p-香豆酸通過加速傷口處聚酚軟木脂和木質(zhì)素的沉積促進(jìn)馬鈴薯塊莖愈傷

梁偉，朱亞同，柴秀偉，孔蕊，李斌山，李永才，畢陽，Dov Prusky,2

-香豆酸通過加速傷口處聚酚軟木脂和木質(zhì)素的沉積促進(jìn)馬鈴薯塊莖愈傷

梁偉1，朱亞同1，柴秀偉1，孔蕊1，李斌山1，李永才1，畢陽1*，Dov Prusky1,2

1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，中國蘭州 730070；2Department of Postharvest Science of Fresh Produce, Agricultural Research Organization, Rishon LeZion 7505101, Israel

【目的】研究-香豆酸（-coumaric acid，-CA）處理對馬鈴薯塊莖傷口處聚酚軟木脂和木質(zhì)素積累的影響及相關(guān)機(jī)理?！痉椒ā坑?.5 mmol?L-1-CA浸泡切半‘大西洋’馬鈴薯塊莖10 min，以蒸餾水處理作為對照，于室溫條件下避光貯存進(jìn)行愈傷。測定損傷塊莖在愈傷期間的失重率以及損傷接種硫色鐮刀菌（）塊莖的病情指數(shù)，觀察傷口處聚酚軟木脂和木質(zhì)素的積累，測定傷口處苯丙烷代謝關(guān)鍵酶和過氧化物酶活性，以及苯丙烷代謝產(chǎn)物和H2O2含量。【結(jié)果】-CA處理顯著降低了損傷塊莖的失重率和損傷接種塊莖的病情指數(shù)，14 d時，處理塊莖的失重率和病情指數(shù)分別比對照低38.46%和43.18%。-CA處理加速了塊莖傷口處聚酚軟木脂和木質(zhì)素的積累，14 d時，處理塊莖的聚酚軟木脂和木質(zhì)素的細(xì)胞層厚度分別比對照高26.43%和30.26%。-CA處理還明顯提高了塊莖傷口處苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酰輔酶A連接酶和肉桂醇脫氫酶的活性，7 d時，處理塊莖的酶活性分別比對照高32.17%、23.51%、25.09%和23.08%。14 d時，-CA處理塊莖的肉桂酸、-香豆酸、咖啡酸和總酚含量分別比對照高34.26、38.29%、19.31%和41.04%；21 d時，處理塊莖的阿魏酸、芥子酸含量分別比對照高38.33%和20.47%。此外，-CA處理促進(jìn)了塊莖傷口處肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木質(zhì)素的積累，14 d時，處理塊莖的肉桂醇和木質(zhì)素含量分別高于對照36.93%和31.66%；21 d時，處理塊莖的松柏醇和芥子醇含量分別高于對照41.43%和34.05%。-CA處理還提高了塊莖傷口處H2O2含量和過氧化物酶活性，7 d時，處理塊莖的H2O2含量和過氧化物酶活性分別高于對照40.25%和27.01%。【結(jié)論】-CA處理可通過激活苯丙烷代謝，提高H2O2含量和過氧化物酶活性，促進(jìn)馬鈴薯塊莖傷口處聚酚軟木脂和木質(zhì)素的積累，從而加速塊莖愈傷。

-CA；馬鈴薯塊莖；愈傷；苯丙烷代謝

0 引言

【研究意義】愈傷是馬鈴薯塊莖采后的重要特性，通過在傷口表面形成愈傷組織，可有效降低水分蒸騰，阻止外界病原菌的侵染[1]。然而，塊莖在自然條件下愈傷需要較長時間[2]，因此，有必要采取措施加速馬鈴薯愈傷形成?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】-香豆酸（-Coumaric acid，-CA）是一種在植物中廣泛存在的酚類化合物，來源于苯丙烷代謝[3]。近年來人們發(fā)現(xiàn)，-CA處理能夠誘導(dǎo)棗對互隔交鏈孢（）引起的黑斑病[4]、甜櫻桃對灰葡萄孢（）引起的灰霉病[5]以及菠蘿對鳳梨鐮孢菌（）引起的心腐病的抗性[6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，-CA誘導(dǎo)抗性的機(jī)制與激活苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酰輔酶A連接酶[4]，促進(jìn)苯丙烷代謝相關(guān)基因、的表達(dá)，以及阿魏酸、香豆酸和芥子酸等酚類物質(zhì)的合成有關(guān)[7-8]。此外，-CA還可促進(jìn)棗果實中H2O2的積累[4]，提高棗以及甜櫻桃中過氧化物酶的活性和轉(zhuǎn)錄水平[4-5]?！颈狙芯壳腥朦c】盡管已有-CA誘導(dǎo)果實采后抗病性及相關(guān)機(jī)制的報道，但作為苯丙烷代謝的重要產(chǎn)物，-CA是否通過激活苯丙烷代謝進(jìn)而影響馬鈴薯塊莖愈傷尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗通過采用0.5 mmol?L-1-CA處理切半馬鈴薯塊莖，于室溫條件下避光貯存進(jìn)行愈傷，通過測定愈傷期間損傷塊莖的失重率和損傷接種塊莖的病情指數(shù)，觀察傷口處聚酚軟木脂和木質(zhì)素的積累，分析塊莖傷口處苯丙烷代謝關(guān)鍵酶和過氧化物酶活性，測定苯丙烷代謝產(chǎn)物及H2O2含量，評價-CA對馬鈴薯塊莖愈傷的影響。

1 材料與方法

試驗于2019年11月至2020年3月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后生物學(xué)與技術(shù)實驗室進(jìn)行。

