抗菌肽LL-37對大鼠背部皮瓣存活的影響△

何志湘，王九松，許云華，宋劍剛，賀 強

（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院手足外科，湖南衡陽 421002）

隨意皮瓣因其使用方便靈活，被廣泛應(yīng)用于臨床組織缺損的修復(fù)和重建，但隨意皮瓣由于不含知名血管，皮瓣血液供應(yīng)主要依靠蒂部皮膚及筋膜內(nèi)的血管網(wǎng)，易發(fā)生皮瓣血液循環(huán)障礙和缺血再灌注損傷，造成皮瓣部分或全部壞死［1，2］。因此，改善皮瓣微循環(huán)、增加血運，減少炎性反應(yīng)，對提高皮瓣的成活率至關(guān)重要。抗菌肽是一類由生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的活性多肽，存在于上皮和免疫組織中，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性的特性，構(gòu)成了機體先天性免疫系統(tǒng)的第一道防線［3，4］。LL-37 是人源抗菌肽 cathelicidin家族的一員，表達分泌于人體內(nèi)多種上皮細胞、免疫細胞、體液和創(chuàng)傷分泌物等處，能夠發(fā)揮抗微生物活性，參與機體免疫調(diào)節(jié)，還可作用于血管內(nèi)皮細胞和上皮細胞，刺激血管生成和促進損傷修復(fù)［5～7］。然而，LL-37是否能夠促進隨意皮瓣的存活目前鮮有報道。因此，本研究擬通過研究不同劑量抗菌肽LL-37干預(yù)對大鼠隨意皮瓣成活的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性Sprague–Dawley(SD)大鼠75只，6～7周齡，體質(zhì)量（220.35±20.06）g，由湖南嘉泰實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0003。隨機分為假手術(shù)組、模型組、LL-37低劑量組（0.25 mg/kg）、LL-37中劑量組（0.5 mg/kg）和 LL-37高劑量組（1.0 mg/kg），每組15只。

1.2 模型建立與藥物處理

假手術(shù)組僅切開皮瓣，立即將原位縫合，不結(jié)扎知名血管；而其它4組采用改良“McFarlane flap”法制作大鼠隨意皮瓣模型［8］。術(shù)后2 h，LL-37低、中、高劑量組大鼠分別給予0.25 mg/kg、0.5 mg/kg和1.0 mg/kg LL-37腹腔注射，正常對照組和模型組大鼠注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。

1.3 評價指標

1.3.1 大體觀察

術(shù)后1～7 d每天肉眼觀察各組大鼠皮瓣色澤、組織彈性、質(zhì)地和壞死范圍等情況。術(shù)后7 d對各組大鼠皮瓣進行攝像拍照，通過Image-Pro plus 6.0軟件分析系統(tǒng)測定皮瓣成活面積和總面積并計算皮瓣成活率，皮瓣存活率=成活面積/總面積×100%。

1.3.2 組織學(xué)觀察與計量

術(shù)后第7 d切取大鼠皮瓣距尾端3～4 cm處組織，10%多聚甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋；制3 μm切片，HE染色，于顯微鏡下觀察。另組切片按照免疫組化試劑盒說明書進行CD31染色，陽性染色呈棕黃色。先將染色切片置于低倍鏡下確定血管密度最高區(qū)域，再在高倍鏡下選取3個密度較多視野進行微血管計數(shù)并取平均值，計算出單位面積微血管數(shù)目 （microvascular density,MVD）（個/mm2）。

1.3.3 應(yīng)激與炎性產(chǎn)物檢測

選取部分皮瓣組織稱重后用超聲勻漿機制成10%勻漿液，于4℃下10 000 r/min離心20 min后取上清液，按照試劑盒說明書步驟進行操作，采用比色法檢測皮瓣組織中SOD活性和MDA含量。術(shù)后第7 d于皮瓣蒂部抽取腹壁淺動脈血液1.5 ml，4 000 r/min條件下離心15 min分離血清，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的光密度（optical density,OD）值，根據(jù)標準曲線計算各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量。

1.3.4 VEGF-A和HIF-1α的mRNA檢測

取各組大鼠皮瓣組織在冰上勻漿器中剪碎，加入Trizol研磨混勻提取樣本總RNA，紫外分光光度計測定各樣本總RNA濃度。取2 μg總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增。反應(yīng)體系為：cDNA 2 μl，引物上下游各0.4 μl，REALSYBR Mixture （×2） 10 μl，水 7.2 μl；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸32 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算VEGF-A和HIF-1α的mRNA相對表達量。

