OTUB2、TAZ在食管鱗癌中的表達水平及其臨床意義

劉 麗，蘇麗萍，路子揚，季 敏，蘇天園，蒲紅偉

（新疆醫(yī)科大學1基礎醫(yī)學院，2第一附屬醫(yī)院病理科，3遠程醫(yī)學中心，4學科建設科，烏魯木齊 830011）

食管癌（esophageal carcinoma）在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位居第八位，死亡率位居第六位，是我國較常見的消化道惡性腫瘤之一，主要的組織學類型有鱗癌和腺癌，其中鱗癌占90%以上[1]。由于食管癌早期臨床表現(xiàn)不典型，多數(shù)患者就診時已達到晚期，導致臨床治療效果欠佳。因此，腫瘤標志物與治療靶點對于臨床上食管鱗癌的診斷和治療具有重要意義。Otubain2（OTUB2）是卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域（OTU）家族的成員，是一種二氫泛素化酶，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅的卵巢腫瘤基因中，它能夠參與機體的多種生物學活動[2-3]，包括抑制病毒誘導干擾素調(diào)節(jié)因子3和NF-κB的活化[4]、提高人胰島β細胞存活率[5]及促進DNA的損傷修復[6]等。有研究表明，OTUB2能夠促進非小細胞肺癌[7]、甲狀腺乳頭狀癌[8]、肝癌[9]的發(fā)展，在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)出異常活躍狀態(tài)。同時OTUB2能夠與TAZ中的多聚泛素化鏈相互作用，使TAZ被激活，進而促進腫瘤的增殖、侵襲和遷移[10]。TAZ又稱為WWTR1（含有WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1），位于Hippo信號通路的下游發(fā)揮核心效應,在食管鱗癌[11]、頭頸部鱗癌[12]、喉鱗癌[13]等腫瘤中TAZ可以作為Hippo信號通路中的核心作用靶點參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[14]。此外，TAZ介導的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[15]在食管癌的發(fā)展進程中也有著一定的促進作用。

這兩種因子在腫瘤中顯示出異常的高活性，說明OTUB2與TAZ與腫瘤的發(fā)展有著密切聯(lián)系。本研究旨在觀察食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中OTUB2與TAZ的表達情況及其與ESCC的臨床分期轉(zhuǎn)移及預后之間的關(guān)系，探討OTUB2、TAZ參與ESCC的發(fā)生、發(fā)展的可能機制，為ESCC的診斷與治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科2008-2018年收治的272例ESCC患者病理石蠟標本及臨床病理信息。納入標準:確診為ESCC且術(shù)前均未接受過任何針對腫瘤的放、化療等治療；臨床病理參數(shù)信息完整且組織標本經(jīng)過HE染色及鏡下觀察確認細胞結(jié)構(gòu)無損壞。排除標準：其他腫瘤轉(zhuǎn)移等病例；脫片造成的無法判斷免疫組化染色結(jié)果者。資料收集已通過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批（K201909-03）。

1.2 生物信息學分析利用TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫檢索分析OTUB2在食管癌中的表達情況；STRING數(shù)據(jù)庫檢索OTUB2與TAZ之間的互作關(guān)系。

1.3 試劑與方法Anti-OTUB2購自中國Bioss試劑有限公司，貨號：bs6236R；Anti-TAZ購自英國ABCM公司,貨號：ab242313；兩者稀釋濃度為1∶50，PBS、檸檬酸抗原修復液、山羊血清、過氧化氫、通用型二抗等均購自中國Bioss試劑有限公司。石蠟標本切片3μm，烤片2 h，溫度60℃，石蠟切片經(jīng)二甲苯、無水乙醇梯度脫蠟，檸檬酸抗原修復，封閉后加一抗Anti-OTUB2及Anti-TAZ 4℃孵育過夜；第二日加通用型二抗，DAB顯色，蘇木素染色，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.4 結(jié)果評定結(jié)果采用雙盲法，由兩位具有診斷資質(zhì)的病理醫(yī)師閱片，每張切片隨機選取5個高倍視野。評分由染色強度及陽性細胞百分比綜合計算得出，將染色強度分為未染色（無色）、弱染色（淡黃色）、中度染色（淺棕色）和強染色（深棕色），分別以0、1、2、3計分。陽性細胞標準包括：陽性細胞占比為0%計0分，占比0%～30%計1分，占比30%～60%計2分，占比60%～90%計3分。根據(jù)染色指數(shù)（SI）將染色結(jié)果記錄為陰性0～3分，陽性4～9分，其中4～5分計為低度表達，6～7分計為中度表達，8～9分計為高度表達。染色指數(shù)＝陽性細胞所占百分比×染色強度。

