加味麻杏石甘湯對放射后肺泡Ⅱ型上皮細胞IL-6、TLR2、TLR4 表達的影響

陳 珠 鐘亞珍 陳 帥 林勝友

放射性肺損傷是胸部惡性腫瘤放療后常見的一種并發(fā)癥，包括早期的急性放射性肺炎和后期的放射性肺纖維化[1]。放射性肺損傷不僅限制腫瘤放療劑量，也影響后續(xù)的治療和患者的生存質(zhì)量。本研究采用加味麻杏石甘湯在放射前干預(yù)肺泡Ⅱ型上皮細胞（AT-Ⅱ細胞），通過檢測各組白細胞介素-6（IL-6）、Toll樣受體2（TLR2）、Toll樣受體4（TLR4）mRNA 和蛋白的表達以及細胞活力，探討其干預(yù)放射性肺損傷的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞與動物 AT-Ⅱ細胞株，美國ScienCell 公司提供；清潔級SD 大鼠18 只，體質(zhì)量200～250g，雌雄各半，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2013-0016。本實驗研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審核通過，審批號：2016226。動物實驗合格證號：SYXK（浙）2013-0184。實驗期間，動物自由進食，明暗各12h。

1.2 藥物與試劑 中藥飲片（炙麻黃、石膏、赤芍、杏仁、桑白皮、金銀花、甘草），購自杭州市腫瘤醫(yī)院，浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院負責質(zhì)控；阿米福汀，購于杭州市腫瘤醫(yī)院，大連美羅公司，批號53 171201；RMPI-1640 培養(yǎng)基，Hyclone 公司，批號SH30809.01B；胎牛血清，美國Gibco 公司，批號16000-044；Trizol 試劑，美國Invitrogen 公司，批號1596-026；SYBR Green Real-time PCR 試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒，美國Thermo 公司，批號分別為#K0223、PICPI23223；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas 公司，批號#K1622；NC 膜，millipore 公司，批號HATF00010；IL-6、TLR2、TLR4一抗，美國Abcam 公司，批號分別為Ab6672、Ab16894、Ab13556；GAPDH 一抗，CST 公司，批號#5174；羊抗兔HRP 標記二抗、羊抗鼠HRP 標記二抗，碧云天公司，批號分別為A0208、A0216；青鏈霉素混合液（100X）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%），Solarbio 公司，批號分別為P1400-100、T1300-100；CCK-8 試劑，SAB 公司，批號CP002。

1.3 儀 器 ABI-7300型Real-time 檢測儀，美國ABI 公司；TG-16M型低溫冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；K30型旋渦振蕩器，青浦瀘西儀器廠；PRO200型電動勻漿機，F(xiàn)LUKO 公司；mini protean 3 cell型電泳儀，美國Bio-Rad 公司；PS-9型電轉(zhuǎn)儀，大連競邁科技有限公司；HI1210型水浴鍋，萊卡公司；Tanon-5200型成像系統(tǒng)，Tanon 公司；BHC-1300IIB2型生物安全柜，蘇州金凈凈化設(shè)備公司；Thermo Forma 3111型CO2型恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司；XDS-500C型顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；DNM-9602型酶標分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) AT-Ⅱ細胞放入含10%胎牛血清、1%雙抗（青鏈霉素混合液）的RMPI-1640 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞為貼壁細胞。

2.2 含藥血清制備 加味麻杏石甘湯由炙麻黃9g，石膏18g，赤芍、杏仁、桑白皮各12g，金銀花9g，甘草6g 組成，制成藥物濃度為2.44g/mL 水煎劑。將18 只大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組6 只，模型組12只。模型組按19.5g·kg-1·d-1予加味麻杏石甘湯煎液4mL，對照組予0.9%氯化鈉溶液4mL，灌胃給藥每天2 次，每次2mL，連續(xù)給藥3 天。末次給藥2h 后，以10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血，分別制備血清，滅活、過濾除菌、分管，同組血清混合，分裝至1mL 離心管中，-20℃凍存4 周使用，避免反復(fù)凍融。

