響應(yīng)面法優(yōu)化大薊根總黃酮純化工藝及其純化前、后的抑菌活性比較

牛鶴麗

（白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林白城 137000）

大薊（Cirsium japonicumDC.）為菊科薊族薊屬多年生宿根草本植物，具有藥食兩用特性，富含黃酮類、多酚類、咖啡酸酯類等活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂及增強(qiáng)機(jī)體免疫等活性[1?2]，常作為保健食品的主要成分。

黃酮類物質(zhì)指多個含有酚羥基的苯環(huán)直接連接形成的一系列化合物，作為大薊的重要生物活性成分之一，對其提取和生物活性的研究較多。其中，馬勤[3]通過動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大薊根部黃酮提取物具有良好的抗氧化、抗炎活性及護(hù)肝作用；Liu 等[4]從大薊中分離出兩種黃酮類化合物柳穿魚葉苷和柳穿魚黃素，并以H22 和S180 小鼠為腫瘤模型，結(jié)果表明大薊總黃酮和兩個黃酮類化合物均可抑制癌細(xì)胞的生長；Lee 等[5]研究表明大薊葉粗提物可以劑量依賴性抑制LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的亞硝酸鹽生成；管春平等[6]采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化乙醇浸提大薊總黃酮的工藝條件，并發(fā)現(xiàn)其對羥基自由基的清除效果優(yōu)于蘆丁和二丁基羥基甲苯（BHT），然而該黃酮提取物中仍含有鞣質(zhì)、色素等雜質(zhì)，可能影響其活性效果。由于目前大薊根黃酮提取物的純化及抑菌活性研究鮮有提及，而大孔樹脂吸附已被廣泛用于黃酮類物質(zhì)的純化[7?9]，因此本研究利用其具有機(jī)械篩分與化學(xué)吸附的特點(diǎn)，探討大孔樹脂于不同純化工藝條件下，對產(chǎn)物中黃酮化合物的回收率影響，同時比較純化前、后產(chǎn)物對不同供試菌的抑菌效果，從而為大薊黃酮類物質(zhì)的后續(xù)開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大薊 采購于白城市吉林大藥房，經(jīng)白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校劉大偉老師鑒定為菊科植物大薊的干燥根；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院（批號：100080-201811）；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AB-8、DM 130 型大孔樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司；H-103、D101、DM 301 型大孔樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；HPD-400、HPD-600、NKA-II 大孔樹脂 天津西金納環(huán)保材料科技有限公司；牛肉蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 自制；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌 吉林北方微生物研究所；滅菌注射用水 華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 為超純水。

N5000 型紫外-可見分光光度計(jì) 青島精誠儀器儀表有限公司；FA124 型電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；OLB-100B 型恒溫振蕩器 山東博科科學(xué)儀器有限公司；FC-10AE 型冷凍干燥機(jī) 河北國輝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JC-150-SE 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱青島精誠儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮提取物制備 參考相關(guān)文獻(xiàn)操作[6]，采用溶劑提取法制備大薊總黃酮提取物，具體如下：將大薊根完全粉碎后，過80 目篩，稱取干粉50 g，置于300 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液內(nèi)，水浴85 ℃恒溫加熱1.5 h 后過濾，重復(fù)上述操作，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇后，冷凍干燥，即得粗品，純化時以水為溶劑，配制成不同濃度的上樣液。

1.2.2 產(chǎn)物的純度測定 參考相關(guān)文獻(xiàn)步驟[10]，準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品10.0 mg，置于50 mL 容量瓶內(nèi)，加入30%乙醇溶液定容后，搖勻。分別準(zhǔn)確移取0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL 置于10 mL 容量瓶內(nèi)，依次加入5%亞硝酸鈉和10%硝酸鋁溶液0.3 mL后，靜置6 min，繼續(xù)加入4%氫氧化鈉2 mL，采用30%乙醇溶液定容后，搖勻，于510 nm 波長處測定吸光度值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=7.015x+0.012（r=0.9995），同時于相同波長，測定其它樣品的吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，確定樣品中黃酮含量，另將純化后的洗脫液減壓蒸發(fā)，濃縮干燥后稱重，根據(jù)下式計(jì)算純化產(chǎn)物的總黃酮純度。

