薯蕷皂苷通過調(diào)節(jié)人髓核細(xì)胞TLR4/NF-κB信號通路抑制IL-1β誘導(dǎo)的分解代謝和凋亡

高維松，王隆輝，顧運(yùn)濤，趙 海，齊 昊，吳昌新

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨科，海南 ?？?70102)

椎間盤是脊柱結(jié)構(gòu)的重要組成部分，其可吸收、減輕和傳遞加載在脊柱上的負(fù)荷，增加脊柱的活動性[1]。然而，在衰老、外傷、肥胖、機(jī)械應(yīng)力的作用下，椎間盤微環(huán)境會出現(xiàn)變化，引起椎間盤細(xì)胞功能低下及其結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)相關(guān)疾病，如椎間盤源性腰痛和椎間盤突出癥[2-3]。而關(guān)于IDD的具體病理生理機(jī)制目前尚不清楚，仍需要進(jìn)一步研究以制訂有效的防治策略。

髓核(nucleus pulposus，NP)細(xì)胞存在于含有Ⅱ型膠原和蛋白多糖的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中，后者的保水能力是抵抗脊柱壓縮軸向力的必要條件[4-5]。在健康的NP組織中，NP細(xì)胞維持ECM的代謝平衡，包括aggrecan和膠原，其功能狀態(tài)以及數(shù)量直接關(guān)系到ECM的代謝平衡[6]。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)已被證明能夠通過觸發(fā)多種炎癥信號通路，如激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和有絲分裂原蛋白激酶通路，從而增強(qiáng)促炎因子的表達(dá)，擾亂ECM代謝的平衡，促進(jìn)ECM的分解代謝[7]。故抑制NP細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及相應(yīng)的炎癥通路是一個很有前景的治療IDD的策略。

薯蕷皂苷(dioscin,Dio)是一種從草藥中提取的天然甾體皂苷[8]。目前大量研究表明，Dio在各種疾病中具有抗炎、抗凋亡和抗氧化的作用[9-11]，其可通過減少促凋亡蛋白的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的急性肝損傷[12]；也可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、自噬和DNA損傷抑制肝癌[13]；還可通過激活SIRT1/AMPK信號通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，預(yù)防非酒精性脂肪肝[14]。還有研究報道，Dio可通過抑制Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)信號傳導(dǎo)減輕腦缺血/再灌注損傷[15]。故本研究認(rèn)為Dio可能對IDD有一定的保護(hù)作用。目前，關(guān)于Dio對IDD的潛在影響還未見相關(guān)報道。因此，本研究探討Dio對IL-1β誘導(dǎo)的人NP細(xì)胞的作用及潛在機(jī)制，以期為臨床治療IDD提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體

Dio(純度大于99%)購自上海陶托生化技術(shù)有限公司，IL-1β購自美國RD公司，一抗(Ⅱ型膠原、TLR4、NF-κB p65、IκBα和β-actin)購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 原代人NP細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人體NP組織收集符合海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會的指導(dǎo)原則，并取得患者或其親屬對獲取椎間盤組織的知情同意書。人NP細(xì)胞培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[16]，將培養(yǎng)后的第2～3代NP細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將人NP細(xì)胞分為control組、IL-1β組、IL-1β+Dio 100 ng·mL-1組和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1組，IL-1β組、IL-1β+Dio 100 ng·mL-1組和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1組分別用10 ng·mL-1IL-1β、100 ng·mL-1Dio和500 ng·mL-1Dio處理1 d。

1.3 NP細(xì)胞活力檢測

將NP細(xì)胞接種于96孔板(每孔5×103～6×103個細(xì)胞)中培養(yǎng)1 d，用不同濃度的Dio和IL-1β(10 ng·mL-1)孵育。孵育1 d后，按照CCK-8說明書要求，每孔加入CCK-8溶液(10 μL)2 h，用分光光度計測定樣品在450 nm波長處的吸光度。

1.4 免疫熒光分析

Ⅱ型膠原染色時，將NP細(xì)胞接種于玻片上培養(yǎng)。藥物處理后，用4%多聚甲醛處理固定15 min，然后用0.5% Triton X-100處理10 min，隨后在含5% BSA的封閉緩沖液中孵育30 min。在4 ℃下用一抗(抗Ⅱ型膠原)處理過夜，次日用對應(yīng)的二抗處理1 h。漂洗后用DAPI處理10 min，然后用抗熒光猝滅劑封片。用激光共聚焦顯微鏡對免疫染色樣品進(jìn)行拍攝。

1.5 Western blot

藥物處理后，細(xì)胞樣品添加細(xì)胞裂解液以提取細(xì)胞蛋白，同時用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，并配備標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣品。上樣品(40 μg)加入SDS凝膠進(jìn)行電泳(100 V)，并通過電轉(zhuǎn)膜(300 mA，90 min)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。利用5%脫脂牛奶封閉阻斷非特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)后，樣本在4 ℃下用一抗(1∶1 000)孵育過夜，在37 ℃下用二抗(1∶10 000)孵育60 min。使用ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行曝光和檢測。

1.6 定量RT-PCR

用TRIzol法提取NP細(xì)胞總mRNA。用RNA樣品、Prime-Script RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNAs。用SYBR-Green-PCR試劑盒擴(kuò)增cDNAs(變性、退火、延伸)。用2-ddCt法定量mRNA表達(dá)，計算其與β-actin基因的相對表達(dá)水平。

1.7 NO與PGE2表達(dá)測定

用Griess法測定NO濃度。Dio預(yù)處理2 h后，用IL-1β(10 ng·mL-1)刺激軟骨細(xì)胞24 h，用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)液中前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Dio改善IL-1β刺激下人NP細(xì)胞活性

