山羊TNNT3基因可變剪切及其對(duì)骨骼肌細(xì)胞分化的作用

陳媛，蔡禾，李利，王林杰，仲濤，張紅平

山羊TNNT3基因可變剪切及其對(duì)骨骼肌細(xì)胞分化的作用

陳媛，蔡禾，李利，王林杰，仲濤，張紅平*

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130

【目的】快速骨骼肌肌鈣蛋白T（fast skeletal troponin T3，TNNT3）作為肌鈣蛋白(troponin, Tn)家族成員，調(diào)節(jié)橫紋肌收縮、參與骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育并影響家畜肉質(zhì)性狀。通過(guò)獲得山羊TNNT3基因的可變剪切體，分析山羊TNNT3基因可變剪切的表達(dá)模式及其在肌細(xì)胞分化中的作用，深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制?！痉椒ā炕贜CBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列，使用軟件Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物，以簡(jiǎn)州大耳羊胚胎期和出生后7個(gè)階段骨骼肌為試驗(yàn)材料，克隆測(cè)序獲得山羊TNNT3基因的CDS區(qū)可變剪切體，利用軟件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量（real-time PCR，RT-qPCR）及半定量引物，研究TNNT3基因剪切體在7個(gè)不同組織（背最長(zhǎng)?。╨ongissimus dorsi muscle，LD）、半膜?。╯emimembranosus muscle，SM）、心、肝、脾、肺、腎）和7個(gè)發(fā)育階段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉組織（背最長(zhǎng)肌和半膜肌）中表達(dá)模式；此外，對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行體外編碼能力檢測(cè)確定其具有編碼蛋白的能力，并在山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（skeletal muscle satellite cells，MuSCs）中過(guò)表達(dá)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化以及檢測(cè)標(biāo)志基因的表達(dá)變化，研究其對(duì)山羊MuSCs分化的作用?！窘Y(jié)果】①（NM_001314210.1）CDS區(qū)全序列主要含有18個(gè)外顯子，其中外顯子16/17相互排斥，轉(zhuǎn)錄后單一表達(dá)?？寺“l(fā)現(xiàn)山羊TNNT3基因 5個(gè)新轉(zhuǎn)錄本（—），其外顯子數(shù)分別是15、15、20、16、14。②生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列與綿羊、牛、豬等哺乳動(dòng)物具有很高的一致性，而與魚類和爬行類動(dòng)物的一致性較低，說(shuō)明TNNT3基因序列在哺乳動(dòng)物高度保守。③mRNA在背最長(zhǎng)肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、腎7個(gè)組織中都有表達(dá)，其中在骨骼肌中高度富集(< 0.01)，心臟及肺次之，其余組織中較低；mRNA在背最長(zhǎng)肌和半膜肌中的表達(dá)始終處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化中，胚胎期在半膜肌的表達(dá)量高于背最長(zhǎng)?。?0.05）；出生后則背最長(zhǎng)肌中高于半膜?。?0.05）。④山羊TNNT3基因轉(zhuǎn)錄本重復(fù)出現(xiàn)保守的外顯子9—11（138bp），體外翻譯實(shí)驗(yàn)顯示其可編碼蛋白且蛋白大小與預(yù)期基本相符（37 kD）；相較于對(duì)照組，在山羊MuSCs中過(guò)表達(dá)該轉(zhuǎn)錄本使肌分化標(biāo)志基因、和mRNA極顯著升高(< 0.01)?！窘Y(jié)論】獲得了山羊TNNT3基因具有完整CDS區(qū)5個(gè)新可變剪切體，主要在肌肉組織（背最長(zhǎng)肌和半膜?。┲懈弑磉_(dá)，在哺乳動(dòng)物中高度保守且促進(jìn)成肌分化。初步表明TNNT3基因在動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的生物學(xué)功能。

