5種蘋果野生資源果實(shí)香氣物質(zhì)的分析

杜 薇，陳麗娟，李 瑞，田曉寧，劉翠華，任小林

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

蘋果營養(yǎng)價(jià)值高、生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)、耐貯性強(qiáng)、供應(yīng)周期長，是世界四大水果之一，深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1]。蘋果是中國產(chǎn)量最高的水果，占全國水果(含瓜果類)總產(chǎn)量的15.81%。同時(shí)，蘋果果樹也是目前種植面積最大、經(jīng)濟(jì)地位最重要的果樹。蘋果樹在很多方面有著重大作用，包括擴(kuò)大出口創(chuàng)匯、促進(jìn)農(nóng)民脫貧致富、發(fā)展中國農(nóng)村經(jīng)濟(jì)、改善生態(tài)環(huán)境等。蘋果的香氣品質(zhì)是影響果品鮮食、加工的重要因素，也是研究蘋果品質(zhì)和果品深加工重要理論依據(jù)之一[2-3]。對(duì)于蘋果香氣物質(zhì)的研究，目前主要是在栽培品種上，在野生品種上的研究比較少[4]。然而蘋果具有豐富的野生資源，包括5組40余個(gè)種，且與蘋果栽培品種進(jìn)化中關(guān)系最近的是真正蘋果組中蘋果系的資源[5-8]。本試驗(yàn)以蘋果系的楸子 (Malusprunifolia)、海棠花 (Malusspectabilis)、西府海棠 (Malusmicromalus)、花紅(Malusasiatica)和新疆野蘋果(Malussieversii)為研究對(duì)象，通過比較分析蘋果系5個(gè)不同種果實(shí)香氣物質(zhì)的組成、含量以及它們之間香氣物質(zhì)的差異，同時(shí)結(jié)合不同種果實(shí)特征進(jìn)行香氣分析，為蘋果野生資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材 料 楸子、新疆野蘋果、西府海棠、海棠花、花紅的果實(shí)采于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場。在蘋果果實(shí)成熟期采收果實(shí) 1～2 kg(要求健康、無病蟲害、無機(jī)械損傷)，帶回實(shí)驗(yàn)室后，挑選外觀大小和成熟度一致的著色均勻的果實(shí)。

1.1.2 試 劑 內(nèi)標(biāo)3-壬酮、計(jì)算保留指數(shù)(retention index，RI)的C7-C30飽和系列烷烴以及香氣物質(zhì)的定性和定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：己醛、1-丁醇、1-戊烯-3-醇、異戊酸香葉酯、反式-2-己烯醛、辛醛、己醇、壬醛、苯甲醛、己酸己酯、法呢烯、法尼醇均購自Sigma-Aldrich公司(上海，中國)；反式-2-癸烯醛、乙酸丁酯、2-甲基-1-丁醇、反式-2-己烯醇、辛酸、麝香草酚購自Alfa Aesar公司(天津，中國)；提取香氣物質(zhì)的溶劑甲基叔丁基醚(MTBE)購自美國Tedia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS(ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀)購自美國Thermo Fisher公司、D-37520型離心機(jī)購自美國Thermo Fisher公司、SB25-12DTD超聲波清洗儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司、MD-200干式氮吹儀購自杭州奧盛儀器有限 公司。

1.3 方 法

1.3.1 果實(shí)取樣 果實(shí)躍變期時(shí)，取楸子、海棠花、西府海棠、花紅、新疆野蘋果果實(shí)各20個(gè)，用打孔器進(jìn)行打孔取樣，并將獲得的樣品在液氮中冷凍，每個(gè)樣品設(shè)置 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，隨后將其存入-80 ℃ 環(huán)境中，用于香氣物質(zhì)的提取。

1.3.2 香氣物質(zhì)的提取 方法參考石金瑞等[9]液—液溶劑萃取法，萃取溶劑為 MTBE。

將樣品置于研缽中，加入液氮研磨成均勻粉末狀；稱取2 g研磨后樣品置于10 mL離心管內(nèi)，加入 3 mL 的蒸餾水后將其震蕩混勻；分別取 3 mL MTBE溶液與10 μL內(nèi)標(biāo)[V(3-壬酮)∶V(甲醇)= 5∶30 000]至樣品所在10 mL離心管內(nèi)，25 ℃下超聲波清洗儀中萃取 30 min ；萃取后離心15 min(4 ℃，11 000 r/min)；取900 μL的上清液在氮吹儀中緩慢濃縮至300 μL；樣品存入內(nèi)置200 μL玻璃內(nèi)襯管的2 mL 進(jìn)樣瓶中，待測。

