基于熔解曲線法對肺部感染分枝桿菌菌種的研究

唐柳生 蒙志好 張明 廖光付 劉愛梅 黃麗玲

近年來，隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，分枝桿菌的菌種鑒定技術(shù)越來越成熟，有關(guān)分枝桿菌感染分布和感染危險因素的研究報(bào)道也越來越多。不同的地域，肺部分枝桿菌感染分布和感染危險因素亦有所不同[1]，為了解我院肺部感染分枝桿菌菌種分布和感染危險因素的狀況，我們采用熒光 PCR 熔解曲線技術(shù)對2019年12月～2020年3月到我院住院的330例肺部感染分枝桿菌的臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定，為臨床快速診斷分枝桿菌病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、標(biāo)本及病例來源

標(biāo)本來源于2019年12月～2020年3月間我院330例住院的肺部分枝桿菌感染患者，其中男250例(83.3%)，女80例(16.7%)，年齡14～94歲，平均年齡53.3歲；農(nóng)村戶籍218例，城鎮(zhèn)戶籍112例；壯族167例，漢族145例，其他民族18例。

二、儀器及試劑

萋尼氏染色液及中性羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索公司提供，Lab-Aid 824 核酸提取儀、SLAN 96S PCR 儀及菌種鑒定試劑由廈門致善公司提供。

三、診斷標(biāo)準(zhǔn)

分枝桿菌病診斷依據(jù)WS288-2017《結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)》和《結(jié)核病分類標(biāo)準(zhǔn)》。

四、方法

1.用中和離心法對住院疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)，按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行操作[2]。

2.將分枝桿菌培養(yǎng)陽性菌株用萋尼氏染色法進(jìn)行抗酸桿菌的確定，然后將確定為抗酸桿菌的菌株納入研究組

3.將研究組的菌株用熒光 PCR 熔解曲線技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定。先用Lab-Aid 824 核酸提取儀進(jìn)行核酸提取，然后用SLAN 96S PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)運(yùn)行完畢后，儀器將自動給出判讀結(jié)果。

五、數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010建立數(shù)據(jù)庫，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，用卡方檢驗(yàn)計(jì)算器V1.70計(jì)算χ2值和P值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、分枝桿菌的構(gòu)成比

330例患者共檢測出分枝桿菌335株，NTM占 42株，構(gòu)成比為12.5%(42/335),其中胞內(nèi)分枝桿菌14株，構(gòu)成比為33.3%(14/42)，龜分枝桿菌膿腫亞種15株，構(gòu)成比為35.7%(15/42)，鳥分枝桿菌5株，構(gòu)成比為11.9%(5/42)，偶然分枝桿菌2株，構(gòu)成比為4.8%(2/42)，猿猴分枝桿菌4株，構(gòu)成比為9.5%(4/42)，戈登分枝桿菌2株,構(gòu)成比為4.8%(2/42)(見表1)。

表1 295株分枝桿菌菌種分布情況

二、分枝桿菌的感染分布

330例患者中，感染結(jié)核分枝桿菌293例(其中有4例混合猿猴分枝桿菌感染、2例混合戈登分枝桿菌感染和4例混合其他分枝桿菌感染)，占88.8%(293/330),NTM35例(其中有1例為胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌混合感染)，占10.6%(35/330),不能明確感染分枝桿菌種類(其他分枝桿菌)2例,占0.6%(2/330)。排出肺結(jié)核的混合感染和不明確菌種(其他分枝桿菌)感染的因素，按明確分枝桿菌菌種感染病例數(shù)(肺結(jié)核混合感染按肺結(jié)核病例納入)計(jì)算，NTM肺部感染者占10.7%(35/328)。

三、NTM感染者不同性別的分布情況

250例男性感染者感染NTM19例，占7.6%(19/250)，80例女性感染者感染NTM16例，占20.0%(16/80)，NTM感染在性別之間的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.83，P<0.01)，顯示女性高于男性(見表2)。

