三角梅CHS基因的克隆及表達(dá)分析

孫 蓉，劉 姍，高靜雷，刁 毅，姜少娟，王勝男

(攀枝花學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,四川攀枝花 617000)

三角梅是中央種子目(Centrospermae)紫茉莉科(Nyctaginaceae)葉子花屬(Bougainville)的一類常綠藤狀灌木[1]。其色澤艷麗，花量繁盛，花型獨(dú)特，四季開花，且耐旱耐鹽，少病蟲害，抗逆性強(qiáng)，可用于盆栽、綠籬也可用于園林綠化等[2]。作為景觀植物，花色改良是其重要的育種目標(biāo)，目前三角梅觀賞品種約有100多個[3-4]，有紅色系、橙色系、粉紫色系及白色系等[5]，但缺乏稀有的藍(lán) 色花。

安田斉[6]認(rèn)為藍(lán)色花色的產(chǎn)生需要多個條件結(jié)合，包括大量的飛燕草素，適合的液泡pH及適量的助色素等，其中飛燕草素的積累是主要條件。研究表明利用基因工程技術(shù)向非藍(lán)色花植物中引入飛燕草素合成途徑關(guān)鍵酶基因可實(shí)現(xiàn)藍(lán)色花色的培育，例如Holton[7]和Fukui等[8]將紫羅蘭中飛燕草素合成的關(guān)鍵基因類黃酮-3′-5′-羥基化酶(flavonoid-3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)轉(zhuǎn)入白色康乃馨后獲得了藍(lán)紫色的花。同樣地Katsumoto等[9]在月季中轉(zhuǎn)入外源F3′5′H基因后飛燕草素開始積累，最終得到了藍(lán)色的月季。而篩選適合的外源基因轉(zhuǎn)入受體是關(guān)鍵。

查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)是花青素苷合成途徑中的第一個關(guān)鍵酶及限速酶[10](圖1)，催化3分子丙二酰輔酶A(malnoyl CoA)與1分子4-香豆酰輔酶A(4-coumaroyl-CoA)生成查爾酮(chalcone)，可為飛燕草素的合成提供基本的碳骨架。因此本研究基于前期三角梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選克隆CHS基因，利用MEGA5.05、ProParam、DNAMAN、Swiss-Model等生物信息學(xué)工具預(yù)測其蛋白的分子特性，并采用qRT-PCR技術(shù)分析基因表達(dá)特異性，為該基因的表達(dá)調(diào)控及功能驗(yàn)證提供基礎(chǔ)材料，為藍(lán)色三角梅轉(zhuǎn)基因受體的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇1～2 a生完全木質(zhì)化，粗細(xì)長短相近的各色系單色單瓣三角梅[白色的‘新加坡大白(B.glabra‘Singapore White’)’，粉紅色的‘中國麗人(B.×buttiana‘China Beauty’)’，紅色的‘花葉大紅(B.×buttiana‘Brilliant Variegata’)’，橙色的‘寶老橙(B.×buttiana‘Baolao Cheng’)’，黃色的‘黃蝶(B.×spectoglabra‘Ratana Yellow’)’及紫色的‘安格斯(B.‘Elizabeth Angus’)’]枝條于2018年6月扦插種植于攀枝花學(xué)院苗圃，以盛花期的苞片和葉片為試驗(yàn)材料。

1.2 查爾酮合酶基因的克隆

根據(jù)干熱河谷特色生物資源開發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室測序獲得的白色三角梅苞片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以注釋信息、基因表達(dá)豐度、序列長度等為條件，篩選花青素合成途徑中的CHS基因，手動篩除不同注釋庫的重復(fù)項(xiàng)，并通過BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對確定完整性。根據(jù)所得序列設(shè)計(jì)一對特異引物，上游引物BsCHSF:ATGAATTCTCCATCACTTGATGAAA及下游引物BsCHSR:TTATAGTGGAACACTATGAAGCACA。以白色三角梅葉片cDNA第一鏈為模板，利用PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa)擴(kuò)增BsCHS基因cDNA全長，25 μL反應(yīng)體系中PrimeSTAR Max Premix (2×) 12.5 μL，BsCHSF (10 μmol/L) 0.5 μL，BsCHSR(10 μmol/L) 0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL；PCR反應(yīng)程序：98 ℃變性10 s；55 ℃退火 5 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)后，為保證充分?jǐn)U增72 ℃繼續(xù)延伸10 min。利用超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒(天根)純化回收PCR產(chǎn)物，送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序驗(yàn)證。

1.3 序列分析

利用DNAMAN軟件結(jié)合WebLoGo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)在線系統(tǒng)解析CHS保守基序的序列特征；通過SMART (http://smart.embl.de/)在線工具搜索功能結(jié)構(gòu)域；采用ExPASy系統(tǒng)的ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)工具分析表達(dá)蛋白的基本理化性質(zhì)及三級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用CBS研究所在線預(yù)測服務(wù)系統(tǒng)的TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0/)和SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)工具預(yù)測表達(dá)蛋白的跨膜區(qū)域及信號肽；SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sspred.html)方法用于預(yù)測二級結(jié)構(gòu)；使用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，建樹方法為比鄰法(Neighbor-Joining)，自舉重復(fù)(Bootstrap replications)的重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.4 基因表達(dá)量分析