1.1 材料

供試‘大西洋’馬鈴薯塊莖（L.cv.Atlantic），于2019年10月購自甘肅省定西市愛蘭馬鈴薯種業(yè)有限公司。選取外觀一致，大小均勻，無可見病害和機(jī)械損傷的塊莖用網(wǎng)袋包裝（每袋15 kg），于翌日運往冷庫中（（4±2）℃、RH 55%—65%）存放待用。

供試硫色鐮刀菌（Schlect）是甘肅省馬鈴薯塊莖干腐病主要致病菌，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，在PDA培養(yǎng)基上保存待用。

供試-CA購自上海麥克林生化科技有限公司（純度98%）。

1.2 方法

1.2.1 塊莖損傷及-CA處理 塊莖損傷參照Lulai等[9]的方法并作適當(dāng)修改。馬鈴薯沖洗干凈后浸泡于含1%次氯酸鈉的清水中進(jìn)行消毒。室溫下晾干后用不銹鋼刀片沿塊莖赤道將其切分為兩半。將切半后的塊莖浸泡于含0.5 mmol?L-1-CA的蒸餾水溶液中10 min（蒸餾水作為對照組），于室溫下再次晾干后，分批次放入打孔的黑色聚乙烯保鮮袋中，于室溫（（20±2）℃、RH 65%—75%）避光條件下進(jìn)行愈傷。

1.2.2 愈傷效果的比較

1.2.2.1 塊莖失重率的測定 采用稱重法。分別于愈傷的0、3、5、7、14和21 d用天平對塊莖稱重并計算失重率（%）。

1.2.2.2 損傷接種塊莖病情指數(shù)的測定 參照J(rèn)iang等[10]的方法并作適當(dāng)修改。將接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)7 d后加入含0.01（V/V）tween 80的無菌水10 mL，用玻璃棒攪拌混勻后用滅菌涂布器將孢子刮下并用4層紗布過濾到50 mL錐形瓶中，在振蕩器上振蕩30 s混勻后用血球計數(shù)板調(diào)整濃度至1×106spores/mL。分別于塊莖愈傷的0、3、5、7、14和21 d，將20 μL孢子懸浮液先滴加在切半塊莖傷口表面中部，然后用滅菌涂布器均勻涂抹，晾干后裝入打孔的黑色聚乙烯保鮮袋中，于室溫（（20±2）℃、RH 65%—75%）黑暗條件下培養(yǎng)7 d后觀察并按下式統(tǒng)計病情指數(shù)。每處理用塊莖18個，重復(fù)3次。

式中，發(fā)病級別的標(biāo)準(zhǔn)為：4級，塊莖傷口表面100%發(fā)?。?級，塊莖傷口表面75%的區(qū)域發(fā)??；2級，塊莖傷口表面50%的區(qū)域發(fā)病；1級，塊莖傷口表面25%的區(qū)域發(fā)??；0級，塊莖傷口表面不發(fā)病。

1.2.3 聚酚軟木脂及木質(zhì)素沉積觀察 聚酚軟木脂（suberin poly phenolic，SPP）在塊莖傷口處沉積的觀察參照LULAI等[11]的方法并略作修改。將塊莖采用雙面刀片（74-S，上海吉列有限公司）垂直傷口表面切出厚度0.2—0.3 mm的薄片。將切片置于載玻片上，滴加蒸餾水并蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡（BX53，Olympus，Japan）下觀察拍照，激發(fā)波長340—390 nm，接收波長420 nm。

木質(zhì)素的沉積觀察參照ALBA等[12]的方法并作適當(dāng)修改。在垂直傷口表面切出0.2—0.3 mm的薄片，蒸餾水沖洗8遍，置于載玻片上滴加1%（W/V）間苯三酚溶液及濃鹽酸染色1 min，在光學(xué)顯微鏡（BX53，Olympus，Japan）下拍照觀察。

參照VAN OIRSCHOT等[13]的方法通過IS Capture測定愈傷期間塊莖的SPP和木質(zhì)素細(xì)胞層厚度。

1.2.4 生化取樣 參照J(rèn)IANG等[10]的方法并作適當(dāng)修改。分別于愈傷的0、3、5、7、14和21 d時取傷口及傷口下3 mm厚的樣品，用液氮速凍并研磨成粉后裝入50 mL離心管，保存于-80℃超低溫冰箱。

人還應(yīng)該懂得自我開發(fā)、自我造就。往往自己內(nèi)在的潛能自己不一定清楚，要靠自己勤奮地學(xué)習(xí)，擴(kuò)展自己的知識和興趣來開發(fā)。興趣是很重要的，同時也是靠學(xué)習(xí)來加深和擴(kuò)展的，只要你有興趣，你就能鉆進(jìn)去，鍥而不舍，以至于成功。

1.2.5 苯丙烷代謝酶活性的測定 苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonia-lyase，PAL）的測定根據(jù)KOZUKUE等[14]的方法并略作修改。稱取1.0 g冷凍粉末，于5 mL的0.1 mol?L-1硼酸-硼砂冷緩沖液（pH 8.8，4%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP））、5 mmol?L-1-巰基乙醇和2 mmol?L-1乙二胺四乙酸（EDTA）中冰浴勻漿，靜置提取30 min后于12 000×離心30 min（4℃），上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系包括0.5 mL上清液、3 mL的50 mmol?L-1硼酸鈉緩沖液（pH 8.8）和0.5 mL的20 mmol?L-1苯丙氨酸（蒸餾水作為參照）。將體系混合10 s后迅速測定在290 nm吸光度作為初始值（OD0），然后37℃水浴1 h后在290 nm測定吸光度作為終止值（OD1）。以每小時吸光度變化0.01定義為一個酶活性單位（U），PAL活性用U?g-1FW表示。

肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）的測定根據(jù)LAMB等[15]的方法并略作修改。稱取1.0 g冷凍粉末，于3 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.8，含40 g?L-1PVP）、10 mmol?L-1-巰基乙醇、4 mmol?L-1MgCl2、5 mmol?L-1抗壞血酸、2 μmol?L-1NADPNa2、10 μmol?L-1Leupeptin（亮抑酶肽）、1 mmol?L-1苯甲磺酰氟化物（PMSF）和10%（V/V）的甘油中冰浴勻漿，靜置提取30 min后于12 000×離心30 min（4℃），上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系為1.0 mL粗酶液、5 mL的50 mmol?L-1Tris-HCl緩沖液，25℃水浴加熱30 min，向反應(yīng)體系中加入100 μL的6 mmol?L-1HCL終止反應(yīng)，于340 nm測定OD值，以Tris-HCl緩沖液作為對照組。以每分鐘吸光值變化0.01定義為一個酶活性單位（U），C4H活性以U?g-1FW表示。

4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase，4CL）的測定參照VOO等[16]的方法并作適當(dāng)修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL上海源葉生物科技有限公司的提取液，然后于4℃，12 000×離心30 min（4℃），上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：0.45 mL的7.5 μmol?L-1Mg2+（硫酸鎂或氯化鎂）、0.15 mL的50 nmol?L-1-香豆酸、0.15 mL的2.5 μmol?L-1ATP、0.15 mL的38 nmol?L-1CoA以及0.5 mL粗酶液。40℃下反應(yīng)10 min后，在333 nm處測定吸光度值。以每分鐘吸光值變化0.001定義為一個酶活性單位（U），4CL活性以U?g-1FW表示。

肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）的測定參照GOFFNER等[17]的方法并作適當(dāng)修改。稱取1.0 g冷凍粉末，于3 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.8，含40 g?L-1PVP）、15 mmol?L-1-巰基乙醇、10%偏聚乙二烯和2%（W/V）PEG中冰浴勻漿，靜置提取30 min后于12 000×離心30 min（4℃），上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：0.2 mL粗酶液，0.8 mL反應(yīng)液（含10 mmol?L-1煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷（NADP）、5 mmol?L-1反式肉桂酸），37℃水浴30 min，1 mol?L-1HCl終止反應(yīng)（如有沉淀，離心除去）后在400 nm處測吸光值，以0.2 mL PBS與0.8 mL反應(yīng)液為對照。以每分鐘吸光值變化0.001定義為一個酶活性單位（U），CAD活性以U?g-1FW表示。

過氧化物酶（peroxidase，POD）的測定參照VENISSE等[18]的方法并作適當(dāng)修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（含1 mmol?L-1PEG、1% Triton X-100和4% PVPP，pH 5.5）混勻后充分提取，10 000×條件下離心30 min（4℃），上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：500 μL粗酶液、3.0 mL的25 mmol?L-1愈創(chuàng)木酚，滴加300 μL的5 mmol?L-1H2O2啟動反應(yīng)，記錄反應(yīng)體系2 min內(nèi)在470 nm處吸光度值的變化。以每分鐘吸光值變化1定義為一個酶活性單位（U），活性以U?g-1FW表示。

1.2.6 愈傷組織中肉桂酸、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸和肉桂醇、松柏醇、芥子醇含量的測定 參照AYAZ等[19]方法并作適當(dāng)修改。稱取3.0 g冷凍粉末，加入3 mL 70%甲醇在40 Hz常溫超聲提取30 min，8 000×離心20 min（4℃），上清液經(jīng)濃縮儀濃縮后，用復(fù)溶液（甲醇﹕水﹕冰醋酸=70﹕30﹕1）溶至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜（BS-QT-013型，Biosharp，USA），將濾液轉(zhuǎn)移至2 mL自動進(jìn)樣瓶中。采用Waters Symmetry?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱進(jìn)行四元梯度超快速液相色譜儀（ACQUITY Arc，Waters，USA）分析。HPLC條件：以100%甲醇（A）和1%乙酸（B）為流動相。梯度洗脫程序為0—10 min：30% A、70% B；10—12 min：45% A、55% B；12—15 min：65% A、35% B；15—18 min：30% A、70% B；18—20 min：30% A、70% B；18—20 min：30% A、70% B。流速0.8 mL?min-1，進(jìn)樣量10 μL。芥子酸和咖啡酸在325 nm處檢測，阿魏酸在322 nm處檢測，對香豆酸在310 nm處檢測，肉桂酸在276 nm處檢測，松柏醇在263 nm處檢測，肉桂醇在273 nm處檢測，芥子醇在322 nm處檢測。通過對比標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時間來對其進(jìn)行定量測定。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中各個酚酸的濃度，酚酸含量以μg?g-1FW表示。

1.2.7 總酚和木質(zhì)素含量的測定 總酚含量測定參照SCALBERT等[20]的方法并略作修改。稱取冷凍粉末1.0 g于3 mL 0.5 %乙酸和70%丙酮混勻提取30 min，將混合液于4℃黑暗環(huán)境下放置24 h，8 000×離心30 min（4℃），收集上清液用于總酚和類黃酮的測定。測定體系：1 mL上清液、2 mL福林酚（1﹕10稀釋），2 mL7.5 %（W/V）Na2CO3，50℃靜置5 min，以甲醇作為參比空白，760 nm處測定吸光度。制定沒食子酸（gallate，GAE）標(biāo)準(zhǔn)曲線評估總酚含量，總酚含量以GAE mg/100 g FW表示。