表2 NTM感染者不同性別的分布情況[n(%)]

四、NTM感染在城鎮(zhèn)和農(nóng)村戶籍之間分布

112例城鎮(zhèn)戶籍感染者感染NTM15例，占13.4%(15/112)，218例農(nóng)村戶籍感染者感染NTM20例，占9.2%(20/218)，NTM感染在城鎮(zhèn)和農(nóng)村戶籍之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.39，P>0.05)(見表3)。

表3 NTM感染者在城鎮(zhèn)和農(nóng)村戶籍之間分布[n(%)]

五、NTM感染者不同年齡的分布情況

60歲以上感染者所占比例最大(見表4)。

表4 NTM感染者不同年齡的分布情況[n(%)]

六、NTM感染者不同民族的分布情況

167例壯族感染者感染NTM11例，占6.6%(11/167)，145例漢族感染者感染NTM23例，占15.9%(23/145)，其他民族18例，感染NTM1例，占5.6%(1/18)，NTM感染在民族之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.55，0.01

表5 NTM感染者不同民族的分布情況[n(%)]

七、NTM感染者的合并癥情況

除了6例肺結(jié)核合并NTM感染者外，其余35例NTM感染者中有26例合并其他疾病，占74.3%(26/35)，合并的疾病有COPD、糖尿病、支氣管擴(kuò)張、艾滋病、肺炎、心血管病、慢性腎病和腫瘤等(見表6)。

表6 NTM感染者的合并癥情況[n(%)]

討 論

由于各種分枝桿菌肺病的臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)都十分的相似，極易造成誤診導(dǎo)致患者病情遷延不愈[3]。近年來,結(jié)核病疫情雖然得到一定的控制,但NTM的感染率又有了升高的趨勢,NTM肺病已經(jīng)引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注[4]。由于不當(dāng)?shù)闹委熁蛑委煹氖。?NTM肺病的病死率可高達(dá)30%[4],NTM 感染給我們帶來了越來越嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此及早進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定及分析，對臨床診治和疾病防控具有非常重要的意義。本研究采用熒光PCR熔解曲線技術(shù)，根據(jù)不同分枝桿菌 ITS片段的特異序列設(shè)計(jì)探針，通過特定的熒光通道和熔點(diǎn)進(jìn)行分枝桿菌的鑒別，共檢測出NTM 42株，占檢出分枝桿菌的12.5%(42/335),排出肺結(jié)核的混合感染和不明確菌種(其他分枝桿菌)感染的因素，按明確分枝桿菌菌種感染病例數(shù)(肺結(jié)核混合感染按肺結(jié)核病例納入)計(jì)算，NTM肺部感染者占10.7%(35/328)，與其他地區(qū)的NTM分離率比較存在一定的差異，很多相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，NTM 的感染發(fā)生率呈現(xiàn)南方多于北方、沿海地區(qū)多于內(nèi)陸地區(qū)、氣候溫和地區(qū)多于氣候寒冷地區(qū)的現(xiàn)象[5-14]。