1.3.3 色譜條件 色譜柱為VF-WAXms 柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升溫程序初溫 40 ℃ 并保持 3 min，然后以5 ℃/min 升至 150 ℃，以 8 ℃/min 升至 220 ℃，并保持10 min；進(jìn)樣口溫度為230 ℃；進(jìn)樣量為1 μL；載氣為高純度He，載氣流量流為1 mL/min，進(jìn)樣時(shí)不分流。

1.3.4 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源，電子能量為 70 eV，激活電壓為 1.5 eV，離子源溫度為 240 ℃，傳輸線溫度為 240 ℃，質(zhì)量掃描范圍為33～380 m/z，掃描時(shí)間從 4 min 開始。

1.3.5 定性定量分析 香氣物質(zhì)定性：對(duì)照NIST/EPA/NIH質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST2014)進(jìn)行解譜分析，并通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)結(jié)合香氣物質(zhì)的 RI 進(jìn)行定性。

香氣物質(zhì)定量：用MTBE 溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)試劑[V(標(biāo)樣)∶V(MTBE)=1∶150 000]，而后加入內(nèi)標(biāo)[V(3-壬酮∶V(MTBE)=1∶900 000)]。取 1 μL 標(biāo)準(zhǔn)試劑混合液用于 GC-MS 分析，條件同上[10-11]。使用相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)試劑的校正因子(correct factor，CF)對(duì)各香氣組分進(jìn)行定量計(jì)算。其公式為：CF=[(C1/A1)/(C2/A2)]。C1：標(biāo)準(zhǔn)試劑濃度，C2：內(nèi)標(biāo)濃度，A1：選擇離子模式下標(biāo)準(zhǔn)試劑的峰面積，A2：內(nèi)標(biāo)峰面積，3-壬酮的QI=113[11-12]。各香氣組分計(jì)算公式為：C3=CF· A3·C4/A4。C3：被測香氣組分濃度；CF ：被測組分校正因子；A3：被測組分在選擇離子下的峰面積；C4：樣品內(nèi)標(biāo)濃度；A4：樣品內(nèi)標(biāo)峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

GC-MS 原始數(shù)據(jù)文件經(jīng) Xcalibur 和 AMDIS 解析后，采用Microsoft Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步整理和分析。采用SPSS 22對(duì)不同香氣總量進(jìn)行主成分分析和載荷分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種野生資源香氣物質(zhì)比較

2.1.1 5種野生資源香氣成分的差異 如表1 所示，在花紅、新疆野蘋果、西府海棠、海棠花和楸子果實(shí)中共檢測到27 種香氣物質(zhì)，包括醇類 6 種、醛類 7 種、酯類 4 種、有機(jī)酸 4 種、萜烯類 2 種以及苯衍生物 4 種，其中共有的香氣物質(zhì)為反式-2-己烯醛、辛酸、α-法呢烯、苯酚以及對(duì)甲苯酚。海棠花果實(shí)的香氣物質(zhì)種類最多，共檢測到 20 種香氣物質(zhì)，其中醇類 5 種、醛類 5 種、酯類 2 種、有機(jī)酸 3 種、萜烯類2 種、苯衍生物 3 種。其次為新疆野蘋果，果實(shí)中共檢測到 15 種香氣物質(zhì)，其中醇類 4 種、醛類 3 種、酯類 1 種、有機(jī)酸 2 種、萜烯類2 種、苯衍生物 3 種?；t果實(shí)與西府海棠果實(shí)中均鑒定出 14 種香氣物質(zhì)，但種類有所不同：花紅果實(shí)香氣物質(zhì)組成為醇類4 種、醛類4 種、有機(jī)酸2 種、萜烯類1 種、苯衍生物3 種；而西府海棠果實(shí)香氣物質(zhì)組成為醇類 2 種、醛類 5 種、酯類 1 種、有機(jī)酸 2 種、萜烯類 1種、苯衍生物 3 種。楸子果實(shí)中鑒定出的香氣物質(zhì)種類最少，只有 11 種，其中包括醇類 2 種、醛類 2 種、酯類 2 種、有機(jī)酸 2 種、萜烯類 1 種、苯衍生物 2 種。

