癥細胞和細胞因子的積累導(dǎo)致毛細血管內(nèi)皮和肺泡上皮屏障的破壞，并導(dǎo)致隨后的肺水腫和缺氧[9]。盡管ALI的危險因素多種多樣，但抑制肺部炎癥是這一危重綜合征的常見治療策略[10]。調(diào)節(jié)驅(qū)動巨噬細胞極化的轉(zhuǎn)錄子的活性可能有助于減輕ALI患者的炎癥和改善預(yù)后，因為M1和M2型巨噬細胞之間的平衡影響固有免疫反應(yīng)的持續(xù)時間和大小，從而影響抗病原體反應(yīng)和組織損傷[11]。近年來，大量研究表明嗜酸性粒細胞在非過敏性疾病組織中蓄積，并參與腫瘤的發(fā)生[12]、腸道炎癥疾病[13]和造血干細胞穩(wěn)態(tài)[14]。本研究體外實驗表明，嗜酸性粒細胞可能通過促進PPAR-γ的表達，使巨噬細胞從M1型向M2型極化轉(zhuǎn)變，增強抗炎遞質(zhì)的表達，從而為調(diào)節(jié)巨噬細胞極化治療ALI提供一種潛在策略。

嗜酸性粒細胞通常認為是寄生蟲感染或過敏性炎癥的終端效應(yīng)細胞，但越來越多的證據(jù)表明其在各種免疫反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用[15]。據(jù)報道，嗜酸性粒細胞與樹突狀細胞相互作用，協(xié)同促進過敏性氣道的輔助性T細胞2免疫反應(yīng)[16]。值得注意的是，最近的一項臨床研究表明，ALI患者的肺中嗜酸性粒細胞數(shù)量增加，表明嗜酸性粒細胞可能在ALI中起著保護作用[6]。此外，嗜酸性粒細胞也參與促進損傷后組織修復(fù)的過程[17]。相反，嗜酸性粒細胞占優(yōu)勢的疾病患者，如哮喘，有較高的感染風(fēng)險[18]。因此，嗜酸性粒細胞在ALI發(fā)病機制中的最終作用及其分子機制有待進一步研究。本研究采用在氣管內(nèi)注射LPS誘導(dǎo)ALI小鼠模型，研究結(jié)果顯示靜脈注射嗜酸性粒細胞可以保護小鼠免受LPS誘導(dǎo)的死亡。ALI組大部分死亡的小鼠均處于ALI的早期階段，這可能是由于LPS激活TLR4信號通路產(chǎn)生大量炎癥遞質(zhì)，導(dǎo)致嚴重的炎癥浸潤促進肺組織損傷。通過mRNA分析證實，單次LPS誘導(dǎo)后24 h內(nèi)，各種炎癥因子的水平發(fā)生變化，表明動物處于急性炎癥的早期“細胞因子風(fēng)暴”階段。嗜酸性粒細胞下調(diào)了肺部的促炎基因（TNF-α和IL-6）表達，上調(diào)了抗炎基因（IL-10）表達，提示嗜酸性粒細胞抑制了LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥。進一步流式細胞術(shù)分析顯示，給予嗜酸性粒細胞顯著提高了ALI小鼠肺中M2型巨噬細胞的百分比。提示嗜酸性粒細胞可以通過促進巨噬細胞由M1型轉(zhuǎn)化為M2抗炎表型來減輕LPS誘導(dǎo)的ALI。

PPARγ在炎癥調(diào)節(jié)和膿毒癥進展中扮演著重要角色[19]。有研究表明，活化PPARγ可顯著降低膿毒癥炎癥遞質(zhì)的表達和組織損傷[20]。也有研究表明，激活PPARγ可顯著促進巨噬細胞向M2表型極化，從而抑制炎癥反應(yīng)[21]。因此，PPARγ可能有助于嗜酸性粒細胞介導(dǎo)其對早期ALI的保護作用。在本研究的體外實驗中，嗜酸性粒細胞顯著增加了LPS+IFN-γ刺激下PPARγ的活性，并且體內(nèi)實驗顯示嗜酸性粒細胞增強了ALI大鼠肺組織中PPARγ的活性。因此，嗜酸性粒細胞促進巨噬細胞的M2極化可能與PPARγ高表達相關(guān)，而PPARγ可直接作用于NF-κB以逆轉(zhuǎn)M1/M2極化[21]。

綜上所述，本研究揭示了嗜酸性粒細胞通過激活PPARγ信號通路，顯著增強了巨噬細胞M2極化，并改善了LPS誘導(dǎo)的ALI。這些研究結(jié)果可能為ALI的診斷和干預(yù)提供新的方法。