根據(jù)相關(guān)資料報(bào)道，新發(fā)現(xiàn)的分枝桿菌菌種越來越多[15]，本研究共鑒定出7種分枝桿菌，分別為結(jié)核分枝桿菌85.9%，胞內(nèi)分枝桿菌4.1%，龜分枝桿菌膿腫亞種4.4%，鳥分枝桿菌1.5%，猿猴分枝桿菌1.2%，偶然分枝桿菌0.6%，戈登分枝桿菌0.6%，有1.8%的菌株無法確定菌種。熒光PCR熔解曲線技術(shù)可鑒定19種分枝桿菌，研究中出現(xiàn)了少量的其他分枝桿菌，無法明確具體的菌種名稱，也許是這些菌種不在可檢測的19種分枝桿菌范圍之內(nèi)，顯示該技術(shù)的局限性。目前，傳統(tǒng)的培養(yǎng)和鑒定方法很難檢測出分枝桿菌的混合感染，本研究發(fā)現(xiàn)11例患者檢測出兩種分枝桿菌混合感染，這給治療帶來了十分重要的指導(dǎo)意義，也體現(xiàn)了該技術(shù)的優(yōu)越性。吳亦斐等[11]研究結(jié)果顯示35例分枝桿菌混合感染標(biāo)本中，28.5%為胞內(nèi)分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌混合感染，20.0%為龜分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌混合感染。而本研究結(jié)果顯示11例混合感染標(biāo)本中，有4例為結(jié)核分枝桿菌混合猿猴分枝桿菌、2例為結(jié)核分枝桿菌混合戈登分枝桿菌、4例為其他分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌混合感染、1例為胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌混合感染，二者報(bào)道存在一定差異，說明分枝桿菌的混合感染呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)。

本研究共檢出6種單一或混合感染的NTM,依次為胞內(nèi)分枝桿菌33.3%，龜分枝桿菌膿腫亞種35.7%，鳥分枝桿菌11.9%，偶然分枝桿菌4.8%，猿猴分枝桿菌9.5%，戈登分枝桿菌4.8%，結(jié)果顯示胞內(nèi)分枝桿菌和龜分枝桿菌膿腫亞種所占比例較大，根據(jù)國內(nèi)多個文獻(xiàn)報(bào)道[1，3-19]，北京地區(qū)NTM菌種以胞內(nèi)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌為主，山東省、甘肅省、福建省、江蘇省、杭州地區(qū)和寧波地區(qū)NTM以胞內(nèi)分枝桿菌株為主，天津市NTM以胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌為主，廣州市NTM以膿腫分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和馬賽分枝桿菌為主，數(shù)據(jù)證明雖然不同地區(qū)NTM的菌種分布比較復(fù)雜，NTM病的流行情況很難確定，但大部分地區(qū)NTM的感染分布以胞內(nèi)分枝桿菌為主。6種NTM 菌種分布中出現(xiàn)少量的偶然分枝桿菌、猿猴分枝桿菌和戈登分枝桿菌，這些菌種引起人類感染的報(bào)道較少，但相對流行病學(xué)而言卻有一定的意義。

NTM為條件致病菌，其致病性遠(yuǎn)低于結(jié)核分枝桿菌，免疫力下降是NTM主要易感因素，本研究顯示NTM的感染有老齡化的趨勢，并且女性高于男性，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.83，P<0.01)，而賈彤等[18]報(bào)道男性更易感染胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌，沈瑤杰等[19]報(bào)道NTM 肺疾病患者常見于男性，這可能與不同地區(qū)人群的生活習(xí)性有關(guān)。本研究數(shù)據(jù)顯示，NTM感染在城鎮(zhèn)和農(nóng)村戶籍之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.39，P>0.05)，證明NTM感染與戶籍不存在關(guān)聯(lián)性，但在民族之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.55，0.01

綜上所述，采用熒光PCR熔解曲線技術(shù)可快速進(jìn)行分枝桿菌的菌種鑒定，有利于肺部感染分枝桿菌患者的精準(zhǔn)治療。我院肺部感染NTM的臨床分離株以胞內(nèi)分枝桿菌和龜分枝桿菌膿腫亞種為主，NTM的易感與戶籍不存在關(guān)聯(lián)性，但與性別、年齡、民族和合并癥有關(guān)。COPD、糖尿病、支氣管擴(kuò)張、艾滋病、肺炎、心血管病、慢性腎病和腫瘤等為NTM感染者的常見合并癥，對患有這些基礎(chǔ)疾病的患者應(yīng)盡早進(jìn)行分枝桿菌的菌種鑒定，以便制定合理的治療方案，同時對疾病的防控也具有十分重要的指導(dǎo)意義。