2.1.2 5種野生資源香氣組成的特點(diǎn) 5種蘋果果實(shí)的香氣成分含量上存在明顯差異。其中海棠花果實(shí)中香氣物質(zhì)總含量最高，為 48 167.11 μg/kg，是花紅果實(shí)香氣物質(zhì)總含量的 6 倍，楸子果實(shí)香氣物質(zhì)總含量的 5 倍。其次是新疆野蘋果與西府海棠，它們果實(shí)中香氣物質(zhì)總含量分別為 16 489.93 μg/kg、13 362.83 μg/kg。楸子果實(shí)香氣物質(zhì)總含量較低，為 9 598.65 μg/kg，而花紅果實(shí)香氣物質(zhì)總含量最低，只有 7 902.94 μg/kg (表 1)。

表1 5種野生資源蘋果果實(shí)香氣成分Table 1 Aroma constitutions of five wild apple species

通過比較這 5 種果實(shí)香氣物質(zhì)組成和含量發(fā)現(xiàn)，它們所含主要的香氣物質(zhì)各不相同。花紅果實(shí)中含量最高的一類香氣物質(zhì)是醛類物質(zhì)，占總含量的56.03%，其中反式-2-己烯醛和己醛分別占總含量的 35.88%和15.84%；其次為萜烯類和苯衍生物類物質(zhì)，分別占總含量的 12.92%和18.74%。醛類物質(zhì)同時(shí)也是西府海棠和楸子中香氣物質(zhì)含量最高的種類，分別占西府海棠和楸子總香氣物質(zhì)的 47.62%和44.06%。而萜烯類物質(zhì)是新疆野蘋果與海棠花中最主要的一類香氣物質(zhì)，分別占新疆野蘋果與海棠花總香氣物質(zhì)含量的 64.34% 和 77.16%，其中 α-法呢烯在新疆野蘋果和海棠花總香氣物質(zhì)含量中分別高達(dá) 63.72% 和77.08%，為含量最高的香氣物質(zhì) (圖1)。

2.2 5種野生資源特征香氣差異

香氣值(odor activity value，OAV)為某種化合物的濃度與該化合物香氣閾值的比值，香氣值(OAV)大于1的成分為特征香氣成分[13]。其中香氣閾值是指嗅覺器官感覺到氣味時(shí)，嗅感物質(zhì)的最低濃度。香氣的相對(duì)貢獻(xiàn)采用香氣值歸一化法確定，香氣值越大，貢獻(xiàn)率越大[14]。5 個(gè)野生蘋果種果實(shí)香氣成分中 OAV 值大于 1 的香氣物質(zhì)共有 8 種，分別是法呢醇、己醛、反式-2-己烯醛、辛醛、壬醛、反式-2-癸烯醛、乙酸丁酯和己酸己酯(表2)。

表2 5種蘋果果實(shí)特征香氣物質(zhì)的香氣值Table 2 Characteristic aroma compounds OAV of five apple species

2.2.1 海棠花特征香氣物質(zhì) 海棠花的特征香氣物質(zhì)有6種，分別是法呢醇、己醛、反式-2-己烯醛、壬醛、反式-2-癸烯醛、己酸己酯，醛類物質(zhì)是主要的特征香氣物質(zhì)，香氣貢獻(xiàn)率高達(dá)85.37%，其中反式-2-己烯醛的香氣值為331.64，香氣貢獻(xiàn)率為53.92%。而法呢醇是主要的醇類特征香氣物質(zhì)，香氣貢獻(xiàn)率為13.64%，己酸己酯是主要的酯類特征香氣物質(zhì)，香氣貢獻(xiàn)率為5.49%。

2.2.2 西府海棠和花紅蘋果特征香氣物質(zhì) 西府海棠的特征香氣物質(zhì)有5種，分別是法呢醇、反式-2-己烯醛、壬醛、辛醛、己酸己酯。其中醛類物質(zhì)的香氣值最高為457.75，貢獻(xiàn)率高達(dá)96.60%?；t蘋果的特征香氣物質(zhì)有兩種，分別是己醛與反式-2-己烯醛，香氣值分別為119.92、166.78，貢獻(xiàn)率分別為41.53%、58.10%。