1.5 生存分析電話隨訪收集患者術(shù)后生存信息,以患者死亡為終點事件，隨訪時間截至2019年12月31日。根據(jù)OTUB2、TAZ蛋白在食管鱗癌組織中的表達情況繪制生存分析圖，患者中位總生存時間（OS）是指最初診斷為ESCC至死亡或最終隨訪的時間。

1.6 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗。采用Fisher確切概率法對單個樣本例數(shù)理論值<5的數(shù)據(jù)進行分析；關(guān)聯(lián)性分析采用Spearman相關(guān)分析法，生存分析采用Kaplan-Meier分析法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學分析OTUB2在食管癌中的表達情況及其與TAZ的相互作用關(guān)系通過TCGA數(shù)據(jù)庫檢索分析發(fā)現(xiàn)，OTUB2在多種腫瘤中高表達，而在食管癌組織中表達顯著高于正常食管癌旁組織,見圖1a、b；利用STRING數(shù)據(jù)庫檢索OTUB2與TAZ（WWTR1）發(fā)現(xiàn)，兩者之間存在相互作用關(guān)系，見圖1c。

圖1 生物信息學分析OTUB2在食管癌中的表達及其與TAZ(WWTR1)之間的關(guān)系

2.2 OTUB2在ESCC中的表達情況及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系OTUB2在癌旁組織中呈陰性表達，見圖2a；在ESCC的細胞質(zhì)和細胞核中OTUB2均呈現(xiàn)高表達，主要定位于細胞質(zhì)，見圖2b～d；在癌旁組織中OTUB2陽性表達率為12.1%，ESCC中OTUB2陽性表達率為87.9%，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。OTUB2的陽性表達與腫瘤大小（P=0.000）、分化程度（P=0.000）有關(guān)，與性別（P=0.065）、年齡（P=0.457）、浸潤深度（P=0.758）、TNM分期（P=0.362）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.185）無關(guān)，見表1。

表1 OTUB2在ESCC中的表達及臨床相關(guān)病理參數(shù)分析

圖2 OTUB2在ESCC組織及癌旁組織中的表達（×200）

2.3 TAZ在ESCC中的表達情況及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系TAZ在癌旁組織中不表達，見圖3a；在ESCC的細胞質(zhì)和細胞核均呈陽性表達,主要定位于細胞核，見圖3b～d。在癌旁組織中TAZ陽性表達率為14.1%，ESCC中TAZ陽性表達率為85.9%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。TAZ的陽性表達與腫瘤大?。≒=0.000）、分化程度（P=0.020）、浸潤深度（P=0.000）、TNM分期（P=0.005）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.023）有關(guān)，與性別（P=0.438）、年齡（P=0.795）無關(guān)，見表2。

圖3 TAZ在ESCC組織及癌旁組織中的表達（×200）

表2 TAZ在ESCC中的表達及臨床相關(guān)病理參數(shù)分析

2.4 OTUB2、TAZ在ESCC發(fā)展中的相關(guān)性OTUB2、TAZ共同陽性表達的病例數(shù)為175例（64.3%），OTUB2陽性表達TAZ陰性表達29例（10.7%），OTUB2陰性表達TAZ陽性表達45例（16.5%），兩者共同陰性表達23例（8.5%）。Spearman進行相關(guān)性分析顯示，OTUB2與TAZ表達呈正相關(guān)（P=0.000，r=0.216）。

2.5 OTUB2、TAZ在ESCC中的表達與預后的關(guān)系生存分析結(jié)果表明，ESCC患者中OTUB2高表達組中位總生存時間（OS）為22個月，低表達組OS為30個月，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.042)，見圖4a；腫瘤直徑≥3 cm的患者中，OTUB2高表達組OS值更短(P=0.032)，見圖4b。此外，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAZ高表達組的OS值為23個月低于TAZ低表達組OS值28個月(P=0.033)，見圖4c；當腫瘤直徑≥3 cm且TAZ高表達時，患者OS值較低(P=0.031)，圖4d，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在臨床病理分期TNM I期和II期，TAZ的高表達在ESCC患者中傾向于較差的預后(P=0.016)，見圖4f；當腫瘤浸潤全層以及存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且TAZ高度表達時，OS值較短(P<0.05)，見圖4e、g。當OTUB2與TAZ同時為陰性表達時，OS值更長，患者的生存和預后最好，當兩者中有一項為陽性表達或兩者均為陽性表達時，OS值更短，患者生存率較低，預后較差，見圖4h；當腫瘤直徑≥3 cm且OTUB2與TAZ高表達時，患者生存率更低，預后亦越差，見圖4i。以上結(jié)果均表明，OTUB2與TAZ的表達水平與食管鱗癌患者的預后密切相關(guān)。