1.3.5 VEGF-A和HIF-1α的蛋白表達水平檢測

取各組大鼠皮瓣組織剪碎勻漿，加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定樣品濃度，取等量蛋白進行凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后，4℃孵育稀釋后的一抗（VEGFA、HIF-1α和GAPDH，1:1 000）12 h。次日清洗后加入相應(yīng)二抗孵育2 h。洗滌后，加入顯影液顯影成像。使用GAPDH抗體進行內(nèi)參校正，曝光圖像用Image J軟件對條帶灰度值進行分析，用目的蛋白與GAPDH灰度值比表示目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后第1 d，除假手術(shù)組外，其余各組皮瓣均出現(xiàn)不同程度的腫脹，皮瓣遠端顏色變青；術(shù)后第3 d，皮瓣壞死與成活區(qū)域開始出現(xiàn)，遠段出現(xiàn)面積不等的暗黑色壞死區(qū)，壞死部分顏色多為紅褐色伴有瘀血；術(shù)后第7 d，皮瓣中遠端壞死部分趨于融合，有黑色痂殼出現(xiàn)，皮瓣遠段不同面積壞死痂殼形成，成活與壞死區(qū)界限清楚。模型組和LL-37低劑量組皮瓣中遠端及遠端顏色發(fā)黑，表面有痂殼形成，無彈性，針刺無出血不易剝離，肉膜下炎性分泌物較多；LL-37中劑量組和LL-37高劑量組皮瓣遠端顏色發(fā)黑，表面有痂殼，無彈性。中遠端顏色淡紅，表面無痂殼形成，彈性較好，針刺皮瓣出血較多，肉膜下炎性分泌物少。皮瓣存活率如圖1所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮瓣成活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，LL-37的作用呈劑量依賴型改變，中劑量組和LL-37高劑量組皮瓣成活率均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），LL-37低劑量組無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 5組動物皮瓣成活率比較 A:假手術(shù)組；B:模型組；C:LL-37低劑量組；D:中劑量組；E:高劑量組，與假手術(shù)組比較**P<0.001，與模型組比較##P<0.001

2.2 組織學(xué)觀察與計量

組織學(xué)觀察如圖2所示，假手術(shù)組大鼠皮瓣組織結(jié)構(gòu)正常，纖維組織排列整齊，血管通暢，未見結(jié)締組織水腫和炎性細胞浸潤；模型組皮瓣組織結(jié)構(gòu)破壞，可見毛細血管增生，結(jié)締組織明顯水腫伴有大量炎性細胞浸潤；LL-37低劑量組皮瓣組織結(jié)構(gòu)破壞也較為嚴重，水腫明顯伴有炎性細胞浸潤；LL-37中劑量組皮瓣組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)，輕微水腫伴有部分炎性細胞浸潤；LL-37高劑量組皮瓣組織結(jié)構(gòu)較為完整，可見完整毛細血管，未見明顯結(jié)締組織水腫和炎性細胞浸潤。MVD(（個/mm2）測量結(jié)果：假手術(shù)組（42.17±3.09），模型組 （15.77±2.40），低劑量組 （17.35±3.08），中劑量組（18.49±2.73），高劑量組（31.05±2.99）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠MVD值顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，LL-37的作用呈劑量依賴型改變，中劑量組和高劑量組MVD值顯著增加（P<0.05），低劑量組無顯著變化（P>0.05）。

圖2 各組大鼠皮瓣組織病理學(xué)觀察 A:假手術(shù)組 B:模型組 C:LL-37低劑量組 D:中劑量組 E高劑量組 2a～2e:皮瓣組織HE染色（×200） 2a:大鼠皮瓣組織結(jié)構(gòu)正常，纖維組織排列整齊 2b:皮瓣組織結(jié)構(gòu)破壞，毛細血管增生，伴有大量炎性細胞浸潤 2c:皮瓣組織結(jié)構(gòu)破壞較為嚴重，伴有較多炎性細胞浸潤 2d:皮瓣組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)，輕微水腫伴有部分炎性細胞浸潤 2e:皮瓣組織結(jié)構(gòu)較為完整，基本未見炎性細胞浸潤 2f～2j:皮瓣組織CD31免疫組織化學(xué)染色觀察（×400） 2f:棕黃色部分較多 2g:可見零散的棕黃色部分 2h:可見部分棕黃色部分 2i:可見較多棕黃色部分 2j:可見大量棕黃色部分

