哮喘患者外周血NPRA、GATA3表達(dá)與患者免疫功能失調(diào)及病情程度的關(guān)系

袁啟奎 曾榮

哮喘屬于呼吸道常見的慢性疾病，一般氣道炎癥反應(yīng)是哮喘發(fā)作的主要臨床表現(xiàn)，具體發(fā)病機(jī)制已經(jīng)公認(rèn)的主要是Th2型應(yīng)答優(yōu)勢(shì)化介導(dǎo)氣道炎癥導(dǎo)致，嚴(yán)重的影響了患者生活質(zhì)量與身心健康[1]。有報(bào)道稱GATA結(jié)合蛋白3為Th細(xì)胞分化特異性轉(zhuǎn)錄因子，是影響Th細(xì)胞分化與功能表達(dá)重要因子；心房利鈉肽則已經(jīng)證實(shí)能夠介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)，而外周血利鈉肽受體A，則人體的肺臟分布廣泛，同時(shí)基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)同哮喘易感性關(guān)系密切[2]。本研究對(duì)哮喘患者體內(nèi)NPRA、GATA 3mRNA的表達(dá)同病變程度之間聯(lián)系進(jìn)行分析，目的是為哮喘早期診斷，評(píng)估病情嚴(yán)重性提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、資料

選取武漢市武昌醫(yī)院收治的哮喘患者156例(哮喘組，其中急性發(fā)作期84例、穩(wěn)定期72例)、正常體檢志愿者60例作為對(duì)照組，患者納入時(shí)間范圍2018年6月～2020年1月。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；(2)年齡范圍19～65歲；(3)對(duì)照組為體檢志愿者；(4)本研究與醫(yī)學(xué)倫理要求無違背之處(倫理學(xué)文件編號(hào)：院倫(辦)[2016]19號(hào))。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)慢性阻塞性肺疾病患者；(2)支氣管擴(kuò)張、肺癌、肺結(jié)核、肺部感染；(3)經(jīng)3個(gè)月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的患者；(4)變應(yīng)性鼻炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、蕁麻疹等免疫系統(tǒng)疾病。

二、RT-PCR法

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)測(cè)定。清晨空腹抽取肘靜脈血液6mL加入淋巴細(xì)胞分離液，分離出來細(xì)胞沉淀吹打混勻在QIAzol Lysis Reagent，置于-80℃冰箱備用，提取總RNA并進(jìn)行定量，RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳，采取紫外分光光度計(jì)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄定量。引物為上海生工生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，28個(gè)循環(huán)后進(jìn)行mRNA檢測(cè)，電泳結(jié)束后將圖像輸凝膠成像系統(tǒng)，對(duì)各條帶灰度值進(jìn)行分析。

三、流式細(xì)胞儀技術(shù)

檢測(cè)兩組研究對(duì)象的檢測(cè)兩組研究對(duì)象外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞水平。

清晨空腹抽取1 mL靜脈血，儀器采用美國BD公司的流式細(xì)胞儀器，取100μl全血加入刺激劑，4℃避光孵育30min，直接加入1mL氯化銨紅細(xì)胞裂解10min，緩沖液沖洗3次后12000 r/min，離心時(shí)間5min，將10μlAPC標(biāo)記鼠抗人Foxp3單克隆抗體加進(jìn)洗滌緩沖液，4℃避光孵育30min，直接加入300μL流式細(xì)胞染色緩沖液，重懸后進(jìn)行Treg檢測(cè)。

100μL全血加入刺激劑10μl培養(yǎng)4～6h加入10μlCD3-PC5、10μL CD8-PC7避光孵育15min，室溫條件下避光孵育15min；緩沖液沖洗后以12000r/min離心5min，加入10μL IFN-γ-FITC、IL-4-PE，室溫條件下避光孵育15min，細(xì)胞重懸后檢測(cè)Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞水平。

四、ELISA法

抽取空腹清晨靜脈血3 mL，2000 r/min離心，30min后采用ELISA測(cè)定IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ濃度，試劑盒為武漢華美生物工程有限公司提供。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、一般資料對(duì)比

