張澤華,萬淑媛,李 琴,劉福云,趙彩平
(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院,陜西楊凌 712100)
桃[Prunuspersica(L.)Batsch.]果實不耐貯藏,貨架期短,是制約桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問題之一。因此,研究桃果實的成熟軟化調(diào)控機制對延長貯藏期十分重要。
植物激素ABA對果實的成熟軟化具有重要的調(diào)控作用。研究表明,ABA可以通過調(diào)控乙烯、細胞壁、生長素和糖酸代謝相關(guān)基因來調(diào)控果實的成熟軟化[1-2]。Zhang等[3]對桃和葡萄的研究顯示,ABA主要在果實的成熟啟動階段起重要調(diào)控作用,但Jacqueline等[4]在鱷梨中的研究表明,ABA的高峰出現(xiàn)在乙烯高峰之后。
9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)是ABA合成途徑中的限速酶,對于ABA的合成至關(guān)重要[5-7]。NCED家族成員已在多個物種上被鑒定出來,且在進化上較為保守[3,5,7-10]。值得注意的是,NCED家族成員中不是每個都與ABA合成相關(guān)。比如,擬南芥上鑒定出的9個NCED成員,只有5個與ABA合成相關(guān)[5]。在鱷梨上,NCED2為組成型表達,由于缺乏葉綠體轉(zhuǎn)運肽,所以很可能不參與ABA的合成[4]。
NCED對于果實的成熟具有重要的作用。在番茄上,沉默SlNCED1會延緩果實成熟進程,使果實無法正常著色,質(zhì)地相關(guān)基因被下調(diào)[11]。此外,NCED基因表達也會受到外源ABA調(diào)節(jié)劑的影響。比如,外源ABA處理可以顯著提高草莓、櫻桃NCED基因的表達水平[12-13]。但有意思的是,在番茄上,外源ABA不會影響內(nèi)源ABA的積累和NCED的表達水平[3],說明不是所有的NCED都會響應(yīng)外源ABA。另外,沉默ABA代謝基因SlCYP707A2會導(dǎo)致SlNCED1表達水平上升,表明ABA在番茄體內(nèi)可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[11]。而在黃瓜果實未熟期噴施ABA,對黃瓜果實成熟沒有明顯的影響,但在轉(zhuǎn)色期噴施則可以使CsNCED1、CsNCED2基因的表達水平升高[14]。說明NCED響應(yīng)外源ABA可能與果實所處生理階段有關(guān)。近年來,關(guān)于桃上NCED的研究有一些報道,但不系統(tǒng)。首先,桃NCED基因是否響應(yīng)外源ABA,Soto等[1]的研究表明,NCED對外源ABA的響應(yīng)特性取決于桃果實發(fā)育的生理階段。其次,ABA如何調(diào)控桃果實的成熟,Wang等[15]的研究顯示,PpERF3可以結(jié)合在NCED2/3的啟動子上,正向調(diào)控NCED2/3的基因表達,說明乙烯與ABA可能協(xié)同調(diào)控桃果實的成熟。此外,桃上的NCED家族成員的系統(tǒng)鑒定還未見相關(guān)報道。NCED成員在不同桃品種之間是否存在不同的表達特性?不同的NCED成員之間對外源ABA的響應(yīng)是否一致?這些問題都還未解決。
因此,本研究鑒定桃中的NCED家族成員,并分析其在不同器官、果實不同發(fā)育階段以及在不同耐貯性桃果實中的表達特性,以期明確與桃果實成熟可能相關(guān)的NCED基因。
以桃栽培品種‘淺間白桃’(QJBT),‘秦王’(QW)和‘美秋’(QM)為試材,種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)桃種質(zhì)資源圃。
不同組織樣品的采集:以‘淺間白桃’品種為試材,采集根(須根,直徑2 mm左右)、莖(新梢)、葉(1 a生新梢上第2~4片成熟葉)、花(未完全展開的花)、果實(幼果)。
果實發(fā)育期樣品的采集:以‘秦王’桃品種為試材,采集花后65 d、95 d和110 d的桃果實。