山羊；；可變剪切體；熒光定量PCR；體外轉(zhuǎn)錄翻譯；蛋白免疫印跡雜交；肌原分化

0 引言

【研究意義】解析動(dòng)物產(chǎn)肉性狀形成的內(nèi)在分子機(jī)制一直是肉用家畜領(lǐng)域研究的核心問(wèn)題。肌鈣蛋白（troponin, Tn）屬于鈣離子結(jié)合蛋白多基因家族的成員。肌鈣蛋白復(fù)合物作為對(duì)鈣敏感的分子開關(guān)，位于橫紋肌的細(xì)絲上，能調(diào)節(jié)橫紋肌收縮以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化[1]并影響家畜肉質(zhì)性狀[2-3]。簡(jiǎn)州大耳羊是我國(guó)培育的第二個(gè)肉用山羊新品種，具有體型大、生長(zhǎng)速度快、耐粗飼、繁殖能力高、抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)。為了探究肌鈣蛋白在山羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，為此研究了快速骨骼肌肌鈣蛋白T（fast skeletal troponin T3，TNNT3）在簡(jiǎn)州大耳羊不同組織和不同發(fā)育階段中的可變剪切及表達(dá)模式?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Tn由Ebashi于1963年首先發(fā)現(xiàn)[4]，它是由3個(gè)亞基組成的復(fù)合物：分別是與鈣結(jié)合的肌鈣蛋白C（TNNC）；原肌球蛋白Tm結(jié)合亞基肌鈣蛋白T（TNNT）；抑制肌肉收縮的肌鈣蛋白I（TNNI）[5]。TNNT是肌鈣蛋白復(fù)合物與Tm 之間的連接結(jié)構(gòu)，是對(duì)Ca2+敏感及Ca2+介導(dǎo)的肌動(dòng)球蛋白ATP酶活性活化所必要的成分[6]，在向肌節(jié)發(fā)送Ca2+信號(hào)中起著關(guān)鍵作用。哺乳動(dòng)物的TNNT是一種在動(dòng)物體肌肉和器官組織熟化過(guò)程中容易降解的原纖維蛋白[7]。其分子量在31—32 kD之間，約含有223—305個(gè)氨基酸，由一個(gè)球形C端和一個(gè)桿狀N端組成，呈不對(duì)稱結(jié)構(gòu)（圖1-B）。TNNT具有3個(gè)亞型并在脊椎動(dòng)物中呈現(xiàn)組織特異性：慢骨骼肌肌鈣蛋白、心肌肌鈣蛋白和快速骨骼肌肌鈣蛋白，這3種亞型分別由基因、和編碼[8]。與、最大的區(qū)別是可以發(fā)生復(fù)雜的可變剪切（圖1-A）。在高脂飲食誘導(dǎo)的選擇性剪切中對(duì)飽和脂肪酸起到了修飾作用，如大鼠骨骼肌通過(guò)pre-mRNA選擇性剪接修飾基因表達(dá)而對(duì)飲食中脂肪過(guò)量消耗作出反應(yīng)。有趣的是，這種效應(yīng)只存在于富含豬油的飲食中，因?yàn)楦缓瑔尾伙柡椭舅峄蚨嗖伙柡椭舅岬娘嬍硨?duì)替代剪接沒有影響[9]。然而，飽和脂肪酸是否直接作用于肌肉細(xì)胞以調(diào)節(jié)替代的pre-mRNA剪接未被評(píng)估，飽和脂肪酸促進(jìn)選擇性剪切改變的信號(hào)通路也尚不清楚。此外，還參與骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育，是平滑肌生長(zhǎng)和胎兒出生后生存所必需的[10]。例如在小鼠成肌細(xì)胞C2C12肌管分化過(guò)程中，mRNA、蛋白的表達(dá)顯著升高，剪接形式也由D0時(shí)的3種低豐度表達(dá)增加到D8時(shí)肌管中有15種未在成肌細(xì)胞中檢測(cè)到的剪接形式[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】選擇性剪接是一種在轉(zhuǎn)錄后RNA水平上調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制，它涉及順式和反式作用因子的動(dòng)態(tài)相互作用以協(xié)調(diào)剪接體在前體mRNA (pre-mRNA)上的位置[12-14]。選擇性剪接是pre-mRNA轉(zhuǎn)化為成熟mRNA過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟，通過(guò)不同的剪切方式從一個(gè)基因中產(chǎn)生多個(gè)成熟的mRNA和結(jié)構(gòu)功能差異的翻譯產(chǎn)物[15]，可以顯著擴(kuò)大轉(zhuǎn)錄組，同時(shí)增加蛋白質(zhì)組的可塑性和功能性[16-17]。TNNT3基因已經(jīng)在人、豬、斑馬魚、原雞、牛和老鼠有一定研究[18-19]，在牛的肌肉組織中也發(fā)現(xiàn)了不同類型的剪切體，但目前關(guān)于山羊可變剪切體的序列分析、表達(dá)規(guī)律以及具體功能尚未有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以簡(jiǎn)州大耳羊骨骼肌為研究材料，克隆山羊TNNT3基因可變剪切體的CDS序列，檢測(cè)其在出生后3 d簡(jiǎn)州大耳羊（母羊3只）不同組織（心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、背最長(zhǎng)肌和半膜肌）以及不同發(fā)育階段（胚胎期75、90、105 d以及出生后3、45、150和300 d）山羊肌肉組織中mRNA水平的表達(dá)差異，初探TNNT3基因在山羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，為揭示山羊TNNT3基因可變剪切體在哺乳動(dòng)物中的作用及進(jìn)一步拓展肉羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

A：3種TnT亞型可變剪切外顯子結(jié)構(gòu)示圖: 紅色表示可變剪切外顯子；藍(lán)色表示胚胎特異性外顯子；綠色為鳥類特有的外顯子；B：肌鈣蛋白T的互作蛋白

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2019年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，試驗(yàn)涉及的所有過(guò)程均嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利進(jìn)行。