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個花色葉片及苞片進(jìn)行2次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。以表達(dá)量最低的材料為對照，利用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因在不同花色中的相對表達(dá)量，并通過SPSS 20.0進(jìn)行顯著性分析，Origin 2018軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三角梅CHS基因的克隆

根據(jù)三角梅轉(zhuǎn)錄組注釋信息庫的基因名稱和功能注釋，成功篩選獲得了1條CHS基因序列(Bs104454)，通過BLAST比對顯示Bs104454基因開放閱讀框完整且與其他植物CHS同源，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得了一條長為1 176 bp的cDNA序列，編碼392個氨基酸，測序結(jié)果與預(yù)期相吻合，將其命名為BsCHS，提交GenBank，登錄號為MT302539(圖2)。

2.2 BsCHS蛋白基本理化性質(zhì)分析

根據(jù)ProtParam工具預(yù)測，BsCHS理論相對分子質(zhì)量為43.96 ku，等電點(diǎn)為6.24，含量最多的氨基酸為亮氨酸(Leu)含10.5%，其總負(fù)電荷殘基數(shù)為50，正電荷殘基數(shù)為45，分子式為C1964H3129N537O568S19，總原子數(shù)為6217，不穩(wěn)定系數(shù)及平均總親水系數(shù)分別為53.18和-0.067，表明BsCHS為不穩(wěn)定的親水性蛋白。

2.3 BsCHS蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 保守結(jié)構(gòu)域 不同植物間，查爾酮合酶蛋白較為保守，相似性為74%～98%，多序列比對結(jié)果(圖3)與此相符合，BsCHS與其余植物中CHS序列相似性為85.43%，具有CHS特有的保守基序(圖4)，在這些區(qū)域存在4個活性中心位點(diǎn)，其中Cys164是底物4-香豆酰輔酶A(4-coumaroyl-CoA)的結(jié)合位點(diǎn)；His303和Asn336主要參與催化底物丙二酰輔酶A(malnoyl CoA)脫羧的反應(yīng)；Phe215與底物特異性選擇相關(guān)[12]。

2.3.2 信號肽及跨膜結(jié)構(gòu) 信號肽的主要作用是引導(dǎo)新合成的多肽在胞內(nèi)運(yùn)輸，以到達(dá)不同的細(xì)胞器內(nèi)，具有指導(dǎo)多肽跨膜轉(zhuǎn)移的作用。經(jīng)SignalP 5.0在線工具預(yù)測顯示BsCHS不含有信號肽序列，TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果也與此相符，不含有跨膜結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步利用ProtCompv.9.0預(yù)測其亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞質(zhì)，該結(jié)果與上述結(jié)果相吻合。說明BsCHS為非分泌型的細(xì)胞質(zhì)蛋白。

2.3.3 功能結(jié)構(gòu)域及二級結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)域是一種介于二級和三級結(jié)構(gòu)之間的蛋白功能單元，不同的結(jié)構(gòu)域往往與不同的功能相聯(lián)系，結(jié)構(gòu)域信息對于預(yù)測蛋白質(zhì)間相互作用具有重要價(jià)值[13]。利用SMART在線工具預(yù)測BsCHS結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示其含有4個結(jié)構(gòu)域，其中Chal_sti_synt_N和Chal_sti_synt_C為查爾酮合酶特征結(jié)構(gòu)域，富含活性位點(diǎn)，與底物特異結(jié)合有關(guān)，C端的活性差異與N端序列的差異有關(guān)。另外兩個為FAE1_CUT1_RppA和ACP_syn_Ⅲ與脂肪酸合成 相關(guān)。

由SOPMA預(yù)測結(jié)果可知(圖5)，BsCHS二級結(jié)構(gòu)組成中比例最高的為α螺旋，占44.25%；其次為無規(guī)則卷曲占36.06%，延伸鏈占 14.32%，最少的為β轉(zhuǎn)角占5.37%。

2.3.4 BsCHS三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定著蛋白質(zhì)的功能，因此研究其高級結(jié)構(gòu)對認(rèn)識蛋白質(zhì)功能，了解蛋白質(zhì)作用方式具有重要意義[14]。利用SWISS-MODEL在線預(yù)測系統(tǒng)的同源建模法構(gòu)建BsCHS的三級結(jié)構(gòu)，參考模板為水稻(OryzaSativa)中的4yjy.1.A查爾酮合酶，序列相似性為57.62%。結(jié)果顯示(圖6)BsCHS為二聚體蛋白，各二級結(jié)構(gòu)含量也與SOPMA預(yù)測結(jié)果相吻合。

2.4 BsCHS蛋白的分子進(jìn)化分析

以單子葉植物玉米CHS蛋白序列為外類群，與薔薇目的大豆、綠豆，管狀花目的煙草、黃芩，百合超目的虎眼萬年青、黑麥，蓼目的虎杖、苦蕎麥，以及中央種子目的甜菜、菠菜、石竹等中的CHS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示(圖7)雖BsCHS蛋白單獨(dú)聚為一支，但與同為中央種子目的植物親緣關(guān)系較近，符合系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