2.3 分組及造模 將AT-Ⅱ細胞分為六組：空白對照組（10%正常大鼠血清）、模型組（10%正常大鼠血清）、含藥血清組（含藥血清濃度分別為2%、4%、10%）、阿米福汀組（10%正常大鼠血清，按4μg/mL阿米福汀[2]作用于細胞）。每組均設(shè)3 個復(fù)孔。X 線照射前藥物預(yù)培養(yǎng)0.5h，然后采用3.64Gray/min，總劑量8Gray 的X 線照射，照射后培養(yǎng)24h。

2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖活力 將處于對數(shù)生長期的AT-Ⅱ細胞，顯微鏡下計數(shù)后制成3×104個/mL的細胞懸液，按3×103個/孔接種到96 孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過夜。根據(jù)上述2.3 方法分組和處理，24h后，按1∶10 體積比混合CCK-8 和無血清必需基本培養(yǎng)基，向待測孔中加入含CCK-8 溶液100μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，用酶標儀測定450nm波長處吸光度。

2.5 Real-time PCR 檢測IL-6、TLR2、TLR4 mRNA的表達 采用Trizol 法裂解細胞，提取細胞總mRNA后，檢測RNA 的濃度和純度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用25μL 體系進行Real-time PCR 擴增獲得基因片段。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 60min，85℃5min。Real-time PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；40 個循環(huán)（95℃ 15s，60℃ 45s）。熔解曲線：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算結(jié)果。引物如下：IL-6：forward 5'-GCACCTCAGATTGTTGTTG-3'，rverse 5'-AGTGTCCTAACGCTCATAC-3'；TLR2：forward 5'-GGTGTCTGGCATGTGCTGTG-3'，rverse 5'-GCTCCTGGACCATAAGGTTCTC-3'；TLR4：forward 5'-CCGCTTTCACTTCCTCTCAC-3'，rverse 5'-CATCCTGGCATCATCCTCAC-3'；GAPDH：forward 5'-AATCCCATCACCATCTTC-3'，rverse 5'-AGGCTGTTGTCATACTTC-3'。上述引物均由基爾頓生物科技（上海）有限公司合成。

2.6 Western blot 檢測IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達采用蛋白裂解液提取AT-Ⅱ細胞總蛋白，使用BCA 法蛋白定量，加入適量上樣緩沖液，沸水浴10min 變性；SDS-PAGE 凝膠上電泳后，采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)移至NC 膜；用5%脫脂奶粉室溫封閉1h 后，加入稀釋后的一抗，4℃孵育過夜；TBST 洗膜后，加入1:1000 稀釋HRP 標記的二抗，室溫孵育1h；TBST 洗膜后，加入ECL 發(fā)光液，顯影、定影，放入成像系統(tǒng)掃描。以GAPDH 作為蛋白內(nèi)參。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料均符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用Turkey 檢驗（方差齊）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組AT-Ⅱ細胞活力比較 與空白對照組比較，射線照射后，模型組細胞活力顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，10%含藥血清組和阿米福汀組細胞活力顯著增加（P＜0.01）。與阿米福汀組比較，10%含藥血清組細胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組AT-Ⅱ細胞活力比較（%，±s）

表1 各組AT-Ⅱ細胞活力比較（%，±s）

注：空白對照組為10%正常大鼠血清處理細胞；模型組為10%正常大鼠血清處理細胞+X 線照射；2%、4%、10%含藥血清組分別為2%、4%、10%大鼠含藥血清處理細胞+X 線照射；阿米福汀組為10%正常大鼠血清和阿米福?。?μg/mL）處理細胞+X 線照射；AT-Ⅱ細胞為肺泡Ⅱ型上皮細胞；與空白對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

