去整合素金屬蛋白酶15通過AKT/ERK通路和MMP9影響肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

周潔琦 徐圣杰 高莉蓉 劉澤毅

肺癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)性死亡的主要原因[1]，肺癌的發(fā)病率和死亡率均位于全球首位[2]。盡管有針對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的多種治療方法，對(duì)于晚期患者療效仍然有限，五年生存率仍然較低[3]。因此，迫切需進(jìn)一步研究NSCLC的發(fā)病機(jī)理，并尋找有效的治療方法。去整合素金屬蛋白酶(ADAM)屬于去整合素金屬蛋白酶家族成員，包括信號(hào)肽，前肽，金屬蛋白酶域，去整合素域等區(qū)域，在調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用中起到重要作用[4-5]。研究表明ADAM15在許多實(shí)體惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且ADAM15的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示ADAM15高表達(dá)的患者預(yù)后較差[4, 6]。因此，本研究旨在探討ADAM15對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其可能的機(jī)制，旨在為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

資料與方法

一、組織樣本

收集2016至2018年蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科20對(duì)肺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織樣本。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放化療和介入等治療。此研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2016倫理(申報(bào))批第157-1號(hào)], 并獲得所有涉及此研究患者的知情同意。

二、實(shí)驗(yàn)試劑

Trizol、RT-PCR試劑盒及SYBR Green RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；ADAM15引物(蘇州金唯智科技有限公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛公司)；ADAM15干擾序列(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；Cell counting kit-8(CCK8)試劑(碧云天公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；結(jié)晶紫染液(上海生工公司)；ADAM15抗體(Santa Cruz公司)、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、MMP2、MMP9抗體(CST公司)；β-actin抗體、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

三、細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、SPC、H460及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B均從上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買。細(xì)胞均在含有10%FBS和1%雙抗(100U/ml青霉素和鏈霉素)的RPMI-1640的完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)。

四、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

將H460細(xì)胞接種在六孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到40%～60%時(shí)，我們按照制轉(zhuǎn)染試劑盒說明書使用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48～72 h后，收集細(xì)胞用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。AMAM15的干擾序列如下：ADAM15-1 siRNA：5′-CCCAGC UGUCACCCUCGAA-TT-3′; ADAM15-2 siRNA：5′-GAUCUACUCUGGGAGA CAATT-3′。

五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

嚴(yán)格按照Trizol試劑說明提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR檢測(cè)。ADAM15上游引物：AGCCTCAAAAAGGTGCTTCA，下游引物：TGGTAGCA GCAGTTCTC；β-actin的上游引物：CACAGAGCCTCGCCTT TGCC，下游引物：ACCCATGCCCACCATCAC。

六、CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

根據(jù)CCK8試劑說明書，使用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。將H460細(xì)胞以每孔3×103個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中，每孔設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔，分別在鋪板后24、48、72 h加入10ul CCK8試劑，繼續(xù)放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在450nm和630nm的光密度值(OD值)。

七、劃痕實(shí)驗(yàn)

將H460細(xì)胞接種在6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h，待細(xì)胞密度達(dá)到90%后，使用10 μl移液器吸頭以及無菌標(biāo)尺輕輕、緩慢地在水平線劃一條劃痕，垂直線劃三條劃痕。用PBS洗后換無血清培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48h。在顯微鏡下分別在0h和48h取同樣的位置進(jìn)行拍照。

八、小室(Transwell)檢測(cè)遷移和侵襲

將H460細(xì)胞接種在6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h，待細(xì)胞密度達(dá)到90%。消化細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后用含1% FBS的培養(yǎng)基重懸。向基質(zhì)膠包被的小室上室加入200 ul含12×104細(xì)胞的細(xì)胞懸液，向基質(zhì)膠未包被的小室上室加入200ul含8 ×104細(xì)胞懸液，下室均加入800ul完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h，取出小室，PBS洗滌后甲醇固定30min，再用結(jié)晶紫染色2h，用棉棒輕輕擦去上室面細(xì)胞，于顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)。

九、蛋白質(zhì)印記(Western blot)檢測(cè)蛋白

轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞系后使用RIPA法提取細(xì)胞總蛋白并制作蛋白樣品。以每孔50ug蛋白樣品加樣，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，一抗4°過夜孵育，TBST洗4次/5 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗4次/5 min，顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、OSluca網(wǎng)站預(yù)測(cè)各數(shù)據(jù)庫中ADAM15與肺癌的預(yù)后的關(guān)系