1.1 樣品采集

大多數(shù)動(dòng)物肌纖維發(fā)育在胚胎中后期，并在出生前就己確定肌纖維數(shù)目，出生后不再增加。動(dòng)物出生后早期，肌纖維會(huì)隨著骨骼肌對(duì)代謝與功能需求的改變而發(fā)生轉(zhuǎn)變，運(yùn)動(dòng)、激素、神經(jīng)刺激、不同生理狀態(tài)等均可引起不同程度的骨骼肌肌纖維類型的轉(zhuǎn)變[23]。所以本次試驗(yàn)動(dòng)物樣品選擇了胚胎期75、90和105 d（E75、E90、E105）以及出生后3、45、150和300 d（B3、B45、B150、B300）共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的簡(jiǎn)州大耳羊（每個(gè)時(shí)期3只母羔）的背最長(zhǎng)肌、半膜肌以及心、肝、脾、肺、腎組織樣品，胚胎期羔羊通過(guò)剖腹產(chǎn)手術(shù)從妊娠母羊子宮中取出。整個(gè)采樣操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行，半小時(shí)內(nèi)采集清洗樣品后，立刻凍入液氮中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 RNA的抽提、檢測(cè)與反轉(zhuǎn)錄

將樣品在液氮不完全揮發(fā)條件下研磨成粉末狀，取100 mg組織樣采用Trizol（Invitrogen USA）法提取樣品總RNA。利用凝膠成像分析儀（Bio-Bad）以及核酸蛋白儀測(cè)定RNA 18S與28S條帶亮度和RNA在260nm和280nm下吸光度值及比值，初步判定質(zhì)量并記錄總RNA濃度與純度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScrip RT reagent Kit，TaKaRa，Japan）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 山羊TNNT3基因的克隆

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇山羊TNNT3（NM_ 001314210.1）基因和牛TNNT3（XM_010821200）基因保守區(qū)域，用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)山羊TNNT3基因CDS區(qū)分子克隆引物P1（表1）。以山羊不同時(shí)期肌肉組織cDNA混合樣為模板，PCR擴(kuò)增山羊TNNT3基因CDS區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括2×Master Mix Taq酶20 μL，P1上、下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 24.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s, 58 ℃ 30 s, 72℃ 50 s, 36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后12 ℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物于1.5 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像分析儀成像分析電泳條帶，瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒（Omega，USA）進(jìn)行產(chǎn)物回收。根據(jù)TaKaRa pMD?19-T Vector（Japan）使用說(shuō)明，向1.5 mL離心管中依次加入pMD?19-T Vector 0.5 μL，PCR回收產(chǎn)物3.0 μL，分子生物學(xué)用水1.5 μL，Solution I 5.0 μL，連接后的載體轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將初步鑒定出的陽(yáng)性單克隆菌液利用DL2000 DNA marker比對(duì)篩選出和目的條帶有差異的條帶，取500 μL菌液樣品送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 TNNT3生物信息學(xué)分析

將測(cè)序所得序列利用BLAST在線進(jìn)行序列比對(duì)確認(rèn)基因克隆準(zhǔn)確性，使用ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對(duì)序列進(jìn)行開放閱讀框的預(yù)測(cè)，并翻譯為氨基酸序列；EditSeq 7.10軟件以及ProtParam用于預(yù)測(cè)不同轉(zhuǎn)錄本所翻譯蛋白的氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)以及不同轉(zhuǎn)錄本的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)ClustalW整合選出有差異的序列，用MEGA_X_10.1.8軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量及半定量

根據(jù)克隆出的山羊新轉(zhuǎn)錄本序列，選用（NM_001009784）作為內(nèi)參基因，采用Primer Premier 6.0在保守區(qū)域設(shè)計(jì)定量引物P2和P6（表1）。所用real-time PCR系統(tǒng)為Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。擴(kuò)增體系10 μL包括TB Green 5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA 0.8 μL，滅菌蒸餾水3.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s；引物特異退火溫度Tm 30 s，39個(gè)循環(huán)；以0.5℃/s的速度從65 ℃緩慢遞增到95℃。設(shè)立3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)。在各轉(zhuǎn)錄本差異序列的兩端設(shè)計(jì)半定量引物P3（表1），對(duì)各轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行半定量檢測(cè)PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，Tm℃ 30 s，72℃ 50 s，26個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，最后12℃保存。

表1 TNNT3基因引物序列信息

下劃線部分為酶切位點(diǎn)（加粗）和保護(hù)堿基 The underlined parts are the restriction sites (bold) and the protective bases