對(duì)照組與哮喘組急性發(fā)作期患者、穩(wěn)定期患者的基線資料進(jìn)行分析，具有較好的均衡性(P>0.05)(表1)。

表1 一般資料對(duì)比

二、三組研究對(duì)象的NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)強(qiáng)度比較

NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)水平比較，對(duì)照組低于哮喘組急性發(fā)作期患者、穩(wěn)定期患者且差異顯著(P<0.05)；NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)水平比較，穩(wěn)定期哮喘患者低于哮喘組急性發(fā)作期患者且差異顯著(P<0.05)(表2、圖1、圖2)。

表2 NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)強(qiáng)度組間比較

圖1 NPRA mRNA電泳圖。(M為maker，1為對(duì)照組、2為穩(wěn)定期患者、3分急性期患者的β-actin，4為對(duì)照組、5為穩(wěn)定期患者、6為急性期患者的急性期組NPRA mRNA電泳條帶)

圖2 GATA 3 mRNA電泳圖。(M為maker，1為對(duì)照組、3為穩(wěn)定期患者、5分急性期患者的β-actin條帶，2為對(duì)照組、4穩(wěn)定期患者、6為急性期分別為對(duì)照組、組、組GATA 3 mRNA條帶)

三、三組研究對(duì)象的Treg細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞水平比較

對(duì)照組外周血的Treg細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞水平高于哮喘組急性發(fā)作期患者、穩(wěn)定期患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；穩(wěn)定期哮喘患者的Treg細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞水平高于哮喘組急性發(fā)作期患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 外周血免疫細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

四、三組研究對(duì)象的免疫細(xì)胞因子水平比較

IL-2、IFN-γ水平組間分析，對(duì)照組的高于哮喘組急性發(fā)作期患者、穩(wěn)定期患者且差異具有顯著性(P<0.05)；IL-6、TNF-α水平組間比較，對(duì)照組低于哮喘組急性發(fā)作期患者、穩(wěn)定期患者且差異顯著(P<0.05)；IL-2、IFN-γ水平在穩(wěn)定期與急性發(fā)作期患者之間比較，穩(wěn)定期高于哮喘組急性發(fā)作期(P<0.05)；穩(wěn)定期哮喘患者的IL-6、TNF-α水平低于哮喘組急性發(fā)作期患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 三組研究對(duì)象的免疫細(xì)胞因子水平比較

五、哮喘急性期患者NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)與細(xì)胞因子的關(guān)系

對(duì)84例急性發(fā)作期哮喘患者進(jìn)行分析，NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)與IL-2、IFN-γ水平呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)；NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)與IL-6呈正相關(guān)性(P<0.05)(表5)。

表5 相關(guān)性分析結(jié)果

討 論

哮喘屬于呼吸系統(tǒng)高發(fā)疾病，有報(bào)道稱世界范圍內(nèi)罹患哮喘近3億人，主要臨床癥狀是氣道炎癥反應(yīng)與氣道高反應(yīng)，最終造成呼吸系統(tǒng)阻力增加，導(dǎo)致了通氣血流比例失衡，嚴(yán)重的形成代謝性酸中毒甚至呼吸衰竭，危及患者生命安全[3]。有報(bào)道指出在哮喘發(fā)作過程中，缺氧會(huì)造成血管內(nèi)膜增厚，細(xì)胞內(nèi)皮功能喪失，免疫力降低后導(dǎo)致體內(nèi)形成惡性循環(huán)，病情不斷加重[4-5]。目前對(duì)于哮喘評(píng)估的方式較多，傳統(tǒng)的纖維支氣管鏡最為常用，但是會(huì)對(duì)患者氣道黏膜造成損傷，部分患者無法接受，氣道反應(yīng)性檢測(cè)、呼出氣冷凝等方式則檢測(cè)的敏感性與特異性不高，而且操作相對(duì)復(fù)發(fā)，因此無法大范圍推廣應(yīng)用[6-7]。