木質(zhì)素含量測定參照MORRISSON[21]的方法并略作修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL預(yù)冷的95%的乙醇后離心，取沉淀物依次用95%乙醇﹕正己烷＝1﹕2（V/V）沖洗3次后置于烘箱中干燥。待沉淀充分干燥后取出，加入1 mL溴化乙酰冰醋酸（1﹕3（V/V））溶液并將反應(yīng)體系水浴30 min（70℃），接著加入1 mL 2 mmol?L-1NaOH終止反應(yīng)。然后分別依次加入2 mL冰醋酸和0.1 mL的7.5 mmol?L-1羥胺鹽酸后離心取上清液0.5 mL，冰醋酸定容至5 mL，280 nm下測定OD值。木質(zhì)素含量以O(shè)D280?g-1FW為單位。

1.2.8 H2O2含量的測定 H2O2含量的測定參考PROCHAZKOVA等[22]的方法并略作修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入丙酮后提取10 min，10 000×離心30 min（4℃），取上清液用于含量測定。反應(yīng)體系：1 mL上清液、100 μL 20% TiCL4、100 μL濃氨水，混合液反應(yīng)10 min后，離心10 min，取沉淀用丙酮洗滌3次，加2.0 mL濃硫酸（1 mmol?L-1）進(jìn)行溶解，410 nm測定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算H2O2含量，H2O2含量用μmol?g-1FW表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果

2.1 p-CA處理對愈傷期間損傷塊莖失重率和損傷接種塊莖病情指數(shù)的影響

失重率和病情指數(shù)是衡量塊莖愈傷效果的重要參照。-CA處理和對照塊莖的失重率在愈傷期間均呈上升趨勢，但處理塊莖的失重率在愈傷期間始終低于對照，14 d時比對照低38.46%（<0.05）（圖1-A）。隨著愈傷層的形成，處理和對照塊莖的病情指數(shù)均逐漸下降，但處理塊莖的病情指數(shù)在愈傷中后期始終低于對照，14 d時比對照低43.18%（<0.05）（圖1-B）。上述結(jié)果表明，-CA處理有效降低了塊莖的水分蒸騰和病情指數(shù)。

*代表顯著差異（P<0.05）。下同* indicate significant difference (P<0.05).The same as below

2.2 p-CA處理對愈傷期間損傷塊莖愈傷組織處SPP和木質(zhì)素沉積的影響

SPP和木質(zhì)素是塊莖傷口處愈傷組織的重要成分。愈傷期間，-CA處理和對照塊莖愈傷組織處的SPP沉積速度和積累量均逐漸增加，處理與對照的積累差異出現(xiàn)在愈傷3 d時，之后處理塊莖的沉積速度和積累量始終高于對照（圖2-A）。同樣，處理和對照塊莖的SPP細(xì)胞層厚度隨愈傷時間的延長不斷增加，處理塊莖的細(xì)胞層厚度在愈傷中后期始終高于對照，14 d時比對照高26.43%（<0.05）（圖2-C）。愈傷期間，處理和對照的木質(zhì)素沉積速度和積累量均逐漸增加，處理與對照的積累差異出現(xiàn)在愈傷3 d時，之后處理塊莖的沉積速度和積累量均高于對照（圖2-B）。同樣，處理和對照的木質(zhì)素細(xì)胞層厚度隨愈傷時間的延長不斷增加，處理的細(xì)胞層厚度在愈傷中后期始終高于對照，14 d時比對照高30.26%（<0.05）（圖2-D）。以上結(jié)果表明，-CA處理促進(jìn)了塊莖傷口處SPP和木質(zhì)素的沉積。

2.3 p-CA處理對愈傷期間塊莖傷口處苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性的影響

塊莖傷口處苯丙烷代謝關(guān)鍵酶的活性決定酚類物質(zhì)的合成水平。愈傷期間，-CA處理和對照塊莖傷口處的PAL活性均呈單峰型變化，分別在14和5 d時達(dá)到峰值，處理塊莖的活性在愈傷中后期始終高于對照，14 d時高出對照45.73%（<0.05）（圖3-A）。處理和對照塊莖的C4H和CAD活性均隨愈傷時間的延長而逐漸上升，處理塊莖的活性始終高于對照，14 d時分別比對照高33.36%和17.36%（< 0.05）（圖3-B、D）。愈傷期間，處理和對照塊莖的4CL活性在愈傷前期迅速上升，5 d時達(dá)到峰值，隨后趨于平穩(wěn)，處理組始終高于對照，5 d時比對照高28.43%（<0.05）（圖3-C）。上述結(jié)果表明，-CA處理激活了塊莖傷口處的PAL、C4H、4CL和CAD。