不同耐貯性果實樣品的采集:采摘處于商品成熟期的不耐貯藏的‘淺間白桃’和極耐貯藏的‘秦王’桃果實?!疁\間白桃’果實在采收當(dāng)天及貯藏過程中每隔2 d取樣,‘秦王’每隔4 d取樣。
ABA處理及樣品采集:以‘美秋’為試材,在果實采收前一周,選擇樹型、長勢、樹齡一致的3棵桃樹,在每棵樹的2個主枝上,分別用50 μmol/L的ABA和清水噴施,每隔3 d噴施1次,共噴施2次。在商品成熟期采收果實,在采收當(dāng)天及貯藏過程中每隔2 d取樣。
1.3.1 桃NCED基因家族成員鑒定與生物信息學(xué)分析 在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(TAIR)下載所有的擬南芥NCED基因,以擬南芥AtNCED的基因序列在NCBI tblastn用于搜索桃基因組數(shù)據(jù)庫,桃基因的完整氨基酸序列從薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫(GDR)中獲得。所有檢索出的基因(E-value≤ 0.005)都利用DNAMAN軟件進行多重序列比對并使用保守結(jié)構(gòu)域進行分析,刪除不含保守結(jié)構(gòu)域的基因。使用SignalP 4.1Server分析信號肽。利用在線程序ExPASy ProtParam對PpNCED基因編碼蛋白的等電點和分子量進行分析。使用MapDraw軟件將基因定位到染色體,根據(jù)其在染色體上的位置對其進行命名。系統(tǒng)進化樹用MEGA 6.0軟件進行構(gòu)建,采用鄰接法(NJ),重復(fù)1 000次。
1.3.2 RNA提取和實時定量熒光PCR(qRT-PCR)分析 采用CTAB法提取RNA,通過凝膠電泳檢測總RNA的完整性,用紫外分光光度計來檢測OD260、OD280值,從而判斷RNA的純度和濃度。
表1 桃NCED基因家族定量引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR analysis of peach NCED genes family
用Excel 2010和Spss 22對試驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析,用Excel 2010繪圖。
2.1.1 桃NCED基因家族成員的鑒定 共鑒定出7個桃NCED基因家族成員:prupe.1G061300.1,prupe.1G255500.1,prupe.1G255500.2,prupe.2G014700.1,prupe.2G014700.2,prupe.4G082000.1,prupe.4G150100.1。所有成員均含有高度保守的視網(wǎng)膜色素上皮膜蛋白結(jié)構(gòu)域RPE65(圖1-a)。根據(jù)其染色體定位,分別命名為PpNCED1、PpNCED2a、PpNCED2b、PpNCED3a、PpNCED3b、PpNCED4和PpNCED5。NCED基因家族成員分布在3條桃染色體上,一號染色體上有3個PpNCED基因,二號和四號染色體上各有2個PpNCED基因(圖1-b)。7個NCED家族成員均無信號肽,PpNCED1~PpNCED5編碼的氨基酸長度為427~632 aa,預(yù)測蛋白的等電點為5.64~7.24,分子質(zhì)量為47.30~70.35 ku (表2)。
表2 NCED蛋白理化特性Table 2 Physical and chemical properties of NCED protein
2.1.2 基因系統(tǒng)進化樹分析 將桃、蘋果、葡萄、柑橘、櫻桃、梅、擬南芥上已報道的NCED基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明,PpNCED1與梅PmNCED6同源性最高;而PpNCED2a、PpNCED2b與擬南芥的AtNCED4高度同源,PpNCED3a、PpNCED3b與擬南芥的AtNCED1同源性較高;PpNCED4與櫻桃PacNCED5基因同源性最高;PpNCED5與梅PmNCED1高度同源。此外,根據(jù)擬南芥上NCED基因家族成員的分類,將桃上的NCED基因分為兩個亞家族。其中,PpNCED1、PpNCED4、PpNCED5屬于亞家族Ⅰ;PpNCED2a、PpNCED 2b、PpNCED3a、PpNCED3b屬于亞家族Ⅱ(圖1-c)。