1.2.3 樹脂的靜態(tài)吸附-洗脫性能比較 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后[11]的不同類型樹脂3.00 g，置于3 mg/mL 提取液50 mL 中，于室溫下振蕩吸附至飽和后，測定溶液中黃酮含量，隨后采用純化水沖洗樹脂后，置于錐形瓶內(nèi)，加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇100 mL，于室溫振蕩解吸至平衡，測定乙醇溶液中黃酮含量，按照文獻(xiàn)所列公式[12]，測得不同類型樹脂的吸附率、洗脫率和黃酮回收率。

式中：me為吸附平衡后總黃酮質(zhì)量，mg；m0為樣液初始總黃酮質(zhì)量，mg；md為洗脫液中總黃酮質(zhì)量，mg；Qe為飽和吸附率，%；Dd為洗脫率，%；R 為回收率，%。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 吸附條件考察 采用濕法將30 mL 活化的D101 型樹脂裝入層析柱（徑高比為1:5）內(nèi)，分別考察不同的上樣液質(zhì)量濃度、上樣液pH 與上樣流速對樹脂吸附效果的影響，具體如下：a.當(dāng)上樣液pH 為5.0、體積為70 mL，上樣流速為1.0 mL/min 時，上樣液質(zhì)量濃度分別為：1、2、3、4、5 mg/mL；b.當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為3 mg/mL，上樣流速為1.0 mL/min，上樣液體積為70 mL 時，上樣液pH 分別為：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；c.當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為3 mg/mL，上樣液pH 為5.0 時，繪制上樣流速分別為1.0、2.0、3.0 mL/min時泄漏曲線。

1.2.4.2 洗脫條件考察 以乙醇作洗脫劑，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)與洗脫流速對吸附于樹脂中黃酮的洗脫效果影響，具體如下：a.當(dāng)洗脫流速為1.0 mL/min時，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為：50%、60%、70%、80%、90%；b.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，繪制洗脫流速分別為1.0、2.0、3.0 mL/min的洗脫曲線。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 固定上樣液體積70 mL、上樣流速1.0 mL/min、洗脫流速1.0 mL/min、洗脫液體積180 mL，以上樣液質(zhì)量濃度（A）、上樣液pH（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）為響應(yīng)因素，黃酮回收率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最佳純化工藝條件，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface design

1.2.6 抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 菌種活化與溶液配制 在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌，于37 ℃培養(yǎng)24 h，制得105CFU/mL 菌懸液后，吸取2 mL 涂布于平板中，制成含菌平板[13]。另采用無菌水分別溶解純化前、后產(chǎn)物，制得10.0 mg/mL樣品溶液。

1.2.6.2 抑菌活性比較 采用“濾紙片法”考察純化前、后產(chǎn)物的抑菌活性，將滅菌圓紙片（直徑6 mm）分別浸泡于相同濃度的不同樣品溶液中2 h 后，貼于不同含菌平板中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，另以無菌水作陰性對照[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)平行三次，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P<0.05 表示具有顯著性差異，P<0.01 表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂種類篩選

不同類型樹脂的孔徑、比表面積與極性差異較大，因此吸附黃酮化合物的效果不同。八種樹脂對大薊黃酮化合物的靜態(tài)吸附與解吸效果，見表2 所示。不同類型樹脂對黃酮化合物的吸附具有一定選擇性，其中H 103 樹脂對黃酮化合物的吸附率最高，達(dá)到89.4%，這歸因于該樹脂的比表面積（≥900 m2/g）與平均孔徑（85～95 nm）均較大[15]，且為非極性樹脂，因此與黃酮化合物具有較好的相互作用，但D 101型樹脂相對于H 103 型樹脂的解吸率更高，且回收率為73.7%。這與李倩等[16]采用D 101 樹脂吸附新疆圓柏黃酮結(jié)果較為相近，同時D101 樹脂的成本適宜，因此確定采用D 101 型樹脂純化大薊黃酮提取物。

表2 不同類型樹脂的靜態(tài)吸附-解吸結(jié)果Table 2 Static adsorption and desorption performance of macroporous resins of different types