圖2 p-CA處理對馬鈴薯塊莖傷口處SPP和木質(zhì)素積累（A，B）以及細(xì)胞層厚度（C，D）的影響

2.4 p-CA處理對愈傷期間塊莖傷口處5種酚酸和總酚含量的影響

肉桂酸、-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸是苯丙烷代謝的產(chǎn)物，也是構(gòu)成聚酚軟木脂的重要單體。愈傷期間，-CA處理和對照塊莖傷口處的肉桂酸含量不斷增加，處理在愈傷后期（14—21 d）均顯著高于對照，14 d時比對照高34.26%（<0.05）（圖4-A）。處理和對照塊莖的-香豆酸和咖啡酸含量均隨著愈傷時間的延長不斷增加，處理在愈傷中后期顯著高于對照，14 d時分別比對照高38.29%和19.31%（<0.05）（圖4-B、C）。處理和對照塊莖的阿魏酸和芥子酸含量均隨愈傷時間的延長不斷提高，處理顯著高于對照，21 d時分別比對照高38.33%和20.47%（<0.05）（圖4-D、E）。處理和對照塊莖的總酚含量均隨愈傷時間的延長先上升后趨于平穩(wěn)，除第3天外，處理始終高于對照，14 d時比對照高41.04%（<0.05）（圖4-F）。以上結(jié)果表明，-CA處理促進(jìn)了塊莖傷口處肉桂酸、-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸以及總酚的合成。

2.5 p-CA處理對愈傷期間塊莖傷口處3種木質(zhì)素單體和木質(zhì)素含量的影響

肉桂醇、松柏醇和芥子醇是構(gòu)成木質(zhì)素的3種單體。-CA處理和對照塊莖傷口處的肉桂醇含量不斷增加，處理在愈傷中后期顯著高于對照，14 d時比對照高36.93%（<0.05）（圖5-A）。愈傷期間，處理和對照塊莖的松柏醇以及芥子醇的含量均不斷增加，在愈傷中后期，處理組的含量均高于對照，21 d時處理分別比對照高41.43%和34.05%（<0.05）（圖5-B、C）。愈傷期間，處理和對照塊莖的木質(zhì)素含量不斷增加，處理塊莖的木質(zhì)素含量在愈傷的中后期顯著高于對照，14 d時比對照高31.66%（<0.05）（圖5-D）。表明-CA處理促進(jìn)了塊莖傷口處肉桂醇、松柏醇、芥子醇以及木質(zhì)素的合成。

圖3 p-CA處理對馬鈴薯傷口處PAL（A）、C4H（B）、4CL（C）、CAD（D）活性的影響

2.6 p-CA處理對愈傷期間塊莖傷口處H2O2含量和POD活性的影響

H2O2和POD是參與塊莖傷口處酚類底物氧化交聯(lián)的重要成分。-CA處理和對照塊莖傷口處的H2O2含量均逐漸增加，愈傷中后期，處理組顯著高于對照，7 d時比對照高40.25%（<0.05）（圖6-A）。愈傷期間，處理和對照塊莖的POD活性均呈上升趨勢，處理組在愈傷中后期顯著高于對照，21 d時比對照高50.13%（<0.05）（圖6-B）。上述結(jié)果表明，-CA處理促進(jìn)了馬鈴薯塊莖傷口處H2O2的積累，激活了POD活性。

3 討論

本研究觀察到，-CA處理可有效降低馬鈴薯損傷塊莖愈傷期間的失重率（圖1-A），失重率降低的原因可能是因為-CA激活了苯丙烷代謝，促進(jìn)了酚類物質(zhì)的積累[7]，而酚類物質(zhì)又是SPP和木質(zhì)素合成的底物，由于傷口處SPP和木質(zhì)素的聚合從而有效抑制了水分經(jīng)由傷口的蒸騰[9]。-CA還可促進(jìn)茉莉酸的合成[8]，茉莉酸作為重要的植物激素可誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，從而減少水分經(jīng)由氣孔的蒸騰[23]。此外，-CA還具有抑制果實呼吸速率的作用，通過降低呼吸強(qiáng)度從而減少底物的消耗[24]。本研究還觀察到-CA處理有效降低了損傷接種馬鈴薯塊莖的病情指數(shù)，由于-CA可促進(jìn)塊莖傷口處SPP和木質(zhì)素的聚合，由此產(chǎn)生的物理屏障可有效抑制病原菌的侵染和擴(kuò)展[25]。-CA還可激活苯丙烷代謝，生成的酚酸和黃酮等物質(zhì)可直接抑制真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長[26]。此外，-CA還可促進(jìn)病程相關(guān)蛋白的積累，從而破壞病原真菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[4]。

圖4 p-CA處理對馬鈴薯傷口處肉桂酸（A）、p-香豆酸（B）、咖啡酸（C）、阿魏酸（D）、芥子酸（E）和總酚（F）含量的影響

苯丙烷代謝既為SPP和木質(zhì)素聚合提供所需底物，也可產(chǎn)生具有抗菌活性的酚類物質(zhì)[27]。PAL作為苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，催化L-苯丙氨酸脫氨基生成反式肉桂酸[28]，反式肉桂酸在C4H作用下羥基化生成-香豆酸，-香豆酸在香豆酸-3-羥基化酶作用下經(jīng)過羥基化和酯化生成咖啡酸，咖啡酸經(jīng)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶生成阿魏酸，阿魏酸首先羥化生成5-羥基阿魏酸，接著在5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶作用下催化生成芥子酸，而上述酚酸是SPP合成的重要單體[29-30]。然后，生成的這些酚酸在4CL的催化下分別生成肉桂酸-CoA、香豆酸-CoA、咖啡酸-CoA、阿魏酸-CoA和芥子酸-CoA，這些酚酸-CoA在CCR