1.6 TNT體外轉(zhuǎn)錄翻譯

綜合考慮轉(zhuǎn)錄本CDS區(qū)自帶的酶切位點(diǎn)以及pCMV-Flag載體所自帶的酶切位點(diǎn)，選定限制性內(nèi)切酶d III和I。結(jié)合酶切保護(hù)堿基以及CDS區(qū)序列信息設(shè)計(jì)TNT引物P4（表1）。利用設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收產(chǎn)物送樣測(cè)序正確后與pCMV-Flag載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系：2×buffer 5 μL，膠回收產(chǎn)物/空載5 μL，限制性內(nèi)切酶d III和I各1 μL，ddH2O 38 μL。利用T4 DNA連接酶構(gòu)建載體，反應(yīng)體系為10 μL（目的片段的酶切膠回收產(chǎn)物7.2 μL，酶切后的空載回收產(chǎn)物0.8 μL，T4及T4 buffer各1 μL）。克隆獲得的菌液利用E.Z.N.A.Endo-free Plasmid Mini kit II Spin Protocol 質(zhì)粒提取試劑盒完成質(zhì)粒提取。體外轉(zhuǎn)錄翻譯使用試劑盒進(jìn)行。

1.7 Western Blot

翻譯蛋白的定量參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P0010S）檢測(cè)濃度后計(jì)算含10—50 μg蛋白的溶液體積上樣。SDS-PAGE 電泳是采用10 %分離膠和4 %濃縮膠，95 °C變性5 min。電泳時(shí)設(shè)置電壓40 V，電泳25 min，后用100 V，電泳80 min。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說(shuō)明進(jìn)行（組裝濾紙凝膠纖維素夾層，恒壓選25 V，電泳30 min）；轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜正面朝上完全浸入封閉液中，依據(jù)封閉液說(shuō)明書，37 °C放置1.5—2 h。一抗4°C孵育過(guò)夜；用TBST漂洗4次，每次10 min，二抗37 °C孵育1.5—2 h，再用TBST漂洗3—5次，每次10 min。按照顯色試劑盒進(jìn)行操作顯色后用成像儀照相得到蛋白圖片。

1.8 TNNT3_3過(guò)表達(dá)檢測(cè)

利用過(guò)表達(dá)引物P5（表1）構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（載體構(gòu)建及質(zhì)粒提取操作與TNT體外轉(zhuǎn)錄翻譯相同）。將MuSCs（畜禽遺傳資源挖掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離凍存）以2.5×104個(gè)/孔的密度鋪至6孔板中，匯合度為80 %進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，每孔用250 μL Opti-DMEM （無(wú)血清）分別室溫孵育3 μg質(zhì)粒DNA和2 μL lip2000 5 min，后混合孵育20 min；將孵育好的轉(zhuǎn)染液逐滴加入到已更換為無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞中，輕輕晃動(dòng)6孔板；轉(zhuǎn)染4—6 h后更換為10 % FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染24 h改成分化培養(yǎng)基，通過(guò)顯微鏡觀察綠色熒光蛋白判斷轉(zhuǎn)染效率；轉(zhuǎn)染48 h收取對(duì)照組和處理組細(xì)胞進(jìn)行RNA抽提。對(duì)標(biāo)志基因進(jìn)行RT-qPCR定量檢測(cè)。

1.9 免疫熒光

將山羊MuSCs以2.5×104個(gè)/孔的密度鋪至35 mm單孔板，匯合度為80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后誘導(dǎo)分化。分化7d后用PBS輕輕晃動(dòng)清洗3次，每次5 min；加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min；PBS晃動(dòng)清洗3次，每次5 min，加入0.5 %曲拉通trion-X-100 4℃處理10 min；PBS晃動(dòng)清洗3次，每次5 min，用2% BSA 37℃封閉2 h；棄去封閉液，加入稀釋好的一抗，4℃孵育過(guò)夜；PBS晃動(dòng)清洗3次，每次5 min，避光加入稀釋好的二抗，37 ℃孵育2 h；避光條件下PBS晃動(dòng)清洗3次，每次5 min，加入0.05%的DAPI染液，37℃避光孵育10 min；避光條件下PBS晃動(dòng)清洗3次，每次5 min，在倒置熒光顯微鏡下成像拍照。

1.10 數(shù)據(jù)分析

對(duì)擴(kuò)增效率達(dá)到95%—105%的產(chǎn)物，根據(jù)Bio-Rad CFX96自帶分析軟件計(jì)算各基因各時(shí)間點(diǎn)的拷貝數(shù)，以作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法[24]進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。運(yùn)用軟件SAS 9.1的PROC GLM程序進(jìn)行最小二乘分析，結(jié)果以最小二乘均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并利用Duncan法進(jìn)行均數(shù)間的多重比較。

