超聲輔助提取毛酸漿籽蛋白質(zhì)的工藝優(yōu)化

苗欣月，朱立斌，朱 丹，牛廣財(cái), ，魏文毅，寧志雪

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

毛酸漿（Physalis pubescensL.）是茄科酸漿屬的一年生草本植物，又名黃菇娘，其成熟果實(shí)呈金黃色，可食藥兼用[1]。毛酸漿已被用于清熱解毒、治療咳嗽和泌尿生殖系統(tǒng)疾病等，還具有預(yù)防腫瘤、抗氧化、抗癌、降血脂和降血糖等功能[2?8]。毛酸漿籽作為毛酸漿在加工生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，由于得不到有效利用而被丟棄或被作為下腳料處理[9]。目前，已有大量關(guān)于毛酸漿果實(shí)方面的研究報(bào)道[10?13]，但有關(guān)毛酸漿果籽方面的研究較少，關(guān)于毛酸漿籽中蛋白質(zhì)的提取及其性質(zhì)的研究更是鮮見報(bào)道。郝曉磊等[14]、陸占國(guó)等[9]分別采用索氏微波提取法和超臨界CO2流體萃取法提取了毛酸漿籽油，并分析鑒定出毛酸漿籽油的脂肪酸組成為：亞油酸、油酸、棕櫚酸、十六（烷）酸、十八（烷）酸、亞油酸乙酯和硬脂酸等，其不飽和脂肪酸含量占81.0%～85.12%。張舵等[15]采用堿提酸沉法確定了紅菇娘籽中蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件，即在料液比為1:7，pH8.0，水浴溫度45 ℃，酸沉最佳pH 為4.0 時(shí)，紅菇娘籽蛋白質(zhì)的提取率為52.68%。

目前，提取植物蛋白的主要方法有酶解法、堿溶酸沉法、超聲輔助法等。酶解法提取條件溫和，但是提取溫度不宜過(guò)高，否則蛋白質(zhì)不易從植物細(xì)胞壁中溶出，導(dǎo)致提取效果不佳[16]。堿溶酸沉法提取率較低，提取時(shí)間長(zhǎng)，也會(huì)改變活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[17]。而超聲輔助提取技術(shù)具有的空穴效應(yīng)可產(chǎn)生較強(qiáng)的機(jī)械剪切力，有利于蛋白質(zhì)從固體物料中溶出，具有提取效率高、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[18]。唐詩(shī)琦等[19]采用超聲輔助堿法確定了辣木籽蛋白質(zhì)的最優(yōu)提取工藝條件為：pH8.0，提取時(shí)間45 min，提取溫度44 ℃，超聲功率150 W，此條件下辣木籽蛋白的提取率為44.03%。馬夢(mèng)婷等[20]確定了超聲輔助堿提棉籽蛋白的最優(yōu)工藝條件為pH 11.0，液料比20:1 mL/g，超聲時(shí)間20 min，超聲溫度45 ℃，超聲功率600 W，在此條件下棉籽蛋白提取率為87.64%。

本試驗(yàn)擬采用超聲輔助法提取毛酸漿籽中的蛋白質(zhì)，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)毛酸漿籽中蛋白質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，分析超聲輔助提取的毛酸漿籽蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性和起泡性，以期為毛酸漿籽蛋白質(zhì)的開發(fā)利用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛酸漿籽 大慶地產(chǎn)毛酸漿，品種為鐵把小菇娘（physalis pubescensTieba），毛酸漿打漿后經(jīng)紗布過(guò)濾、水洗，干燥后得到毛酸漿籽，毛酸漿粗蛋白含量為5.37%，粗脂肪含量為2.89%；牛血清蛋白 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 蛋白試劑 上海邁坤化工有限公司；乙醇 分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司；硫酸鉀、硫酸銅、硫酸等 均為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；十二烷基硫酸鈉 美國(guó)Sigma 公司。