圖5 p-CA處理對馬鈴薯傷口處肉桂醇（A）、松柏醇（B）、芥子醇（C）和木質(zhì)素（D）含量的影響

圖6 p-CA處理對馬鈴薯傷口處H2O2含量（A）和POD活性（B）的影響

的催化下分別形成芥子醛、松柏醛和香豆醛，又經(jīng)CAD作用轉(zhuǎn)化形成肉桂醇、松柏醇、芥子醇等木質(zhì)素合成的底物，然后在POD和漆酶催化下分別形成對-羥基苯基木質(zhì)素、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素和紫丁香基木質(zhì)素[31-32]。本研究觀察到，-CA處理激活了PAL、C4H、4CL和CAD（圖3），促進(jìn)了肉桂酸、-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸和總酚（圖4）以及肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木質(zhì)素（圖5）的合成。該結(jié)果與-CA處理提高棗和油菜苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性以及促進(jìn)苯丙烷代謝產(chǎn)物合成的結(jié)果類似[4,8]。有研究表明，-CA可促進(jìn)油菜中茉莉酸的合成，而茉莉酸作為重要的信號分子可激活苯丙烷代謝并促進(jìn)酚類物質(zhì)合成[8]。-CA還可通過上調(diào)油菜中R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來調(diào)控苯丙烷代謝并促進(jìn)酚類、類黃酮和花青素等的合成[8,33]。因此，推測-CA可能通過調(diào)控茉莉酸等植物激素合成，以及上調(diào)MYB等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來激活苯丙烷代謝。至于-CA如何調(diào)控馬鈴薯塊莖愈傷期間激素合成以及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)有待進(jìn)一步揭示。

SPP和木質(zhì)素是塊莖傷口處愈傷組織的主要成分[27]。SPP主要由羥基肉桂酸及其衍生物阿魏酸通過酯鍵和醚鍵連接形成，具有降低水分蒸騰，抑制病原菌侵染的功能[9]。木質(zhì)素主要由肉桂醇、松柏醇和芥子醇聚合形成，具有強(qiáng)化細(xì)胞壁，增加機(jī)械強(qiáng)度，維持植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性，形成物理屏障抑制病原菌的侵染和擴(kuò)展的功能[34]。H2O2和POD在SPP和木質(zhì)素單體氧化交聯(lián)中具有重要作用[35]。本研究觀察到，-CA處理顯著提高了塊莖傷口處H2O2含量，該結(jié)果與-CA處理提高棗果實H2O2含量的結(jié)果類似[4]。H2O2在馬鈴薯塊莖愈傷中具有雙重作用，不僅可作為信號分子促進(jìn)塊莖愈傷的防衛(wèi)應(yīng)答，又可以參與酚單體與芳香結(jié)構(gòu)域的氧化交聯(lián)[10,36]。馬鈴薯愈傷期間的H2O2主要來源于NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX），NOX通過給分子氧轉(zhuǎn)移電子產(chǎn)生超氧陰離子，后者由于存活壽命很短，很快在超氧化物歧化酶（SOD）的作用下被歧化為H2O2[27]。研究表明，-CA可上調(diào)棗果實中的表達(dá)，促進(jìn)H2O2積累[4]。因此，推測-CA可能在轉(zhuǎn)錄水平上通過提高SOD活性從而促進(jìn)H2O2的積累。同時，本研究還觀察到，-CA處理顯著提高了塊莖傷口處的POD活性，該結(jié)果與-CA處理提高甜櫻桃POD活性的結(jié)果類似[5]。-CA處理還可促進(jìn)棗果實表達(dá)，導(dǎo)致POD活性升高[4]。因此，推測-CA可能在轉(zhuǎn)錄水平上通過上調(diào)POD相關(guān)基因表達(dá)從而提高POD活性，至于-CA如何在轉(zhuǎn)錄水平上實現(xiàn)對馬鈴薯塊莖愈傷期間POD的調(diào)控則有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

愈傷期間，-CA處理激活了馬鈴薯塊莖傷口處苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL、C4H、4CL和CAD活性，促進(jìn)了傷口處肉桂酸、-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸和總酚以及肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木質(zhì)素的積累。-CA處理還提高了塊莖傷口處H2O2含量和POD活性，H2O2和POD通過氧化交聯(lián)酚酸和木質(zhì)素單體促進(jìn)了SPP和木質(zhì)素在傷口處的沉積，從而有效降低了愈傷期間損傷塊莖的失重率和損傷接種塊莖的病情指數(shù)，促進(jìn)了馬鈴薯的塊莖愈傷。

[1] BARROS J, SERK H, GRANLUND I, PESQUET E.The cell biology of lignification in higher plants.Annals of Botany, 2015, 115(7): 1053-1074.

[2] SCHREIBER L, FRANKE R, HARTMANN K.Wax and suberin development of native and wound periderm of potato (L.) and its relation to peridermal transpiration.Planta, 2005, 220(4): 520-530.

[3] BOZ H.-coumaric acid in cereals: Presence, antioxidant and antimicrobial effects.International Journal of Food Science and Technology, 2015, 50(11): 2323-2328.

[4] YUAN S Z, LI W S, LI Q Q, WANG L M, CAO J K, JIANG W B.-Coumaric acid and methyl-coumarate induce defense responses of jujube (Mill.) fruit against black spot rot caused by.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(10): 2801-2810.

[5] LIU X Y, JI D C, CUI X M, ZHANG Z Q, LI B Q, XU Y, CHEN T, TIAN S P.-Coumaric acid induces antioxidant capacity and defense responses of sweet cherry fruit to fungal pathogens.Postharvest Biology and Technology, 2020, 169: 111297.

[6] BARRAL B, CHILLET M, MINIER J, LéCHAUDEL M, SCHORR- GALINDO S.Evaluating the response toananatum inoculation and antifungal activity of phenolic acids in pineapple.Fungal Biology, 2017, 121(12): 1045-1053.