如圖2所示,5個基因在不同的組織部位表達情況各不相同。其中,PpNCED1只在莖、葉中有表達。PpNCED2、PpNCED3均表現(xiàn)出在花中的表達量較高,在葉和莖中有少量表達,在根和幼果中表達量較低。PpNCED4在莖和花中表達量較高,在幼果中次之,在葉中表達量較低。PpNCED5在莖中大量表達,其次為根、花、幼果,在葉片中表達量較低。
為了研究NCED基因家族成員在桃果實發(fā)育階段中可能的作用,選取‘秦王’品種,分析花后65 d至果實成熟期NCED成員相對表達量的差異。圖3結(jié)果顯示,在花后65 d,果實中幾乎檢測不到PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5的表達豐度,而其后隨著果實的膨大和成熟,PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5均呈上調(diào)表達趨勢,且在果實成熟期達到表達高峰。
為了研究NCED基因家族成員在桃果實成熟軟化中可能的作用,本研究分析‘淺間白桃’‘秦王’和‘美秋’果實采后貯藏期間NCED成員相對表達量的差異。圖4結(jié)果顯示,在不耐貯桃‘淺間白桃’和耐貯藏的‘秦王’果實的采后貯藏期間,PpNCED2的相對表達量均呈緩慢下降趨勢,且在采收當(dāng)天表達量最高。而PpNCED3在‘淺間白桃’中的相對表達量從采后0~2 d先下降,第2天開始逐漸上升,在第6天達到表達高峰。PpNCED4、PpNCED5在‘淺間白桃’果實貯藏期間幾乎檢測不到表達量(圖4)。
PpNCED3、PpNCED4在‘秦王’果實貯藏期間的表達模式相似,均為雙峰曲線。PpNCED3的第一個表達高峰在采后第12天,第二個表達高峰在采后第24天。PpNCED4在采后第4天達到第一個表達高峰,此后迅速下降,在采后第20天達到第二個表達高峰。而PpNCED5在‘秦王’果實采收當(dāng)天表達量最高,之后逐漸下降,到采后第20天后呈緩慢上升趨勢(圖4)。
在‘美秋’果實采后貯藏期間,PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5整體均呈上調(diào)表達趨勢,PpNCED2、PpNCED3的表達量在貯藏的前2 d迅速升高,后呈下降趨勢,PpNCED3在貯藏末期表達量又升高。PpNCED4、PpNCED5表達量的變化趨勢較一致,均在采后的0~4 d表達量逐漸上升,在第4天后又均呈下降趨勢(圖5)。
試驗結(jié)果還表明,在不同桃品種果實中,NCED家族成員的表達豐度存在差異。PpNCED2在‘秦王’和‘美秋’果實貯藏期間的整體表達量顯著高于‘淺間白桃’;而PpNCED3在‘秦王’果實中的整體表達量低于‘淺間白桃’和‘美秋’。
為了進一步探究NCED基因家族成員在桃果實成熟軟化期間對外源ABA的響應(yīng)特性,對‘美秋’桃進行外源ABA處理。結(jié)果顯示,外源ABA處理后,貯藏期間桃果實硬度始終低于對照果實,且在采后0 d和2 d差異顯著。此外,ABA處理和對照果實均表現(xiàn)出從貯藏0~4 d乙烯釋放量緩慢升高,4 d~6 d迅速升高并出現(xiàn)峰值,且外源ABA處理果實的乙烯釋放高峰顯著高于對照。外源ABA處理后,在采收當(dāng)天,PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5的表達均被顯著促進;在貯藏第2天,PpNCED4、PpNCED5的表達量也顯著高于對照果實;而PpNCED2、PpNCED3在貯藏第2~4天的表達量被顯著抑制(圖5)??偟膩碚f,在貯藏前期,NCED家族成員表達量呈現(xiàn)出被外源ABA上調(diào)的趨勢,而中后期整體呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢。
桃果實深受消費者的喜愛,但其容易軟化腐爛是制約商品價值的重要原因。因此,關(guān)于桃果實成熟軟化的調(diào)控始終是一個研究熱點。ABA可以促進果實的成熟軟化,而NCED作為ABA合成途徑中的限速酶,在該調(diào)控途徑中尤為關(guān)鍵[5-7]。許多物種中已經(jīng)鑒定出了NCED基因家族成員,且各物種中的家族成員數(shù)目不同,這可能與染色體加倍有關(guān)[5,16-17]。在本研究中,共鑒定出7個NCED基因,并發(fā)現(xiàn)它們都在NCED的第一和第二亞家族內(nèi)。在桃中關(guān)于NCED的研究報道大都聚焦于NCED第一亞家族的成員[1,15,18],即本研究中鑒定出的PpNCED1、PpNCED4、PpNCED5。第二亞家族的成員相關(guān)報道較少。