2.5 BsCHS在不同花色中的表達(dá)模式

利用qRT-PCR技術(shù)檢測BsCHS基因在不同顏色三角梅苞片及葉片中的表達(dá)情況(圖8)，以表達(dá)量最低的紅色葉片為參照，進(jìn)行其他材料中表達(dá)量的計(jì)算。結(jié)果顯示BsCHS基因在黃色、白色及紫色三角梅中表達(dá)量較高，其中在黃色三角梅葉片及苞片中的表達(dá)量是紅色葉片的24倍及22倍，而粉色苞片中的表達(dá)量是葉片中的10倍。大部分苞片表達(dá)量高于葉片，因此推測苞片比葉片更適用于研究三角梅花青素合成途徑，且黃色及白色可優(yōu)先考慮作為藍(lán)色三角梅轉(zhuǎn)基因受體，但還需進(jìn)一步對其色素種類及含量進(jìn)行研究來確定。

3 討 論

隨著人們生活水平的不斷提高，對新異花卉品種的追求越來越強(qiáng)烈，其中藍(lán)色花卉更是廣受歡迎。研究表明藍(lán)色花的形成需要一種花青素——飛燕草素及適合的呈色環(huán)境。三角梅之所以沒有藍(lán)色的花，主要原因是使其呈色的色素為甜菜色素，該色素與花青素排斥分布，在同一植物中無法同時合成這兩種色素[15]。但有報(bào)道顯示積累甜菜色素的植物也可以合成黃酮，類黃酮甚至原花青素，而其最后一步花青素合酶的缺失可能是導(dǎo)致其不能合成花青素的原因[16]。基于基因工程手段的分子育種可打破此現(xiàn)狀，通過對代謝途徑的調(diào)控改造達(dá)到目的產(chǎn)物的合成，從而實(shí)現(xiàn)花色定向培育。然而花青素合酶的轉(zhuǎn)化需要受體本身可以合成其催化底物。CHS作為花青素合成途徑的核心酶，一方面其可以為花青素苷的合成提供前體物質(zhì)，另一方面其自身表達(dá)量的高低也會影響花色的呈現(xiàn)[17]。因此研究花卉CHS基因?qū)ㄉ牧季哂兄匾饬x。

中央種子目植物(除了石竹科Caryophyllaceae和粟米草科Molluginaceae)是被子植物中唯一一個以甜菜色素為主要花色素的目，其中藜科已有CHS基因序列的相關(guān)報(bào)道，而紫茉莉科中尚未見報(bào)道，本研究首次從紫茉莉科植物中獲得了CHS基因。該基因含有一個1 176 bp的開放閱讀框，編碼43.96 ku的蛋白，對其三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測表明其含有2個亞基，該結(jié)果與Springob等[18]的研究結(jié)果相符，他們通過X-射線衍射研究

CHS蛋白三維結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)CHS是一個二聚體蛋白，且每個亞基分子質(zhì)量在40～50 ku之間；對蛋白性質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明BsCHS為親水性蛋白，與方建[19]及馮立娟等[20]對CHS基因克隆研究結(jié)果一致；通過信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析，BsCHS屬于細(xì)胞質(zhì)蛋白符合前人報(bào)道[21]；序列比對及結(jié)構(gòu)域分析表明BsCHS含有查爾酮合酶特征保守結(jié)構(gòu)域及活性中心保守氨基酸，以上結(jié)果顯示本研究篩選獲得的三角梅CHS基因符合植物CHS基因特性，具有CHS生物活性，可用于后續(xù)研究。

次生代謝物的合成需要經(jīng)過多個復(fù)雜且多分支的途徑，對這些途徑中限速酶的研究鑒定是解析代謝途徑的關(guān)鍵步驟。關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的高低會影響代謝產(chǎn)物的積累，因此本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測了BsCHS基因在不同花色三角梅中的表達(dá)情況，以期獲得最適的轉(zhuǎn)基因受體，結(jié)果顯示在黃色三角梅苞片及葉片中BsCHS的表達(dá)量均較高，推測其可以為飛燕草素的合成提供更多的前體物質(zhì)，更適用于三角梅花青素合成途徑的研究，后續(xù)可通過高效液相色譜等方法進(jìn)行代謝物含量測定以驗(yàn)證該推測。

花色改良一直是花卉育種者的研究熱點(diǎn)，傳統(tǒng)育種方式受到多種因素的限制，難以有大突破，基于現(xiàn)代生物技術(shù)的分子育種為花卉育種提供了新思路。本研究對三角梅CHS基因的研究，為三角梅新花色的培育提供了新方向，但仍需進(jìn)一步對BsCHS基因功能進(jìn)行驗(yàn)證及研究如何抑制甜菜色素合成途徑讓代謝流進(jìn)入花青素合成途徑，才能最終達(dá)到對藍(lán)色三角梅培育的目的。