2 結(jié)果

2.1 山羊TNNT3基因的克隆及序列分析

測(cè)序結(jié)果表明，利用引物P1以山羊背最長(zhǎng)肌及半膜肌cDNA混合樣作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)物長(zhǎng)度為835 bp（圖2-A），TA克隆后隨機(jī)挑選單克隆菌落接種菌液并PCR擴(kuò)增測(cè)序（圖2-B），根據(jù) NCBI在線BLAST比對(duì)獲得了山羊TNNT3基因CDS區(qū)5種基因可變剪切體（圖2-C）：、、、和，5種不同可變剪切體的開放閱讀框編碼起始位點(diǎn)（ATG）與編碼終止位點(diǎn)（TAG）均一致，且特異性地表達(dá)了互斥外顯子Exon 16/17。另外，的外顯子Exon 9—11出現(xiàn)了138 bp的重復(fù)（圖2-D），這一外顯子的重復(fù)插入使得的開放閱讀框加長(zhǎng)，增加了46個(gè)氨基酸殘基（圖2-E），其余4個(gè)轉(zhuǎn)錄本均不同程度地缺失了個(gè)別外顯子，但結(jié)構(gòu)域均未發(fā)生改變（圖2-F）。NCBI工具ORF Finder預(yù)測(cè)開放閱讀框的長(zhǎng)度分別為741、753、783、801和954 bp，其編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度從246 AA 到317 AA，蛋白質(zhì)分子量（kD）從29.17到37.40，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）范圍從6.72到9.15（表2）。

從NCBI上下載其他物種氨基酸序列并利用MEGE 10.1.8構(gòu)建進(jìn)化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)山羊氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系最近的有哺乳動(dòng)物牛（）、驢（）、豬（）和人（），而與爬行類（）和鳥類（）的同源關(guān)系較遠(yuǎn)。此外，山羊基因核苷酸序列在哺乳動(dòng)物中高度保守，例如，山羊和轉(zhuǎn)錄本序列與綿羊、藏羚羊、牛、豬、狒狒、小鼠和兔子的基因序列相似性分別為99%、98%、98%、97%、95%、95%及91%；TNNT3_2和TNNT3_5轉(zhuǎn)錄本與綿羊、牛、豬、人和小鼠的相似性也較高性（分別為99%、99%、95%、96%及91%，但轉(zhuǎn)錄本序列與綿羊（94%）、藏羚羊（93%）、牛（94%）、豬（92%）、狒狒（94%）、小鼠（94%）的相似性則相對(duì)較低。

A：TNNT3 CDS區(qū)全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物(P1:835bp)；B：TNNT3可變剪切體單克隆菌液PCR產(chǎn)物；C：TNNT3可變剪切體差異片段（exon4-8：193-253 bp）qPCR產(chǎn)物；M1：DNA marker DL 2000 bp；M2: DNA marker DL 5000 bp；D：TNNT3不同可變剪切體序列與山羊全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，紅色方框是發(fā)生可變剪切的外顯子位點(diǎn)；E：山羊TNNT3不同可變剪切體的氨基酸序列對(duì)比；綠色方框：骨骼肌中最先被降解的產(chǎn)物[18]；紅色方框：TNNT3_3的外顯子Exon 9—11重復(fù)，增加了46個(gè)氨基酸殘基；藍(lán)色方框：互斥表達(dá)的外顯子16/17編碼的氨基酸[25]；F：TNNT3可變剪切體結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

表2 山羊TNNT3不同可變剪切體預(yù)測(cè)的氨基酸序列信息

圖3 TNNT3氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

2.2 山羊TNNT3基因的組織表達(dá)分析

利用熒光定量及半定量PCR檢測(cè)出生后3d的羔羊心、肝、脾、肺、腎以及背最長(zhǎng)肌和半膜肌組織中mRNA水平表達(dá)，發(fā)現(xiàn)熒光定量（圖4-A）及半定量（圖4-B）結(jié)果一致：mRNA在檢測(cè)的7個(gè)組織中都有表達(dá)，其中在背最長(zhǎng)肌及半膜肌中的表達(dá)最高（<0.01），心臟及肺次之（<0.01），其余組織中的表達(dá)量相對(duì)較低（>0.05）。

2.3 山羊TNNT3不同轉(zhuǎn)錄本在胚胎期及出生后不同發(fā)育階段的表達(dá)分析

根據(jù)上述的組織表達(dá)結(jié)果，選擇簡(jiǎn)州大耳羊在胚胎期（E75、E90和E105）和出生后（B3、B45、B150和B300）兩個(gè)時(shí)間段共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的背最長(zhǎng)?。↙D）和半膜肌（SM）檢測(cè)mRNA基因表達(dá)（圖4-C）。背最長(zhǎng)肌和半膜肌組織中mRNA均呈現(xiàn)“下降-上升-下降”的表達(dá)趨勢(shì)。在胚胎期LD和SM中均是E75相對(duì)表達(dá)量高于其余兩個(gè)胚胎時(shí)間點(diǎn)（E90和E105），且在半膜肌的表達(dá)量高于背最長(zhǎng)??；出生后45 d在背最長(zhǎng)肌的表達(dá)量高于半膜肌，B150達(dá)到峰值，顯著高于B3和B45的表達(dá)量（<0.01）。此外，隨著山羊日齡增長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本數(shù)量減少，在B150和B300山羊LD和SM中不能明顯區(qū)分多種轉(zhuǎn)錄本（圖4-D），說(shuō)明各轉(zhuǎn)錄本可能在山羊胚胎期肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。