2.3 應(yīng)激與炎性產(chǎn)物檢測

檢測結(jié)果見表1，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮瓣組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加，TNF-α和IL-6含量顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，LL-37的作用呈劑量依賴型改變，中劑量組和高劑量組大鼠皮瓣組織中SOD活性顯著增加，MDA含量顯著降低，TNF-α和IL-6含量顯著降低（P<0.05）；低劑量組上述指標變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 5組動物應(yīng)激與炎性產(chǎn)物檢測結(jié)果（±s）與比較

表1 5組動物應(yīng)激與炎性產(chǎn)物檢測結(jié)果（±s）與比較

images/BZ_53_205_885_502_951.pngimages/BZ_53_502_885_819_951.pngimages/BZ_53_819_885_1133_951.pngimages/BZ_53_1133_885_1453_951.pngimages/BZ_53_1453_885_1781_951.pngimages/BZ_53_1781_885_2102_951.pngSOD（U/mg）33.12±2.2018.57±1.3719.05±3.0330.06±2.3937.77±2.18<0.001images/BZ_53_205_752_502_818.pngimages/BZ_53_502_752_819_818.pngimages/BZ_53_819_752_1133_818.pngimages/BZ_53_1133_752_1453_818.pngimages/BZ_53_1453_752_1781_818.pngimages/BZ_53_1781_752_2102_818.pngimages/BZ_53_2102_752_2276_818.pngimages/BZ_53_2102_885_2276_951.pngimages/BZ_53_205_1017_502_1084.pngTNF-α （pg/ml）images/BZ_53_502_1017_819_1084.png44.36±5.05images/BZ_53_819_1017_1133_1084.png177.97±9.11images/BZ_53_1133_1017_1453_1084.png170.06±8.23images/BZ_53_1453_1017_1781_1084.png112.27±6.00images/BZ_53_1781_1017_2102_1084.png89.58±3.30images/BZ_53_2102_1017_2276_1084.png<0.001

2.4 VEGF-A和HIF-1α的mRNA和蛋白檢測

各組VEGF-A和HIF-1α的mRNA和蛋白檢測結(jié)果見表2，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮瓣組織中VEGF-A和HIF-1α的mRNA與蛋白表達水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，LL-37的作用呈劑量依賴型改變，中劑量組和高劑量組大鼠皮瓣組織中VEGF-A和HIF-1α的mRNA和蛋白表達水平均顯著增加（P<0.05），低劑量組變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表2 VEGF-A和HIF-1α的mRNA和蛋白檢測結(jié)果（±s）與比較

表2 VEGF-A和HIF-1α的mRNA和蛋白檢測結(jié)果（±s）與比較

images/BZ_53_204_1715_531_1781.pngimages/BZ_53_531_1715_843_1781.pngimages/BZ_53_843_1715_1134_1781.pngimages/BZ_53_1134_1715_1455_1781.pngimages/BZ_53_1455_1715_1776_1781.pngimages/BZ_53_1776_1715_2096_1781.pngVEGF-Aimages/BZ_53_204_1582_531_1649.pngimages/BZ_53_531_1582_843_1649.pngimages/BZ_53_843_1582_1134_1649.pngimages/BZ_53_1134_1582_1455_1649.pngimages/BZ_53_1455_1582_1776_1649.pngimages/BZ_53_1776_1582_2096_1649.pngimages/BZ_53_2096_1582_2276_1649.pngimages/BZ_53_2096_1715_2276_1781.png0.67±0.03 0.50±0.030.26±0.030.48±0.02 0.25±0.03<0.001images/BZ_53_204_1848_531_1914.pngimages/BZ_53_531_1848_843_1914.pngimages/BZ_53_843_1848_1134_1914.pngimages/BZ_53_1134_1848_1455_1914.pngimages/BZ_53_1455_1848_1776_1914.pngimages/BZ_53_1776_1848_2096_1914.pngimages/BZ_53_2096_1848_2276_1914.pngimages/BZ_53_204_1980_531_2047.png蛋白表達水平mRNA表達水平images/BZ_53_531_1980_843_2047.png1.01±0.03images/BZ_53_843_1980_1134_2047.png0.32±0.03images/BZ_53_1134_1980_1455_2047.png0.33±0.04images/BZ_53_1455_1980_1776_2047.png1.32±0.10images/BZ_53_1776_1980_2096_2047.png3.41±0.14images/BZ_53_2096_1980_2276_2047.png<0.001