DK-600B 電熱恒溫水槽 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LE203E/02 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；QDN-11 全自動(dòng)凱氏定氮儀 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；Beta2-8LD plus 冷凍干燥機(jī)德國(guó)Christ 公司；KH-500DE 型超聲波清洗器昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取工藝 參考李逸鶴等[21]的方法并稍加修改。將毛酸漿籽粉碎后置于真空干燥箱，45 ℃條件下干燥24 h，過(guò)40 目篩。取適量經(jīng)預(yù)處理后的毛酸漿籽粉，用石油醚（料液比1:5 g/mL）浸泡1 h，重復(fù)操作兩次，干燥后置于4 ℃冰箱貯存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將2.0 g 毛酸漿籽粉按1:15 g/mL的料液比分散到蒸餾水中，加堿調(diào)節(jié)至一定的pH。一定溫度下水浴30 min，在設(shè)定的超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度下進(jìn)行毛酸漿籽粉中蛋白質(zhì)的提取。超聲輔助提取結(jié)束后，在轉(zhuǎn)速為4500 r/min 條件下離心20 min 取上清液。滴加HCl 溶液（1 mol/L）使上清液pH 至4.0，離心取沉淀蛋白質(zhì)，加入蒸餾水將pH 調(diào)至7.0，最后冷凍干燥得到毛酸漿籽蛋白質(zhì)粉。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 超聲功率的選擇 將加入蒸餾水的毛酸漿籽溶液用NaOH 調(diào)pH 至9.0，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笏?0 min，分別選擇超聲功率100、200、300、400、500 W 于溫度20 ℃條件下超聲提取20 min，計(jì)算毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取率，確定毛酸漿籽蛋白質(zhì)的最適超聲功率。

1.2.2.2 提取溫度的選擇 將加入蒸餾水的毛酸漿籽溶液用NaOH 調(diào)pH 至9.0，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笏?0 min，分別選擇不同提取溫度20、30、40、50、60 ℃于功率300 W的條件下超聲提取20 min，計(jì)算毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取率，確定毛酸漿籽蛋白質(zhì)的最適提取溫度。

1.2.2.3 提取時(shí)間的選擇 將加入蒸餾水的毛酸漿籽溶液用NaOH 調(diào)pH 至9.0，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笏?0 min，固定提取溫度20 ℃，超聲功率300 W，考察不同提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響，確定毛酸漿籽蛋白質(zhì)的最適提取時(shí)間。

1.2.2.4 提取液pH的選擇 將加入蒸餾水的毛酸漿籽溶液用NaOH 調(diào)節(jié)pH 分別為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笏?0 min，在提取時(shí)間20 min，超聲功率300 W，提取溫度20 ℃下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率，確定毛酸漿籽蛋白質(zhì)的最適提取液pH。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取條件，具體因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.4 蛋白質(zhì)提取率測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量[22]，毛酸漿籽中總蛋白質(zhì)含量用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定[23]，毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率計(jì)算公式如下：

1.2.5 毛酸漿籽蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定 用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH 溶液將毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取液的pH 分別調(diào)至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，靜置一段時(shí)間后，離心（4500 r/min，20 min），取上清液比色測(cè)定，吸光值最小的即為等電點(diǎn)。

1.2.6 毛酸漿籽蛋白質(zhì)功能特性的測(cè)定

1.2.6.1 溶解性的測(cè)定 參考許英一等[24]的方法稍加修改。配制2.5%的樣品溶液，滴加HCl（1 mol/L）或 NaOH 溶液（1 mol/L）使pH 分別至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，室溫振蕩30 min，于6000 r/min 條件下離心20 min，上清液中氮含量采用微量凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)溶解性用氮溶解指數(shù)（NSI）來(lái)表示，計(jì)算公式如下：

1.2.6.2 乳化性的測(cè)定 參考李永恒等[25]的方法稍加修改。配制100 mL 濃度為2%的毛酸漿籽蛋白溶液，滴加HCl（1 mol/L）或 NaOH 溶液（1 mol/L）使pH 分別在3.0～10.0。分別取30 mL 溶液并加入液油體積比為4:1的大豆色拉油5 mL，用勻漿機(jī)（10000 r/min）攪拌2 min 后，從燒杯底部取樣50 μL加入到0.1% SDS 溶液中，以0.1% SDS 溶液作為空白對(duì)照，于500 nm 下測(cè)定吸光值A(chǔ)0。乳化性（EAI）計(jì)算公式如下：

式中：A0—樣品的吸光值；N—稀釋倍數(shù)；φ—油相所占的體積分?jǐn)?shù)；L—比色皿的光路長(zhǎng)度，1 cm；c—毛酸漿籽蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/mL。