[7] ISLAM M T, LEE B R, DAS P R, LA V H, JUNG H, KIM T H.Characterization of-coumaric acid-induced soluble and cell wall-bound

phenolic metabolites in relation to disease resistance topv.campestris in Chinese cabbage.Plant Physiology and Biochemistry, 2018, 125: 172-177.

[8] ISLAM M T, LEE B R, DAS P R, LA V H, JUNG H, KIM T H.-Coumaric acid induces jasmonic acid-mediated phenolic accumulation and resistance to black rot disease in.Physiological and Molecular Plant Pathology, 2019, 106: 270-275.

[9] LULAI E C, NEUBAUER J D.Wound-induced suberization genes are differentially expressed, spatially and temporally, during closing layer and wound periderm formation.Postharvest Biology and Technology, 2014, 90: 24-33.

[10] JIANG H, WANG B, MA L, ZHENG X Y, GONG D, XUE H L, BI Y, ZHANG Z, PRUSKY D.Benzo-(1, 2, 3)-thiadiazole-7-carbothioic acid s-methyl ester (BTH) promotes tuber wound healing of potato by elevation of phenylpropanoid metabolism.Postharvest Biology and Technology, 2019, 153: 125-132.

[11] LULAI E C, MORGAN W C.Histochemical probing of potato periderm with neutral red: a sensitive cytofluorochrome for the hydrophobic domain of suberin.Biotechnic & Histochemistry, 1992, 67(4): 185-195.

[12] ALBA C M, FORCHETTI S M D, TIGIER H A.Phenoloxidase of peach () endocarp: Its relationship with peroxidases and lignification.Physiologia Plantarum, 2000, 109(4): 382-387.

[13] VAN OIRSCHOT Q E A, REES D, AKED J, KIHURANI A.Sweetpotato cultivars differ in efficiency of wound healing.Postharvest Biology and Technology2006, 42(1): 65-74.

[14] KOZUKUE N, KOZUKUE E, KISHIGUCHI M.Changes in the contents of phenolic substances, phenylalanine ammonialyase (PAL) and tyrosine ammonialyase (TAL) accompanying chilling injury of eggplant fruit.Scientia Horticulturae, 1979, 11: 51-59.

[15] LAMB C J, RUBERY P H.A spectrophotometric assay for trans-cinnamic acid 4-hydroxylase activity.Analytical Biochemistry, 1975, 68(2): 554-561.

[16] VOO K S, WHETTEN R W, O'MALLEY D M, SEDEROFF R R.4-coumarate: coenzyme A ligase from loblolly pine xylem (isolation, characterization, and complementary DNA cloning).Plant Physiology, 1995, 108(1): 85-97.

[17] GOFFNER D, JOFFROY I, GRIMA-PETTENATI J, HALPIN C, KNIGHT M E, SCHUCH W, BOUDET A M.Purification and characterization of isoforms of cinnamyl alcohol dehydrogenase fromxylem.Planta, 1992, 188(1): 48-53.

[18] VENISSE J S, GULLNER G, BRISSET M N.Evidence for the involvement of an oxidative stress in the initiation of infection of pear by.Plant Physiology, 2001, 125(4): 2164-2172.

[19] AYAZ F A, HAYIRLIOGLU-AYAZ S, GRUZ J, NOVAK O, STRNAD M.Separation, characterization, and quantitation of phenolic acids in a little known blueberry (L.) fruit by HPLC-MS.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(21): 8116-8122.

[20] SCALBERT A, MONTIES B, JANIN G.Tannins in wood: comparison of different estimation methods.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1989, 37(5): 1324-1329.

[21] MORRISON I M.A semi-micro method for the determination of lignin and its use in predicting the digestibility of forage crops.Journal of the Science of Food and Agriculture, 1972, 23: 455-463.

[22] PROCHAZKOVA D, SAIRAM R K, SRIVASTAVA G C, SINGH D V.Oxidative stress and antioxidant activity as the basis of senescence in maize leaves.Plant Science, 2001, 161(4): 765-771.

[23] F?RSTER S, SCHMIDT L K, KOPIC E, ANSCHüTZ U, HUANG S G, SCHLüCKING K, K?STER P, WAADT R, LARRIEU A, BATISTI? O, RODRIGUEZ P L, GRILL E, KUDLA J, BECKER D.Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK k+channels by a Ca2+sensor-kinase CBL1-CIPK5complex.Developmental Cell, 2019, 48(1): 87-99.

[24] 曹毛毛.p-香豆酸調(diào)控獼猴桃果實采后衰老的作用機(jī)制研究[D].西安: 西北大學(xué), 2019.

CAO M M.Mechanism of-coumaric acid regulation on postharvest senescence of kiwifruit [D].Xi’an: Northwest University, 2019.(in Chinese)

[25] BERNARDS M A, RAZEM F A.The poly(phenolic) domain of potato suberin: a non-lignin cell wall bio-polymer.Phytochemistry, 2001, 57(7): 1115-1122.

[26] MUSSATTO S I, DRAGONE G, ROBERTO I C.Ferulic and p-coumaric acids extraction by alkaline hydrolysis of brewer’s spent grain.Industrial Crops and Products, 2007, 25(2): 231-237.

[27] 姜紅, 王毅, 畢陽.馬鈴薯塊莖的愈傷過程、機(jī)制和影響因素.園藝學(xué)報, 2019, 46(9): 1842-1852.