通過Osluca網(wǎng)站(http://bioinfo.henu.edu.cn/LUCA/LUCAList.jsp)中的多個(gè)數(shù)據(jù)庫分析了ADAM15對(duì)肺癌預(yù)后的影響，結(jié)果顯示在大多數(shù)數(shù)據(jù)庫中風(fēng)險(xiǎn)比(HR)大于1，表明ADAM15可能與肺癌的預(yù)后不良有關(guān)(圖1)(P<0.05)。

圖1 OSluca預(yù)測(cè)各數(shù)據(jù)庫中ADAM15與肺癌預(yù)后的關(guān)系

二、ADAM15在肺癌細(xì)胞株和肺癌組織中呈高表達(dá)

通過Western blot的檢測(cè)，ADAM15在正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B和肺癌細(xì)胞株A549、H1299、SPC、H460中相對(duì)表達(dá)水平(圖2A)，定量如(圖2B)。由于ADAM15在H460細(xì)胞株中表達(dá)較高，故選擇H460細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用實(shí)時(shí)定量PCR在肺癌組織和相應(yīng)的癌旁組織中也檢測(cè)ADAM15的表達(dá)，在20對(duì)肺癌組織和相應(yīng)的癌旁組織中，ADAM15在13對(duì)肺癌組織中呈高表達(dá)，占比65%(圖3)(t=2.226，P=0.038)。

圖2 ADAM15在肺癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)注：A:Western blot檢測(cè)了ADAM15在人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B，以及肺癌細(xì)胞A549, H1299, SPC和H460中表達(dá)水平(n=3, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次); B：為左圖的蛋白定量圖(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了ADAM15在肺癌組織和相應(yīng)的癌旁組織的中的表達(dá)水平(n=20,*P<0.05)

三、ADAM15影響H460細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲

圖4 CCK8實(shí)驗(yàn)反應(yīng)了H460細(xì)胞干擾ADAM15后各組間的細(xì)胞增殖能力(n=3, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，***P<0.001)

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)反映了H460細(xì)胞干擾ADAM15后各組間的細(xì)胞遷移能力(×40)(n=3, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次)

四、ADAM15對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響

在H460細(xì)胞中干擾ADAM15后，檢測(cè)增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)的相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果表明，磷酸化的AKT和ERK的表達(dá)隨著ADAM15的干擾顯著下降，但總的AKT和ERK的表達(dá)并沒有顯著變化。隨著ADAM15的干擾，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá)也顯著下降，然而，基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)的表達(dá)并沒有明顯變化(圖7A)，定量如(圖7B)，具體參數(shù)(見表1)。

圖7 ADAM15對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響注：A: Western blot檢測(cè)了H460細(xì)胞干擾ADAM15后各組間ADAM15和下游蛋白的表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參(n=3, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次); B:為左圖的蛋白定量圖(**P<0.01; ***P<0.001)

表1 H460細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白相對(duì)定量

討 論

據(jù)報(bào)道，ADAM15在許多惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且ADAM15的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[6-7]。然而，在某些癌癥中，例如結(jié)腸癌，ADAM15表達(dá)的降低與結(jié)腸癌患者的癌癥轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[8]，因此，我們認(rèn)為ADAM15在各種類型的癌癥中起著不同的作用。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)ADAM15在肺癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，并且我們通過大數(shù)據(jù)分析觀察到ADAM15的高表達(dá)與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。

ADAM15是一種位于細(xì)胞膜上的金屬蛋白酶，它是唯一在其去整合素結(jié)構(gòu)域中具有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)位點(diǎn)的ADAM家族成員，它可以通過與整合素αVβ3，α5β1結(jié)合而在細(xì)胞粘附中發(fā)揮作用[5, 9-10]，因此，ADAM15是否可以通過整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)而在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用值得進(jìn)一步探討。

磷酸肌醇3激酶(PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，作為多種重要基因，如表皮生長因子受體(EGFR)的下游通路，已經(jīng)被證明對(duì)肺癌的增殖具有重要作用[11-13]。MMP2和MMP9屬于MMP家族的成員可以降解膠原蛋白和凝膠，和腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)[14-17]。歐小波等人證明ADAM15可以通過影響MMP9促進(jìn)乳腺癌侵襲，并將兩者聯(lián)合作為評(píng)估乳腺癌惡行生物學(xué)行為的指標(biāo)[18]。本研究證明ADAM15通過調(diào)控PI3K-AKT和MAPK-ERK信號(hào)通路影響H460細(xì)胞的增殖，并且ADAM15被干擾后，MMP9的表達(dá)隨之減少，而MMP2的表達(dá)無明顯變化，表明ADAM15可能通過調(diào)控MMP9通路影響H460細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，ADAM15的下調(diào)可以抑制H460細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這將為肺癌的治療提供新的線索。