A: TNNT3在不同組織中的mRNA水平；B: TNNT3可變剪切體在不同組織中的半定量電泳結(jié)果；C: TNNT3在背最長(zhǎng)肌和半膜肌不同發(fā)育階段中的mRNA水平；D: TNNT3可變剪切體在背最長(zhǎng)肌（LD）和半膜?。⊿M）不同發(fā)育階段中的半定量電泳結(jié)果；圖中所標(biāo)不同字母表示差異極顯著（P<0.01）；同一時(shí)期兩組織間的表達(dá)差異顯著性用*（P<0.05）**（P<0.01）表示

2.4 TNNT3_3的TNT檢測(cè)及過(guò)表達(dá)

為了初步探究對(duì)肌細(xì)胞分化的影響，筆者在鑒定出的5種轉(zhuǎn)錄本中選取與其他物種序列相似性最低的, 首先成功構(gòu)建體外轉(zhuǎn)錄翻譯載體（圖5-A），確定了具有轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白的能力且蛋白大小與預(yù)期基本相符（圖5-B）。進(jìn)一步在山羊MuSCs中將轉(zhuǎn)錄本過(guò)表達(dá)，分別檢測(cè)增殖期（GM）和分化期（DM）基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，雖然過(guò)表達(dá)使增殖期細(xì)胞中表達(dá)水平提高上萬(wàn)倍，但、和表達(dá)量差異不顯著，而mRNA水平約上升1.5倍（<0.05，圖5-C GM）；而在分化條件下，肌分化標(biāo)志基因、和相較于對(duì)照組均極顯著升高（<0.01），增殖相關(guān)基因表達(dá)仍未改變（圖5-C DM）。與此相對(duì)應(yīng)，過(guò)表達(dá)后誘導(dǎo)分化7 d免疫熒光檢測(cè)MyHC信號(hào)，發(fā)現(xiàn)可以明顯促進(jìn)MyHC表達(dá)和肌管形成（圖5-D）。

3 討論

利用并整合其他哺乳動(dòng)物已報(bào)道TNNT3基因序列，成功地克隆分離了山羊肌肉組織TNNT3基因的5個(gè)可變剪切體。同時(shí)，根據(jù)氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，山羊與綿羊和牛的氨基酸序列高度相似，歸屬于哺乳動(dòng)物。值得注意的是，比對(duì)結(jié)果顯示雖然、、、外顯子均有不同程度的缺失，但開放閱讀框的起始位點(diǎn)及結(jié)束位點(diǎn)均一致，這也證明了TNNT3基因在哺乳動(dòng)物中序列高度保守的結(jié)論。在牛肌肉組織的免疫鑒定中發(fā)現(xiàn)一個(gè)TNNT的片段（31—32kD的多肽鏈）ASPPPAEVPEVHEEVH是骨骼肌中最先被降解的產(chǎn)物，伴隨這個(gè)降解發(fā)生的是肉質(zhì)嫩化的過(guò)程[18]。在克隆獲得的山羊序列中也發(fā)現(xiàn)了這個(gè)片段，但5和2部分或完全缺失該片段，該片段的缺失對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及肌肉降解的作用以及是否會(huì)影響肉質(zhì)產(chǎn)品的風(fēng)味還需進(jìn)一步探索。在與山羊TNNT3基因的其他可變剪切體進(jìn)行差異比對(duì)和分析時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)TNNT3基因核酸序列在外顯子缺失位點(diǎn)的兩端，A、G含量高且多為重復(fù)序列，推測(cè)這可能是造成不同剪切形式的原因。這個(gè)推測(cè)與現(xiàn)代內(nèi)含子的剪切模式研究觀點(diǎn)相同[26]，并且基因序列中出現(xiàn)了較多類似的回文結(jié)構(gòu)，這也可能是造成了剪切識(shí)別位點(diǎn)錯(cuò)位的原因。

A：TNNT3_3體外轉(zhuǎn)錄載體構(gòu)建；B：TNNT3_3體外轉(zhuǎn)錄蛋白免疫印跡結(jié)果；C：TNNT3_3過(guò)表達(dá)后增殖GM/分化DM時(shí)期標(biāo)志基因mRNA水平；D：分化7 d后MyHC免疫熒光結(jié)果；M1：DNA marker DL 2000 bp；M2：DNA marker DL 5000 bp；M3：蛋白marker

肌鈣蛋白復(fù)合物的3個(gè)亞基中的每一個(gè)都有多種亞型，這些亞型以不同的組織特異性和發(fā)育調(diào)控模式表達(dá)。在人和小鼠中TNNT3基因由19個(gè)外顯子構(gòu)成，包含編碼271個(gè)氨基酸的CDS區(qū)。N末端編碼的外顯子4、5、6、7和8可發(fā)生約幾十種選擇性剪接[27-28]，外顯子8和9之間的胎兒外顯子也可以剪切并在胚胎快速骨骼肌中獨(dú)特表達(dá)[29]，C末端與中間區(qū)域高度保守。C端的外顯子16和外顯子17是在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的剪切調(diào)控中相互排斥的[25]，這兩個(gè)外顯子共同編碼TnC與TnI結(jié)合位點(diǎn)的14個(gè)氨基酸殘基的多肽片段（圖1）[28]。通過(guò)cDNA序列比較，外顯子16主要在成年的快速骨骼肌肌鈣蛋白內(nèi)表達(dá)。而外顯子17所編碼的氨基酸序列與慢骨骼肌肌鈣蛋白（ssTnT）和心肌肌鈣蛋白（cTnT）中的氨基酸序列具有較高的相似性，并主要在胚胎期以及新生兒的快速骨骼肌肌鈣蛋白（）中表達(dá)。并且，蛋白質(zhì)相互作用研究表明，外顯子17的摻入減弱了快速骨骼肌肌鈣蛋白中TNNC與原肌球蛋白的親和力[30]。