本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的外周血的Treg細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞水平最高，其次為穩(wěn)定期哮喘患者，而急性發(fā)作期哮喘患者上述因子水平最低，表明在哮喘患者體內(nèi)存在免疫功能紊亂，而且急性期患者體內(nèi)免疫紊亂更嚴(yán)重，患者炎癥反應(yīng)更為嚴(yán)重[8]。正常狀態(tài)下人體Th1和Th2亞群處于平衡狀態(tài)，發(fā)揮免疫作用，對(duì)細(xì)胞亞群功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，讓人體免疫功能處于正常，在致病因素誘導(dǎo)下體內(nèi)Th1和Th2失衡導(dǎo)致免疫應(yīng)答過程被影響，導(dǎo)致哮喘發(fā)作[9]。IFN-γ屬于氣道炎癥介質(zhì)，可以調(diào)節(jié)免疫活性，哮喘發(fā)作會(huì)導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞脫落，Th1細(xì)胞則分泌IL-2、IFN-γ促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，可以抑制哮喘發(fā)生，發(fā)展；TNF-α則是活化巨噬細(xì)胞形成，能夠增加局部炎癥反應(yīng)程度，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致器官損傷；IL-6則是具有生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，對(duì)免疫應(yīng)答、促進(jìn)B細(xì)胞的增殖與分化具有重要意義，上述炎癥細(xì)胞因子均參與了哮喘的發(fā)生和發(fā)展[10-11]。

但是上述指標(biāo)在對(duì)哮喘發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程靈敏性與特異性一般，本研究對(duì)哮喘患者外周血利鈉肽受體A(NPRA)、GATA結(jié)合蛋白3(GATA 3)mRNA的表達(dá)與患者免疫功能變化及病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性進(jìn)行了創(chuàng)新性探討。哮喘發(fā)病的重要機(jī)制是Th2應(yīng)答優(yōu)勢(shì)化介導(dǎo)持續(xù)的過敏性炎癥反應(yīng)，心房鈉尿肽可以介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)，對(duì)Th17細(xì)胞分化具有調(diào)控作用，利鈉肽受體A則在人體的肺部廣泛分布，其激活后下有信號(hào)可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)并介導(dǎo)細(xì)胞生長、增殖和炎癥反應(yīng)，因此在介導(dǎo)Th2應(yīng)答優(yōu)勢(shì)進(jìn)而加重哮喘發(fā)展具有重要的意義[12]。GATA3作為轉(zhuǎn)錄因子在正常組織中對(duì)于細(xì)胞生長具有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)還能夠促進(jìn)細(xì)胞分化，作為轉(zhuǎn)錄因子可以對(duì)多中心遺傳分化方向進(jìn)行干預(yù)，因此是導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子[13]。動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在哮喘小鼠進(jìn)開展外源性心房鈉尿肽干預(yù)，小鼠氣道局部組織的白細(xì)胞介素4表達(dá)升高，肺組織GATA3表達(dá)同樣增多，而阻斷心房鈉尿肽信號(hào)則消失，這也進(jìn)一步證實(shí)了心房鈉尿肽信號(hào)通過白細(xì)胞介素4、GATA3優(yōu)勢(shì)化表達(dá)促進(jìn)了哮喘的發(fā)作[14-15]。

本研究顯示對(duì)照組的NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)水平低于哮喘組急性發(fā)作期患者、穩(wěn)定期患者，而穩(wěn)定期哮喘患者的NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)水平低于哮喘組急性發(fā)作期患者，提示在哮喘患者體內(nèi)存在NPRA mRNA、GATA 3 mRNA水平降低，而且急性期患者表達(dá)水平更低。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)與IL-2、IFN-γ水平呈顯著負(fù)相關(guān)性；NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)與IL-6呈正相關(guān)性，提示了NPRA mRNA、GATA 3 mRNA同哮喘發(fā)作和炎癥反應(yīng)程度具有一定的關(guān)聯(lián)性。本研究對(duì)患者體內(nèi)炎癥水平與免疫紊亂之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，也對(duì)哮喘患者進(jìn)行了分層研究，這在以往分析中相對(duì)少見，但是由于入組患者病例少，而且未能進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，還需要進(jìn)一步擴(kuò)展樣本量，開展系統(tǒng)全面深入研究，為臨床哮喘治療個(gè)體化方案制定，提供依據(jù)。

綜上述所，哮喘患者外周血中NPRA mRNA、GATA 3 mRNA表達(dá)上調(diào)，可能與外周血T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫細(xì)胞因子失衡有關(guān)。