3.2 各組AT-Ⅱ細胞IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達水平比較 與空白對照組比較，射線照射后，模型組IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達均顯著升高（P 均＜0.01）。與模型組比較，4%、10%含藥血清組和阿米福汀組IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達均顯著下降（P均＜0.01）。與阿米福汀組比較，10%含藥血清組IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組AT-Ⅱ細胞IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達水平比較（±s）

表2 各組AT-Ⅱ細胞IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表達水平比較（±s）

注：空白對照組為10%正常大鼠血清處理細胞；模型組為10%正常大鼠血清處理細胞+X 線照射；2%、4%、10%含藥血清組分別為2%、4%、10%大鼠含藥血清處理細胞+X 線照射；阿米福汀組為10%正常大鼠血清和阿米福?。?μg/mL）處理細胞+X 線照射；IL-6 為白細胞介素-6；TLR2 為Toll樣受體2；TLR4 為Toll樣受體4；與空白對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

3.3 各組AT-Ⅱ細胞IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，射線照射后，模型組IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達均顯著升高（P 均＜0.01）。與模型組比較，10%含藥血清組和阿米福汀組IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達顯著下降（P 均＜0.01）。與阿米福汀組比較，10%含藥血清組IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組AT-Ⅱ細胞IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表達

4 討論

放射性肺損傷是胸部惡性腫瘤放療的主要限制因素，發(fā)生率高達20.3%～36.9%[1，3]，降低了療效和患者的生存質(zhì)量，嚴重時可導(dǎo)致死亡。阿米福汀是臨床上常用的細胞保護劑，Devine 和Marignol[4]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，阿米福汀可以使非小細胞肺癌患者放療后發(fā)生急性肺毒性的風險降低44%。但阿米福汀價格昂貴且副作用較大，難以廣泛應(yīng)用。

Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）是一種重要的模式識別受體，可通過識別配體參與細胞的固有免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[5]。肺泡上皮細胞可表達多種TLRs 參與固有免疫，包括TLR2 和TLR4[6]。研究表明，脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷通過激活TLR4/NF-κB信號通路促進炎癥介質(zhì)的釋放，如TNF-α、IL-6 等[7]，抑制TLR4/NF-κB 能改善LPS 誘發(fā)的急性肺損傷[8-9]。Kong 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸可通過抑制TLR2 減少脂多糖引起的急性肺損傷。李超等[11]研究表明，養(yǎng)陰清熱化瘀方可能通過抑制“TLR4/NF-κB”信號通路，發(fā)揮放射防護作用。

放射性肺損傷臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、氣短乏力、咽干口燥等癥狀，可歸屬中醫(yī)“咳嗽”“喘癥”“肺痿”等范疇[12]。中醫(yī)認為，放射線屬熱毒燥邪，耗氣傷津，灼津煉液成痰，并可灼傷肺絡(luò)，日久損傷人體正氣和陰血。加味麻杏石甘湯在炙麻黃、石膏、杏仁、甘草的基礎(chǔ)上，加入赤芍、桑白皮、金銀花，以加強其清熱解毒，宣肺平喘之效。臨床經(jīng)驗性用藥發(fā)現(xiàn)，加味麻杏石甘湯對放射性肺炎急性期的患者具有較好的治療效果[13]。本課題組前期實驗研究表明，麻杏石甘湯可以明顯減輕放療對大鼠模型的炎性損傷[14]，加味麻杏石甘湯對TGF-β1/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子有多靶點的調(diào)控作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示，10%含藥血清組細胞活力明顯高于模型組（P＜0.01），10%含藥血清組細胞中IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.01）。提示加味麻杏石甘湯可改善輻射對AT-Ⅱ細胞增殖的抑制作用，并下調(diào)IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白的表達。

綜上所述，加味麻杏石甘湯可能通過抑制TLR2、TLR4 表達，從而抑制TLR 信號通路的傳導(dǎo)及其下游炎癥因子IL-6 的釋放，減輕放射性肺損傷。此外，放射性肺損傷發(fā)病機制復(fù)雜，對加味麻杏石甘湯放射防護的詳細機制還有待進一步研究和探討。