TNNT3基因已知可以調(diào)節(jié)快速骨骼肌的收縮，但其在肌肉中的具體作用仍存在爭(zhēng)議。為確定其在體內(nèi)的功能，有研究構(gòu)建了TNNT3/flox/lacZ小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNNT3小鼠體型在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都比野生型小，TNNT3胚胎比雜合子小，并在出生后不久死亡?？偟膩?lái)說(shuō)，這個(gè)研究表明在肌肉中表達(dá)是肌肉生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，并且是正常生長(zhǎng)和新生小鼠產(chǎn)后呼吸生存所必需的[10]。飲食特異性對(duì)pre-mRNA選擇性剪接的影響是由高脂豬油飲食中特定類型的脂肪酸或神經(jīng)酰胺在肌肉內(nèi)的積累引起的[9]。如PP1對(duì)于神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的Bcl-xL和caspase-9 pre-mRNAs[31]替代剪接的改變是必要的。其他研究也報(bào)道了飲食或肥胖導(dǎo)致的pre-mRNA選擇性剪接的變化[32-34]，但控制代謝的激素反饋使體內(nèi)調(diào)節(jié)選擇性剪接的機(jī)制復(fù)雜化，并且對(duì)于特定脂肪酸在這一過(guò)程中的作用目前知之甚少。此外，因?yàn)槌兄丶∪鈺?huì)收到關(guān)于體重的機(jī)械反饋，并消耗ATP以產(chǎn)生足以抵消重力的能量。有研究利用大鼠研究了體重的變化如何影響的選擇性剪接，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)其剪接形式與夜間能量消耗顯著相關(guān)，而與自身體重?zé)o關(guān)[34]，這一結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)通過(guò)協(xié)調(diào)肌絲的鈣離子濃度依賴性ATP酶活性，從而在肌細(xì)胞收縮和舒張過(guò)程中發(fā)揮作用。

本研究以簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)檠芯繉?duì)象，實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)其組織表達(dá)結(jié)果顯示，mRNA在肌肉組織中表達(dá)最高，且在出生前后均處于較高的表達(dá)水平。肌纖維的發(fā)育可分為4個(gè)階段：中胚層干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞，成肌細(xì)胞融合為肌管細(xì)胞，肌管細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧±w維，最后肌纖維生長(zhǎng)至成熟。大多數(shù)動(dòng)物肌纖維發(fā)育的前三個(gè)過(guò)程在動(dòng)物胚胎期就己完成，肌纖維數(shù)目也在出生前就已確定[35-37]。動(dòng)物骨骼肌在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，其肌纖維組成類型并不是完全固定的，肌纖維類型經(jīng)過(guò)一個(gè)成熟過(guò)程以達(dá)到成年的分布模式，特別是在動(dòng)物出生早期，肌纖維的收縮和代謝特性會(huì)隨著骨骼肌對(duì)代謝與功能需求的改變而發(fā)生轉(zhuǎn)變。本試驗(yàn)結(jié)果中，mRNA在背最長(zhǎng)肌和半膜肌中的表達(dá)始終處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化中。半膜肌屬于I型肌纖維又稱慢收縮型肌纖維，具有收縮緩慢的特性；這種類型肌纖維含有豐富的線粒體，表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧化代謝能力，在耐力型工作中發(fā)揮主導(dǎo)作用。背最長(zhǎng)肌主要是II型纖維又稱快收縮型纖維，具有收縮速度快、易疲勞的特性；這種類型的肌纖維主要在強(qiáng)度要求高、速度要求快的運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮作用。定量結(jié)果顯示出生后半膜肌中mRNA的表達(dá)持續(xù)下降，背最長(zhǎng)肌中mRNA的表達(dá)持續(xù)上升，并在快速發(fā)育以及成年階段背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)都極顯著高于半膜肌，且在150 d達(dá)到了峰值，這個(gè)結(jié)果符合TNNT3基因目前已知的生物學(xué)功能及表達(dá)特性。目前許多的資料表明，運(yùn)動(dòng)、激素、神經(jīng)刺激、不同生理狀態(tài)等均可引起不同程度的骨骼肌肌纖維類型的轉(zhuǎn)變[23]。小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，TNNT3是產(chǎn)后及生長(zhǎng)的肌肉中所必需[10]，在C2C12中的表達(dá)量和可變剪切體的形式隨著肌管分化逐漸增加[11]，表明TNNT3在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。在發(fā)育過(guò)程中，TNNT3基因各轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)在骨骼肌中經(jīng)歷了高分子量至低分子量的剪接形式轉(zhuǎn)換[38]，該轉(zhuǎn)換也代表了低等電點(diǎn)結(jié)合形式向高等電點(diǎn)形式的轉(zhuǎn)變，本研究也有類似的結(jié)果（圖4）。目前對(duì)于可變剪切體的研究集中在人和小鼠，不同的可變剪切體通過(guò)編碼出不同肌鈣蛋白亞型發(fā)揮生理作用。如可能與遠(yuǎn)側(cè)關(guān)節(jié)的攣縮有關(guān)，但其具體的生物學(xué)效應(yīng)目前還不明確[1, 39-40]。在人的肌肉萎縮研究中發(fā)現(xiàn)，的缺乏不影響剪接形式的發(fā)育轉(zhuǎn)換，這表明pre-mRNA的選擇性剪接與骨骼肌纖維類型無(wú)關(guān)[38]。此外，已有研究證明，雖然的N末端可變區(qū)不與細(xì)絲調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的任何已知蛋白質(zhì)結(jié)合，但的N末端片段中的選擇性剪接已經(jīng)顯示出對(duì)TNNT3蛋白的總體構(gòu)象以及對(duì)TNNI和原肌球蛋白的結(jié)合親和力的影響[41]。