JIANG H, WANG Y, BI Y.The process, mechanism and influential factors of wound healing of potato tubersActa Horticulturae Sinica, 2019, 46(9): 1842-1852.(in Chinese)

[28] DENG Y X, LU S F.Biosynthesis and regulation of phenylpropanoids in plants.Critical Reviews in Plant Sciences, 2017, 36(4): 257-290.

[29] VOGT T.Phenylpropanoid biosynthesisMolecular Plant, 2010, 3(1): 2-20.

[30] ARRIETA-BAEZ D, STARK R E.Modeling suberization with peroxidase-catalyzed polymeriz- etion of hydroxycinnamic acids: Cross-coupling and dimerization reactions.Phytochemistry, 2006, 67(7): 743-753.

[31] SOLER M, SERRA O, FLUCH S, MOLINAS M, FIGUERAS M.A potato skin SSH library yields new candidate genes for suberin biosynthesis and periderm formation.Planta, 2011, 233(5): 933-945.

[32] EISENSTADT M A, BOGOLITSYN K G.Peroxidase oxidation of lignin and its model compounds.Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2010, 36(7): 802-815.

[33] MITSUNAMI T, NISHIHARA M, GALIS I, ALAMGIR K M, HOJO Y, FUJITA K, SASAKI N, NEMOTO K, SAWASAKI T, ARIMURA G I.Overexpression of the PAP1 transcription factor reveals a complex regulation of flavonoid and phenylpropanoid metabolism inplants attacked by.PLoS ONE, 2014, 9(9): e108849.

[34] HAHLBROCK K, GRISEBACH H.Enzymic controls in the biosynthesis of lignin and flavonoids.Plant Physiology, 1976, 30: 105-130.

[35] BAJJI M, M′HAMDI M, GASTINY F, DELAPLACE P, FAUCONNIER M L, DU JARDIN P.Catalase inhibition alters suberization and wound healing in potato () tubers.Physiologia Plantarum, 2007, 129(3): 472-483.

[36] RAZEM F A, BERNARDS M A.Hydrogen peroxide is required for poly(phenolic) domain formation during wound-induced suberization.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(5): 1009-1015.

-Coumaric Acid Promoted Wound Healing of Potato Tubers by Accelerating the Deposition of Suberin Poly Phenolic and Lignin at Wound Sites

LIANG Wei1, ZHU YaTong1, CHAI XiuWei1, KONG Rui1, LI BinShan1, LI YongCai1, BI Yang1*, Dov Prusky1,2

1College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;2Department of Postharvest Science of Fresh Produce, Agricultural Research Organization, Rishon LeZion 7505101, Israel

【Objective】This study aimed to investigate the effect and related mechanism of-CA treatment on the accumulation of suberin polyphenolic and lignin at wound sites of potato tubers.【Method】The half cut potato tubers ‘cv.Atlantic’ were soaked with 0.5 mmol?L-1-CA for 10 min (using distilled water treated as control), which were stored at room temperature and protected from light for healing.The weight loss and the disease index of wounded tubers inoculated withwere determined, the deposition of suberin polyphenolic and lignin at wounded sites were observed, and the activity of the key enzymes of phenylpropane metabolism and peroxidase as well as the content of phenylpropane metabolism products and H2O2at wounded sites were measured.【Result】The weight loss and the disease index of wounded tubers were significantly reduced by-CA treatment, which were 38.46% and 43.18% lower than those of control on the 14 day of healing, respectively.-CA treatment accelerated the deposition of suberin polyphenolic and lignin at wound sites of potato tubers, and the thickness of cell layers in treated tubers were 26.43% and 30.26% higher than that under control on the 14 day of healing, respectively.-CA treatment also significantly increased the activities of phenylalanine ammonia lyase, cinnamic acid-4-hydroxylase, 4-coumaryl coenzyme A ligase and cinnamyl alcohol dehydrogenase at wounde sites of tubers, with the enzyme activities of the treated tubers being 32.17%, 23.51%, 25.09% and 23.08% higher than the control on 7 day, respectively.-CA treatment also promoted the synthesis of cinnamic acid,-coumaric acid, caffeic acid, ferulic acid, sinapic acid and total phenolics, with the contents of cinnamic acid,-coumaric acid, caffeic acid and total phenolics in the treated tubers on 14 day being 34.26%, 38.29%, 19.31% and 41.04% higher than that under control, respectively, and the contents of ferulic acid, sinapic acid in the treated tubers being 38.33% and 20.47% higher than that under control on 21 day, respectively.In addition,-CA treatment promoted the accumulation of cinnamyl alcohol, coniferyl alcohol, sinapis alcohol and lignin at wound sites, with the contents of cinnamyl alcohol and lignin in the treated tubers being 36.93% and 31.66% higher than that under control on 14 day, respectively, and the contents of coniferyl alcohol and sinapis alcohol in the treated tubers were 41.43% and 34.05% higher than the control on 21 day, respectively.The-CA treatment also increased the H2O2content and peroxidase activity at the wound sites, with the H2O2content and peroxidase activity of the treated tubers being 40.25% and 27.01% higher than that under control on 7 day, respectively.【Conclusion】The-CA treatment accelerated wound healing of potato tubers by activating phenylpropanoid metabolism, increasing H2O2content and peroxidase activity, and promoting the accumulation of suberin polyphenolic and lignin in potato tuber wound sites.

-CA; potato tuber; wound healing; phenylpropanoid metabolism

2020-12-18；

2021-04-25

國家自然科學(xué)基金（31772040）、甘肅省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（GARS-MLS-S）

梁偉，Tel：13709240527；E-mail：liangweigsau@163.com。通信作者畢陽，Tel：13119421362；E-mail：biyang@gsau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）