2.2.3 新疆野蘋果和楸子特征香氣物質(zhì) 新疆野蘋果和楸子的特征香氣物質(zhì)都有4種，但種類以及各香氣物質(zhì)的香氣值，貢獻(xiàn)率各不相同。新疆野蘋果的特征香氣物質(zhì)有法呢醇、反式-2-己烯醛、壬醛和己酸己酯，其中反式-2-己烯醛的貢獻(xiàn)率最高為49.11%，其次為壬醛、法呢醇，貢獻(xiàn)率分別是27.99%、20.77%。楸子的特征香氣物質(zhì)有法呢醇、己醛、反式-2-己烯醛和乙酸丁酯，其中己醛與反式-2-己烯醛這兩個(gè)醛類物質(zhì)的香氣值比較高，分別為71.69、204.51，貢獻(xiàn)率分別為 23.15%、66.04%。

2.3 主成分分析

對(duì)香氣值(OAV)大于1的香氣物質(zhì)(表2)進(jìn)行主成分分析(PCA)，共計(jì)8種香氣物質(zhì)。以各香氣物質(zhì)的香氣值為測定指標(biāo)，當(dāng)累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85%以上時(shí)，確定主成分的個(gè)數(shù)[15]。

由表3可知前3個(gè)主成分表達(dá)了原有數(shù)據(jù)90.09%的信息量，表明主成分分析能夠較好地將原始信息約化在主分量中[15]，所以本研究選擇前3個(gè)為主成分(PCA)。

表3 主要香氣化合物相關(guān)矩陣特征值Table 3 Related eigenvalues of matrix in main aroma components

表4為各主成分的因子載荷量，分析可知第一主成分(PC1)代表己酸己酯(0.995)、壬醛 (0.962)、法呢醇(0.951)；第二主成分(PC2)代表反式-2-癸烯醛(0.836)、己醛(0.793)、反式-2-己烯醛(0.748)；第三主成分(PC3)代表為辛醛 (0.852)、乙酸丁酯(0.596)。將3個(gè)主成分所代表香氣化合物歸成3類，即以PC1代表的化合物為第一類；以PC2代表的化合物為第二類；以PC3代表的化合物為第三類。

表4 主成分的因子載荷量Table 4 Factor load of principal components

圖2是5種蘋果對(duì)第一主成分和第二主成分的散點(diǎn)圖，根據(jù)第一和第二主成分散點(diǎn)分析結(jié)果，可將5種果實(shí)的香型分為3類，海棠花為一類；花紅、西府海棠、楸子為一類；新疆野蘋果為一類。

結(jié)合圖2與圖3可知，海棠花組含有的3類香氣物質(zhì)總香氣值最高為614.46，且各類香氣物質(zhì)的含量與其他4個(gè)種相比，也是最高的。其中第一類香氣物質(zhì)的總香氣值(173.62)是西府海棠(47.16)和楸子(31.53)的約3～4倍；第二類香氣物質(zhì)的總香氣值(440.84)是花紅(286.01)的1.5倍。其次海棠花各類香氣物質(zhì)的總香氣值中第二類香氣物質(zhì)的最高，其次為第一類香氣物質(zhì)。

花紅、西府海棠、楸子組中第二類香氣物質(zhì)(反式-2-癸烯醛、反式-2-己烯醛、己醛)總香氣值最高，而第一類香氣物質(zhì)(己酸己酯、壬醛、法呢醇)總香氣值很低，甚至是在花紅果實(shí)中未檢測到第一類香氣物質(zhì)。新疆野蘋果組最主要的特點(diǎn)是果實(shí)第一類香氣物質(zhì)的總香氣值與第二類香氣物質(zhì)的總香氣值相近，分別為壬醛和法呢醇、反式-2-己烯醛。

3 討 論

蘋果中已經(jīng)鑒定出 300 多種香氣物質(zhì)，包括酯類、醛類、醇類、酮類、萜烯類等，其中酯類、醇類、醛類是主要的香氣物質(zhì)[16]。根據(jù)特征香氣物質(zhì)的組成不同，可將蘋果分為兩類：一類是以酯類物質(zhì)為主的“酯香型”，如美國的元帥系蘋果；另一類是以醇類物質(zhì)為主的“醇香型”。而根據(jù)人們對(duì)不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的香氣物質(zhì)的感覺不同，又可將水果香氣劃分為“果香型”“清香型”“辛香型”和“醛香型”等[15]。其中“果香型”化合物是指那些有成熟水果香氣且伴有香甜氣味的物質(zhì)，如乙酸丁酯、乙酸乙酯等各種酯類物質(zhì)；“清香型”化合物是指具有綠色植物清香氣，能使人聯(lián)想到剛采摘下來的草或樹葉的香氣的物質(zhì)，大多為C6及C9的醛類、醇類物質(zhì)[17-21]。