4 結(jié)論

在山羊上成功獲得五種可變剪切轉(zhuǎn)錄本的CDS序列，山羊TNNT3基因與綿羊、牛、豬等哺乳動(dòng)物具有很高的相似性，與魚類爬行類動(dòng)物一致性較低，證明TNNT3基因序列在哺乳動(dòng)物中高度保守。主要在肌肉組織（背最長(zhǎng)肌和半膜?。┲懈弑磉_(dá)，并且過(guò)表達(dá)后可以促進(jìn)山羊MuSCs分化，表明在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中具有潛在的重要生物學(xué)功能。

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Alternative Splicingand Its Effect on the Differentiation of MuSCs in Goat

CHEN Yuan, CAI He, LI Li, WANG LinJie, ZHONG Tao, ZHANG HongPing*

Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130

【Objective】As a member of the troponin (Tn) family,(Fast Skeletal Troponin T3) involves skeletal muscle contraction, growth, development, and even meat characteristics of domestic animals.This study initially aimed to identify the alternative splicing of goat ().【Method】Based on goat(NM_001314210.1) and cattle(XM_010821200) mRNA sequence from NCBI (National Center for Biotechnology Information), the primers were designed by using the Primer Premier 6.0 software, subsequently, TNNT3 was amplified from skeletal muscles of embryo Jianyang Bigear Goat.The obtainedsequences were then bioinformatically analyzed by using ORF Finder, EditSeq, DNAMAN, ClustalW, and MEGA_X_10.1.8.Furthermore, the levels ofisoforms were quantified by using real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) and semi-quantitative PCR in longissimus dorsi (LD) muscle, semimembranosus (SM) muscle, heart, liver, spleen, lung, and kidney, at seven stages (E75, E90, E105, B3, B45, B150, and B300), respectively.Additionally, the coding ability of transcript【Result】① A total of five isoforms (named) of thegene were identified in pooled RNA extracted from goat muscles, and the complete coding sequence (CDS) sequence mainly contained 18 exons.② Nucleotide sequence and amino acid sequence of the goatgene were highly consistent with sheep, cattle, pig, and other mammals, but low with that of fish and reptiles, indicating the high evolutionary conservation of thegene in mammals.③ ThemRNA was presented in all seven detected tissues but highly enriched in LD and SM muscles (< 0.01), followed by cardiac muscle and lung.Furthermore, the levels ofmRNA in SM muscles were higher than that in LD muscles in prenatal goats (< 0.05), while the verse results were presented postnatal (< 0.05).④ The conserved exon 9-11 (138 bp) of goatwas repeated in the transcript.was amplified, and it was found out that which could encode protein, and the protein size was basically the same as expected (37 kDa) in TnT transcriptional translation system in vitro.Moreover, the transfection ofinto goat MuSCs induced mRNA levels of myogenic differentiation marker genes, including Myomaker, MyoG, and MyH4, comparing with the control (< 0.01).【Conclusion】Five isoforms with complete CDS region of thegene were obtained in goat muscles.The sequence and expression ofwere highly conserved in mammals and enriched in muscles, indicating that potentiallygene functions critically in muscle growth and development.

goat;; alternative splicing; quantitative PCR; TnT transcriptional translationWestern blotting; myogenic differentiation

2020-09-09；

2021-05-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（31672402，31772578）

陳媛，E-mail：Chyuan201301@163.com。通信作者張紅平，E-mail：zhp@sicau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）