2.2 動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 上樣液質(zhì)量濃度選擇 不同質(zhì)量濃度的上樣液對樹脂吸附大薊根黃酮化合物的影響，見圖1 所示。隨著上樣液質(zhì)量濃度的增大，吸附率先緩慢增大后逐漸減小。這歸因于上樣液質(zhì)量濃度越低，黃酮化合物被樹脂吸附的越充分，但吸附量較少，而伴隨上樣液濃度的增大，樹脂的吸附效果受其吸附位點(diǎn)的數(shù)量影響，吸附量與吸附率均減小[17]，考慮到上樣液濃度過低時，樹脂的純化效率較小，而濃度過高時，又造成物料的浪費(fèi)，因此以2.0、3.0、4.0 mg/mL 上樣溶液作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素考察水平。

圖1 上樣液濃度對吸附率的影響Fig.1 The effect of sample solution concentration on adsorption rate of resin

2.2.2 上樣液pH 選擇 上樣液pH 對樹脂吸附大薊根黃酮化合物的影響，見圖2 所示。從圖2 可知，隨著上樣液pH 增大，吸附率先升高，至pH 為5.0 時開始下降，這歸因于黃酮化合物的結(jié)構(gòu)中存在較多酚羥基，當(dāng)溶液pH 不同時，其存在形式有所變化，在pH 較低溶液中，易形成“徉鹽”，而在pH 過高溶液中，易以離子態(tài)存在[18]，均不利于黃酮化合物的物理吸附，因此以上樣液pH4.0、5.0、6.0 作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素考察水平。

圖2 上樣液pH 對吸附率的影響Fig.2 The effect of pH of sample solution on adsorption rate of resin

2.2.3 不同上樣流速時的泄漏曲線 當(dāng)泄漏液中黃酮化合物濃度約為上樣液濃度的1/10 時，則認(rèn)為樹脂開始出現(xiàn)泄漏，稱為“泄漏點(diǎn)”[19]，分別考察不同上樣流速時D101 型樹脂的泄漏曲線，如圖3 所示。隨著上樣流速的加快，樹脂泄漏點(diǎn)對應(yīng)的上樣液體積不斷減小，分別約為70、50、30 mL。這源于黃酮化合物在樹脂內(nèi)的物理吸附，依賴于膜擴(kuò)散與粒擴(kuò)散效應(yīng)，若流速過慢，樹脂與溶液接觸充分，但流速過快，使得擴(kuò)散效應(yīng)降低[20]，因此確定最佳上樣流速為1.0 mL/min，上樣體積為70 mL。

圖3 不同上樣流速的泄漏曲線Fig.3 The leakage curve of different flow velocity

2.3 動態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的選擇 不同體積分?jǐn)?shù)的洗脫液對大薊根黃酮化合物的洗脫率影響，如圖4 所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，洗脫率逐漸升高，隨后緩慢下降。這歸因于乙醇的體積分?jǐn)?shù)較低時，吸附在樹脂內(nèi)的黃酮化合物不易溶出，而體積分?jǐn)?shù)過高，又使得部分醇溶性雜質(zhì)從樹脂解吸脫附[21]，因此以乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素考察水平。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對洗脫率的影響Fig.4 The effect of ethanol concentration on desorption rate

2.3.2 不同洗脫流速時的洗脫曲線 不同洗脫流速下飽和吸附后樹脂的洗脫曲線，見圖5 所示。伴隨洗脫流速加快，洗脫曲線峰形逐漸變寬，同時洗脫劑消耗量增多。與其它洗脫流速相比，當(dāng)采用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液以1.0 mL/min 流速洗脫時，洗脫曲線的峰型明顯集中、對稱，于180 mL 洗脫液下基本洗脫完全，因此確定最佳洗脫流速為1.0 mL/min，洗脫液用量180 mL。

圖5 不同流速的洗脫曲線Fig.5 The dynamic desorption curve of different flow velocity

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平的RSM 分析試驗(yàn)，分別考察上樣液質(zhì)量濃度（A）、上樣液pH（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）對黃酮化合物回收率（Y）的影響，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of the response surface experiment