1.2.6.3 起泡性的測(cè)定 參考李超楠等[26]的方法稍加修改。配制100 mL 濃度為2%的毛酸漿籽蛋白溶液，滴加HCl（1 mol/L）或 NaOH 溶液（1 mol/L）使pH 分別至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。攪拌1 h 后，以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，用勻漿機(jī)（10000 r/min）攪拌2 min 后，立即測(cè)定泡沫體積V0，起泡性（FA）的計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 19.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)P<0.05 差異顯著，P>0.05 無(wú)顯著差異；采用Origin軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲功率對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響從圖1 可知，當(dāng)超聲功率從100 W 升至200 W 過(guò)程中，毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率隨著功率的增加顯著增加（P<0.05），并在功率200 W 時(shí)達(dá)到最大值63.60%。這可能是由于超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)使毛酸漿籽粉細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)被破壞，加速了毛酸漿籽粉中蛋白質(zhì)的溶出，有利于蛋白質(zhì)的提取[27]。功率在200 W 與300 W時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響差異不顯著（P>0.05），而當(dāng)超聲功率高于300 W，毛酸漿籽中的蛋白質(zhì)提取率開始顯著降低，產(chǎn)生這種現(xiàn)象主要是因?yàn)楫?dāng)超聲功率逐漸升高時(shí)，溶液溫度也隨之升高，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，引起毛酸漿籽蛋白質(zhì)破壞，從而影響蛋白質(zhì)提取率[28]。因此，選擇超聲功率100、200、300 W 進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 超聲功率對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of Physalis pubescens L.seeds protein

2.1.2 提取溫度對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響由圖2 可知，提取溫度在20 ℃到40 ℃范圍時(shí)，毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取率顯著上升（P<0.05），這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)臏囟扔欣诿釢{籽中的蛋白質(zhì)從細(xì)胞中溶出，同時(shí)提高了毛酸漿籽蛋白質(zhì)的溶解度，從而有利于毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取。當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，毛酸漿籽蛋白質(zhì)發(fā)生變性，溶解性降低，不利于毛酸漿籽粉中蛋白質(zhì)的提取[21]。因此，選擇提取溫度30、40、50 ℃進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 提取溫度對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the yield of Physalis pubescens L.seeds protein

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響由圖3 可知，當(dāng)提取時(shí)間由20 min 增加到50 min時(shí)，毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取率顯著上升（P<0.05），在50 min 時(shí)提取率達(dá)77.89%，隨后顯著下降，這可能是由于超聲產(chǎn)生的空化作用使毛酸漿籽蛋白質(zhì)在很短的一段時(shí)間內(nèi)能最大限的溶出，從而增加了蛋白質(zhì)的提取率；隨著提取時(shí)間繼續(xù)增加，可能會(huì)使蛋白質(zhì)部分變性，不利于毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取[26]。因此，選擇提取時(shí)間40、50、60 min 進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of Physalis pubescens L.seeds protein

2.1.4 提取液pH 對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響由圖4 可知，當(dāng)pH 由7.0 升至9.0 時(shí)，隨著pH的增加，蛋白質(zhì)提取率顯著增加（P<0.05），在pH 9.0 時(shí)達(dá)到最高值68.18%，這可能是因?yàn)槊釢{籽中的蛋白質(zhì)在稀堿溶液中發(fā)生水解，蛋白質(zhì)分子間相互排斥，對(duì)蛋白質(zhì)分子有增溶作用，使毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取率增加[17]。但隨著提取液pH 繼續(xù)增大，毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取率呈逐漸下降的趨勢(shì)，這可能是由于堿性條件增加了毛酸漿籽蛋白質(zhì)的水解性，在酸沉?xí)r也會(huì)造成部分蛋白質(zhì)的損失；且堿性過(guò)強(qiáng)會(huì)使蛋白質(zhì)變性和水解，造成提取蛋白質(zhì)的品質(zhì)下降[24,29]。因此，選擇提取液pH8、9、10 進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖4 提取液pH 對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of Physalis pubescens L.seeds protein

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按L9（34）正交表對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的各影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2 可知，影響毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的各因素的主次順序?yàn)椋禾崛囟龋ˋ）>超聲功率（D）>提取液pH（B）>提取時(shí)間（C）。最佳工藝組合為A3B2C2D3，即最佳提取條件為提取溫度50 ℃、功率300 W、提取液pH 9.0、提取時(shí)間50 min。