3 討論

多項研究顯示，LL-37在促進組織損傷修復(fù)及誘導(dǎo)血管生成方面具有重要作用［9，10］。Carretero 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，LL-37在體外可通過誘導(dǎo)皮膚表皮細胞株遷移表型改變，活化黏附相關(guān)激酶，促進細胞的遷移能力；而對創(chuàng)面手術(shù)后的大鼠給予外源性LL-37干預(yù)后，創(chuàng)面肉芽組織形成和上皮再生速度加快。Koc?zulla等［12］研究也發(fā)現(xiàn)，敲除LL-37基因的大鼠受到創(chuàng)傷后新生血管減少。推測LL-37可能通過促進血管內(nèi)皮細胞增殖來誘導(dǎo)新生血管形成，說明LL-37介導(dǎo)的血管再生是體內(nèi)皮膚創(chuàng)傷新生血管形成的重要環(huán)節(jié)，再次強調(diào)了LL-37在創(chuàng)傷修復(fù)中的巨大應(yīng)用潛力。

本研究采用改良“McFarlane flap”法建立大鼠隨意皮瓣模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠皮瓣成活率顯著低于假手術(shù)組，提示模型構(gòu)建成功。而LL-37中劑量和高劑量干預(yù)組的皮瓣成活率較模型組顯著增加，同時HE病理染色結(jié)果顯示，皮瓣組織結(jié)構(gòu)較為完整，皮下組織炎癥狀況較輕，有新生血管形成，這些均有利于創(chuàng)面愈合［13］，說明LL-37確能提高大鼠背部隨意皮瓣的存活率，利于傷后上皮重建。

氧化應(yīng)激是皮瓣血液供應(yīng)不足、皮瓣缺血再灌注損傷的重要機制，可通過氧自由基進一步加重組織損傷［14］。組織的炎癥反應(yīng)和損傷修復(fù)對移植后的皮瓣存活率影響巨大，減輕組織損傷的炎性反應(yīng)有利于創(chuàng)傷愈合，促進移植皮瓣成活［15］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠皮瓣組織中SOD活性降低，MDA含量增加，同時血清中TNF-α和IL-6含量均顯著上升，說明皮瓣組織氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)加重，與前人研究一致［16］；而LL-37中劑量和高劑量干預(yù)組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量及皮瓣組織中MDA含量明顯下降，SOD活性增加，說明LL-37具有保護內(nèi)源性SOD活性、促進自由基清除、抑制術(shù)后皮瓣組織炎性應(yīng)激反應(yīng)的作用。

VEGF-A能促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂和增殖分化，加快皮瓣的毛細血管新生速度，是促進皮瓣成活的關(guān)鍵因子［17］。內(nèi)環(huán)境中氧平衡是機體維持穩(wěn)態(tài)的必要條件，當(dāng)皮瓣缺血發(fā)生后，缺氧也會隨之而來，HIF-1α是氧穩(wěn)態(tài)主要的調(diào)節(jié)信號因子，也是影響低氧誘導(dǎo)的血管重建的重要因子，可通過激活下游信號通路，動員內(nèi)皮細胞進入缺氧和無血管區(qū)，刺激內(nèi)皮細胞增殖，從而實現(xiàn)血管再生［18］。而MVD代表單位面積內(nèi)微血管數(shù)，能反映組織的血管生成活性［19］。劉煥興等［13］研究發(fā)現(xiàn)，移植皮瓣的新生血管形成時，皮瓣組織中VEGF的表達水平和MVD均明顯上升。本研究通過免疫組織化學(xué)染色檢測并計數(shù)各組皮瓣MVD，同時檢測皮瓣組織中VEGF-A和HIF-1α的表達水平，以評估新生血管情況。研究結(jié)果顯示，模型組大鼠 MVD、組織中 VEGF-A、HIF-1α的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，而LL-37中劑量和高劑量干預(yù)組相關(guān)指標均明顯上調(diào)，說明LL-37能通過促進組織血管新生、改善皮瓣血運、增加皮瓣血管密度，從而提高皮瓣存活率。

綜上所述，LL-37能有效刺激新生血管增生，減輕炎癥反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激水平和缺血皮瓣的壞死，促進隨意皮瓣的成活，而LL-37的干預(yù)效果與劑量相關(guān)。