系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明,PpNCED1與葡萄VvNCED6和擬南芥的AtNCED6的同源性較高。VvNCED6可能參與調(diào)控葡萄的花色苷的積累[19];而AtNCED6與擬南芥種子休眠相關(guān)[20]。在本研究中,PpNCED1在果實中幾乎不表達(圖2),說明PpNCED1可能不參與桃果實的成熟調(diào)控。PpNCED4與草莓FaNCED1同源性較高,F(xiàn)aNCED1在調(diào)控草莓果實成熟中發(fā)揮重要作用,沉默F(xiàn)aNCED1導(dǎo)致草莓內(nèi)源ABA水平降低及果實的不著色表型[21]。本研究中,PpNCED4在‘秦王’和‘美秋’成熟軟化期間均呈上調(diào)表達趨勢(圖4,圖5),說明其可能與桃果實成熟相關(guān)。PpNCED5與櫻桃的PacNCED1高度同源,PacNCED1在櫻桃果實成熟過程中具有重要作用[13],由此可以推斷桃PpNCED5也可能與桃成熟密切相關(guān)。
此外,本研究結(jié)果顯示,NCED基因家族成員的表達具有明顯的組織特異性,這與甜櫻桃中的研究結(jié)果相似[22]。在果實中表達的NCED基因家族成員數(shù)目在不同品種間也存在差異,在不耐貯藏的‘淺間白桃’果實中,只有PpNCED2、PpNCED3表達,而在極耐貯藏的‘秦王’果實和較耐貯藏的‘美秋’果實中,除PpNCED1外,其他NCED成員均有一定表達量(圖4,圖5)。
不同NCED成員在桃果實發(fā)育與成熟軟化過程中的表達模式既有相似之處,也存在差異。在果實發(fā)育過程中,PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5均表現(xiàn)出隨果實發(fā)育表達量升高,在成熟期達到表達高峰(圖3);在果實貯藏期間,PpNCED2、PpNCED5的表達量均呈下降趨勢(圖4)。番茄SlNCED1、柿子DkNCED1和甜櫻桃PacNCED1的表達量也表現(xiàn)出在果實綠熟期增加,在成熟轉(zhuǎn)變期達到高峰,后熟期迅速下降的趨勢[11,13,23]。而PpNCED2、PpNCED5在‘美秋’的成熟期間呈現(xiàn)出先升后降的趨勢,表明不同品種間的表達模式存在差異(圖5)。在‘秦王’和‘美秋’貯藏期間,PpNCED3、PpNCED4的表達量均表現(xiàn)出較為一致的雙峰曲線變化趨勢,且伴隨著表達量高峰的出現(xiàn),果實硬度迅速下降,因此,其可能與果實軟化相關(guān)(圖4,圖5)。
已有研究表明,ABA對NCED基因表達的調(diào)控與果實所處的發(fā)育階段有關(guān)。在桃果實膨大期(S3中期)噴施ABA,會抑制NCED基因的表達,而在S3/S4和S4時期,ABA處理后NCED基因表達量被上調(diào)[1]。在黃瓜果實未熟期噴施ABA對黃瓜果實成熟沒有明顯的影響,而在轉(zhuǎn)色期噴施則上調(diào)CsNCED1、CsNCED2基因的表達水平,促進黃瓜果實的成熟[14]。本研究結(jié)果顯示,在果實成熟前1周,外源噴施ABA后,果實硬度顯著降低,乙烯釋放峰值顯著升高,表現(xiàn)出對果實成熟有顯著的促進作用。外源ABA處理后,均表現(xiàn)出在貯藏早期顯著促進PpNCED家族成員的表達,而在貯藏中后期顯著抑制PpNCED家族成員的表達,可能是負(fù)反饋調(diào)節(jié)的結(jié)果(圖5)。植物體內(nèi)的激素水平需要保持穩(wěn)態(tài),比如,乙烯處理番茄可以通過上調(diào)SlACS2、SlACS4和下調(diào)SlACS6的轉(zhuǎn)錄來正向或負(fù)向調(diào)節(jié)乙烯的生物合成[24]。果實內(nèi)ABA的生物合成是否也存在這種調(diào)節(jié)機制還有待進一步研究。