表3 為該正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果。由表3 可知，考察的4 個(gè)因素中：提取溫度對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率有較大的影響，差異極顯著（P<0.01）；提取液pH 及超聲功率對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響顯著（P<0.05）；而提取時(shí)間對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)提取率的影響不顯著（P>0.05）。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為驗(yàn)證超聲輔助法提取毛酸漿籽蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和有效性，選取由正交試驗(yàn)最佳工藝A3B2C2D3，即在提取時(shí)間50 min、提取溫度50 ℃、提取功率300 W、提取液為pH 9.0的條件下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。此工藝條件下通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取率為90.45%±0.16%。因此，此工藝條件對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取具有較好的可行性。

2.4 毛酸漿籽蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定

由圖5 可知，pH 在3.0～5.5 范圍內(nèi)，吸光值隨pH的增加呈先下降后升高，且pH 在4.0 時(shí)的吸光值最小，說(shuō)明此pH 條件下蛋白質(zhì)沉淀最多，此時(shí)的pH 即為毛酸漿籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

圖5 毛酸漿籽蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定Fig.5 Determination of isoelectric point of Physalis pubescens L.seeds protein

2.5 毛酸漿籽蛋白質(zhì)的特性研究

2.5.1 毛酸漿籽蛋白質(zhì)溶解性 由圖6 可知，當(dāng)pH由2.0 升至10.0，毛酸漿籽蛋白質(zhì)的氮溶解指數(shù)先下降后升高；pH 為4.0 時(shí)，氮溶解指數(shù)達(dá)到最小值14.59%。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)（pH4.0）附近時(shí)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的凈電荷為0，分子顆粒間相互作用力減弱而發(fā)生碰撞、聚集，產(chǎn)生沉淀，此時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度最低；當(dāng)pH 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)的水溶性提高，從而增加了蛋白質(zhì)的溶解性[24,30]。在pH 為10.0 時(shí)，氮溶解指數(shù)達(dá)到最高值58.32%。

圖6 pH 對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)溶解性的影響Fig.6 Effect of pH on solubility of Physalis pubescens L.seeds protein

2.5.2 毛酸漿籽蛋白質(zhì)乳化性研究 由圖7 可知，毛酸漿籽蛋白質(zhì)的乳化性隨pH的增加先降低后升高，在pH 為4.0 時(shí)呈現(xiàn)最小值，這可能是因?yàn)樘幱诘入婞c(diǎn)附近時(shí)毛酸漿籽蛋白質(zhì)的溶解度最低，且無(wú)凈電荷，所以蛋白質(zhì)乳化能力較弱[31]。在pH 為10.0 時(shí)，乳化性達(dá)到68.94 m2/g。

圖7 pH 對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)乳化性的影響Fig.7 Effect of pH on emulsification of Physalis pubescens L.seeds protein

2.5.3 毛酸漿籽蛋白質(zhì)起泡性研究 由圖8 可知，當(dāng)pH 由3.0 升至7.0，毛酸漿籽蛋白質(zhì)的起泡性先降低后升高。pH 為4.0 時(shí)呈現(xiàn)最小值，這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近時(shí)未溶解的毛酸漿籽蛋白質(zhì)較多，起泡性較弱。而在pH7.0 時(shí)呈現(xiàn)最大值43%，但繼續(xù)增加pH，則起泡性又降低，說(shuō)明過(guò)酸或過(guò)堿條件都不利于毛酸漿籽蛋白質(zhì)的起泡。

圖8 pH 對(duì)毛酸漿籽蛋白質(zhì)起泡性的影響Fig.8 Effect of pH on foaming characteristic of Physalis pubescens L.seeds protein

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了超聲輔助法提取毛酸漿籽中蛋白質(zhì)的提取條件，即在提取溫度50 ℃、功率300 W、提取液pH 9.0、提取時(shí)間50 min的條件下，毛酸漿籽蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)90.45%±0.16%。超聲輔助法提取毛酸漿蛋白質(zhì)的功能特性表明，在等電點(diǎn)pH4.0 附近，毛酸漿籽蛋白質(zhì)的溶解性、起泡性和乳化性最弱，pH 為7.0 時(shí)，毛酸漿籽蛋白質(zhì)的起泡性最好，且毛酸漿籽蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿性溶液中有較好溶解性。后續(xù)將進(jìn)一步研究毛酸漿籽蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和凝膠特性。