圖4 OTUB2、TAZ在ESCC中表達水平的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

食管癌在全球惡性腫瘤的發(fā)病率及致死率中均位居前列，其惡性程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力通常與癌細胞自身增殖分化能力有著緊密聯(lián)系，當抑癌基因和促癌基因表達失衡時可導致腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等[16]。

OTUB2是一種去泛素化酶，可作為一種腫瘤干細胞和轉(zhuǎn)移促進因子，有研究發(fā)現(xiàn)OTUB2在賴氨酸233上是聚-SUMO化的，而TAZ中可能存在一個能夠與SUMO相互作用的結(jié)構(gòu)域(SUMO-interacting motif，SIM)，TAZ可通過該結(jié)構(gòu)域與SUMO（small ubiquitinrelated modifier）化的OTUB2相結(jié)合而發(fā)揮效應[10]。OTUB2能夠通過去泛素化酶的作用調(diào)控增殖細胞核抗原（PCNA）從而促進細胞生長增殖[17]。而TAZ在與細胞中的scribble（細胞極性決定因子）形成復合物抑制其原有的腫瘤相關(guān)分子生物學功能；在腫瘤細胞中由于scribble被大量破壞,或Hippo通路中上游核心激酶異常,使通路中上游因子對TAZ的抑制作用解除,從而使TAZ具有腫瘤干細胞的特征和功能[18]。其參與腫瘤發(fā)展主要機制為在正常細胞生長過程中TAZ主要以磷酸化形式存在于細胞質(zhì)中，當受到某些內(nèi)外環(huán)境因素刺激時，可使其磷酸化減弱，去磷酸化增強，由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子TEAD1-4結(jié)合從而促進腫瘤的發(fā)展。有資料表明，TAZ在多種腫瘤中呈現(xiàn)出異常的高活性，并且與腫瘤的遷移和侵襲能力密切相關(guān)，在非小細胞肺癌中沉默TAZ后能夠顯著降低癌細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力[19]；在食管鱗癌組織中，TAZ呈高表達且與患者預后呈負相關(guān)[12]，這與本研究結(jié)果一致。

Zhang[10]等發(fā)現(xiàn)，OTUB2可作為一個重要的調(diào)制器調(diào)控TAZ的表達從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其可通過去泛素化作用結(jié)合和穩(wěn)定TAZ，對TAZ有著一定的正向調(diào)節(jié)作用，該團隊的研究發(fā)現(xiàn)OTUB2能夠不依賴Hippo信號通路直接作用于TAZ從而促進腫瘤的增殖，當OTUB2過表達時可直接通過SUMO化穩(wěn)定和結(jié)合TAZ使其激活，TAZ去磷酸化作用增強并且轉(zhuǎn)移至細胞核與核內(nèi)TEADs結(jié)合激活相應靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，進而促進腫瘤的發(fā)展，而對于OTUB2與TAZ在ESCC中的作用機制仍需更深入的研究。本研究利用生物信息學分析OTUB2在食管癌中的表達情況以及與TAZ的相互作用關(guān)系，應用免疫組織化學法檢測分析OTUB2與TAZ在ESCC組織及癌旁組織中的表達水平及其相關(guān)性。結(jié)果表明，OTUB2和TAZ在ESCC組織的陽性表達率顯著高于癌旁組織，并且與患者的臨床參數(shù)及預后相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。通過相關(guān)性分析得出，OTUB2與TAZ在ESCC中表達有關(guān)聯(lián)性并呈正相關(guān)。生存分析結(jié)果表明，OTUB2與TAZ高表達組的ESCC患者OS明顯短于低表達組（P<0.05）。由此可推斷，OTUB2與TAZ可能參與了ESCC的發(fā)生、發(fā)展并有一定的促進作用。

綜上所述，OTUB2、TAZ的蛋白表達水平與ESCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但對于OTUB2與TAZ在ESCC組織中的具體作用機制仍需進一步深入研究與探索，這將為ESCC的早期發(fā)現(xiàn)與治療提供新的治療靶點。