2.4.2 方差分析 采用多元回歸擬合上述試驗(yàn)結(jié)果，得到以回收率為目標(biāo)函數(shù)，各參數(shù)編碼值的多元二次方 程 ：Y=69.32?0.25A?0.16B+0.037C?0.33AB?0.18AC?0.30BC?3.29A2?2.46B2?1.46C2，對其進(jìn)行顯著檢驗(yàn)與方差分析，結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面方差分析Table 4 The variance analysis of response surface experiment

從表4 可知，該回歸模型P<0.01，表明二次回歸方程模型顯著，失擬項(xiàng)P=0.5921>0.05 表明該回歸方程擬合度較高，R2=0.9949 表明模型可充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。通過該模型的方差分析可知：在所有作用因素中，一次項(xiàng)A、交互項(xiàng)AB 對黃酮的回收率影響顯著（P<0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2的影響極其顯著（P<0.01）。從表中F值可知，各因素對黃酮回收率的影響順序?yàn)椋荷蠘右嘿|(zhì)量濃度（A）>上樣液pH（B）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）。

2.4.3 交互作用分析 不同因素交互影響黃酮化合物回收率的響應(yīng)曲面，見圖6 所示。所有響應(yīng)面開口均向下，回收率與三個考察因素呈明顯的二次拋物關(guān)系，隨著各因素值增大，響應(yīng)值逐漸升高，隨后呈現(xiàn)不同斜率的下降，各曲面均有穩(wěn)定點(diǎn)，即為極大值[22]。通過對二次拋物線函數(shù)模型進(jìn)行極值分析，得到D101 型大孔樹脂純化大薊根黃酮化合物的最佳工藝條件為：質(zhì)量濃度為2.96 mg/mL，pH4.97的大薊黃酮提取液70 mL，以1.0 mL/min 流速上樣后，經(jīng)180 mL 體積分?jǐn)?shù)為70.2%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脫，對黃酮化合物的理論回收率為70.3%，實(shí)際回收率為69.8%±1.1%，與模型預(yù)測值較接近。產(chǎn)物的黃酮純度由23.2%±0.7%提高至67.4%±0.9%，約為純化前2.9 倍。李俠等[23]采用AB-8 樹脂純化綠豆皮黃酮，產(chǎn)物純度約為純化前2.2 倍，而馮靖等[24]采用HPD-100 樹脂純化銀杏葉黃酮，產(chǎn)物純度約為純化前3.0 倍，表明該工藝條件純化大薊根總黃酮提取物的效果較佳。

圖6 兩因素交互作用對回收率的影響Fig.6 The influence of the interaction of two factors on the recovery rate

2.5 抑菌活性結(jié)果比較

純化前、后大薊根黃酮化合物對不同受試菌的抑菌效果，見表5 所示。從表5 可知，該黃酮化合物對三種受試菌均有一定的抑菌作用，抑菌效果由小到大排序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，這與王家皓等[25]考察南苜蓿葉黃酮的抑菌性能結(jié)果相近，而純化后黃酮化合物的三種抑菌圈直徑均明顯大于該提取物，具有顯著性差異（P<0.05），表明采用大孔樹脂純化大薊黃酮提取物，有助于進(jìn)一步增強(qiáng)其抑菌活性。

表5 不同樣品的抑菌圈直徑（n=3）Table 5 Inhibition zone diameter of different materials (n=3)

3 結(jié)論

本研究探討了大孔樹脂純化大薊根黃酮的最佳工藝條件并分析其抑菌活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為2.96 mg/mL，pH4.97的大薊黃酮提取液70 mL，以1.0 mL/min 流速上樣后，經(jīng)180 mL 體積分?jǐn)?shù)70.2%乙醇溶液，以1.0 mL/min 流速洗脫，產(chǎn)物的黃酮純度由23.2%±0.7%提高至67.4%±0.9%，約為純化前2.9 倍。通過體外抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，與提取物相較，純化后的產(chǎn)物對大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用均有顯著性提高（P<0.05），表明其抑菌活性更好，因此可為大薊根黃酮化合物的相關(guān)開發(fā)與利用提供參考。