本研究中的 5 個(gè)野生蘋果種果實(shí)共有的香氣物質(zhì)為反式-2-己烯醛、辛酸、α-法呢烯、苯酚以及對(duì)甲苯酚。苯甲醛為花紅蘋果的特有的香氣物質(zhì)；2-苯基乙醇為新疆野蘋果特有的物質(zhì)；壬醛為西府海棠特有的香氣物質(zhì)；1-戊烯-3-醇、反式-2-癸烯醛、正戊酸為海棠花特有的香氣物質(zhì)；乙酸丁酯、鄰苯二甲酸二甲酯、庚酸為楸子特有的香氣物質(zhì)。5 個(gè)蘋果種果實(shí)香氣成分在物質(zhì)組成和含量上均有很明顯差異。其中海棠花香氣物質(zhì)總含量最高，香氣物質(zhì)種類最多，其次為新疆野蘋果與西府海棠，總含量最低的為花紅。醛類物質(zhì)是花紅、西府海棠、楸子的主要香氣物質(zhì)，含量占總含量的百分?jǐn)?shù)分別是56.03%、47.62%、44.06%。而萜烯類物質(zhì)是新疆野蘋果與海棠花的主要香氣物質(zhì)，分別占總含量的 64.34%、81.91%。通過對(duì) 5 種蘋果特征香氣物質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)，這 5 個(gè)野生蘋果果實(shí)的特征香氣物質(zhì)主要以反式-2-己烯醛等醛類物質(zhì)為主，酯類物質(zhì)含量低。且通過主成分分析發(fā)現(xiàn) 5 種蘋果果實(shí)香氣物質(zhì)以第二類香氣物質(zhì)為主，而第二類香氣物質(zhì)為反式-2-癸烯醛、反式-2-己烯醛、己醛，這與‘澳洲青蘋’的特征香氣成分相似，這 5 種野生蘋果果實(shí)香型也為 “清香型”，其主要特征香氣物質(zhì)為反式-2-己烯醛等醛類物質(zhì)，果實(shí)呈現(xiàn)清新淡雅的香氣特點(diǎn)[22]。

果實(shí)的香氣形成受多種因素的影響，果實(shí)成熟度[23]、外界環(huán)境因子、栽培條件、采后貯藏條件、品種[24]、砧木[25]等因素都會(huì)對(duì)水果香氣的形成造成一定的影響。因此本試驗(yàn)數(shù)據(jù)只能說明在一定條件下的這5個(gè)野生蘋果種果實(shí)的特征香氣成分。

4 結(jié) 論

花紅果實(shí)中共檢測出 14 種香氣物質(zhì)，其中主要是醛類，其次為萜烯類和苯衍生物類，特征香氣物質(zhì)是己醛與反式-2-己烯醛。 新疆野蘋果果實(shí)共檢測出 15 種香氣物質(zhì)，其中主要是萜烯類，其次為醛類和醇類，特征香氣物質(zhì)是法呢醇、反式-2-己烯醛、壬醛、己酸己酯。 西府海棠果實(shí)共檢測出 14 種香氣物質(zhì)，其中主要是醛類與萜烯類，其次為苯衍生物，特征香氣物質(zhì)是法呢醇、反式-2-己烯醛、壬醛、辛醛、己酸己酯。海棠花果實(shí)共檢測出 21 種香氣物質(zhì)，其中主要是萜烯類，其次為醛類，特征香氣物質(zhì)是法呢醇、己醛、反式-2-己烯醛、壬醛、反式-2-癸烯醛、己酸己酯。楸子果實(shí)共檢測出 11 種香氣物質(zhì)，其中主要是醛類，其次為萜烯類，特征香氣物質(zhì)為法呢醇、己醛、反式-2-己烯醛、乙酸丁酯。5 種蘋果野生資源果實(shí)香氣物質(zhì)組成和含量有顯著差異，其中海棠花香氣物質(zhì)總含量最高，其次為疆野蘋果與西府海棠，總含量最低的為花紅。5 種蘋果野生資源果實(shí)特征香氣物質(zhì)以反式-2-己烯醛等醛類物質(zhì)為主，屬于 “清香型”果實(shí)。