CCK-8法結(jié)果顯示，Dio在1～1 000 ng·mL-1劑量下對NP細(xì)胞活力沒有影響(圖1a)。NP細(xì)胞用IL-1β和不同濃度的Dio(1、10、100、500 ng·mL-1)處理1 d后顯示，Dio對IL-1β刺激的NP細(xì)胞活力有劑量依賴性保護(hù)作用(圖1b)。

a:CCK-8法檢測不同濃度Dio對人NP細(xì)胞的毒性作用;b:Dio對IL-1β刺激下人NP細(xì)胞的活性分析 *:與control組相比,P<0.05；#:與IL-1β組相比,P<0.05

2.2 Dio降低IL-1β刺激下的人NP細(xì)胞PGE2和NO生成

與control組相比，IL-1β組NO和PGE2表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1組和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1組PGE2和NO表達(dá)受到抑制(P<0.05)，見圖2。

a:ELISA法測定PGE2水平;b:Griess法測定培養(yǎng)基中NO的含量

2.3 Dio抑制IL-1β刺激下人NP細(xì)胞iNOS和COX-2水平

與control組相比，IL-1β組COX-2和iNOS的表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1組和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1組COX-2和iNOS mRNA水平降低(P<0.05)，見圖3。

a:RT-PCR檢測iNOS mRNA的表達(dá);b:RT-PCR檢測COX-2 mRNA的表達(dá) *:與control組相比，P<0.05;#:與IL-1β組相比，P<0.05

2.4 Dio抑制IL-1β刺激下人NP細(xì)胞的ECM降解

與control組相比，IL-1β組collagenⅡ和aggrecan的水平降低(P<0.05)，見圖4a、b；與IL-1β組相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1組和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1組collagenⅡ和aggrecan mRNA水平較高。collagenⅡ免疫熒光染色結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果一致(圖4c)。

a:RT-PCR檢測collagenⅡ的相對mRNA水平;b:aggrecan的相對mRNA水平;c:collagenⅡ蛋白(綠色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)的免疫熒光染色 *:與control組相比,P<0.05；#:與IL-1β組相比,P<0.05

2.5 Dio抑制IL-1β刺激下人NP細(xì)胞的炎癥因子以及NF-κB信號通路

RT-PCR結(jié)果顯示，與control組相比，IL-1β組IL-6和TNF-α的表達(dá)增加(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1組和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1組IL-6和TNF-α的表達(dá)降低(P<0.05)，見圖5a、b。與control組相比，IL-1β組TLR4水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1組和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1組TLR4水平下調(diào)(P<0.05)，見圖5c、d。與control組相比，IL-1β組NF-κB p65蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1組和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1組NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖5c、e。與control組相比，IL-1β組誘導(dǎo)人NP細(xì)胞IκBα降解(P<0.05)；與IL-1β組相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1組和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1組人NP細(xì)胞IκBα降解被顯著抑制(P<0.05)，見圖5c、f。

a:RT-PCR檢測IL-6的相對mRNA水平;b:RT-PCR檢測TNF-α的相對mRNA水平;c～f：Western blot檢測TLR4、NF-κB p65和IκBα的相對mRNA水平 *：與control組相比，P<0.05；#：與IL-1β組相比，P<0.05

3 討論

IDD是引起腰痛的主要原因之一[17]。衰老、代謝失衡、機(jī)械應(yīng)激、炎癥與IDD的發(fā)病有關(guān)[18-19]。然而，IDD的具體病理機(jī)制尚未完全闡明。椎間盤組織由中央NP組織、周圍纖維環(huán)組織和軟骨終板組成。健康的NP組織維持ECM的代謝平衡，包括aggrecan和膠原，后者保證NP正常的生物力學(xué)功能。有研究報道，NP在IDD早期表現(xiàn)出退行性表型，如ECM丟失、NP細(xì)胞數(shù)量減少等[1]。故探究IDD中NP退變的機(jī)制以及針對性地增加NP細(xì)胞的數(shù)量和改善其功能是治療IDD的重要策略。

炎癥在IDD中NP細(xì)胞凋亡以及功能低下的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[20]。炎癥介質(zhì)升高可能導(dǎo)致NP細(xì)胞凋亡以及ECM的降解[21]。在這些炎癥介質(zhì)中，IL-1β在IDD的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[22]。IL-1β可刺激NP細(xì)胞以及骨關(guān)節(jié)炎中的軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)的釋放，包括PGE2和NO，后者可通過觸發(fā)MMPs合成并抑制IDD中NP細(xì)胞的基質(zhì)合成而被證明是分解代謝因子[23-24]。PGE2和NO的產(chǎn)生可導(dǎo)致IDD的發(fā)展[25]。NO被廣泛認(rèn)為是能夠觸發(fā)MMP分泌和激活的炎性介質(zhì)，在IDD病理過程中，NO也可以抑制aggrecan和Ⅱ型膠原的產(chǎn)生。PGE2是炎癥和疼痛的主要介質(zhì)，可在IDD發(fā)病過程中增強(qiáng)ECM降解并抑制NP細(xì)胞增殖。先前的研究表明，抑制包括NO和PGE2在內(nèi)的炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生會減弱IDD的進(jìn)展[26]。本研究結(jié)果顯示，Dio可顯著抑制IL-1β刺激下的NP細(xì)胞COX-2和iNOS的mRNA水平以及PGE2和NO的生成，同時Dio對IL-1β誘導(dǎo)的ECM的分解代謝也有顯著的抑制作用，表明Dio可通過抑制IL-1β介導(dǎo)的炎性介質(zhì)的表達(dá)，起到保護(hù)NP細(xì)胞功能的作用。

據(jù)報道，椎間盤NP組織的過度炎癥反應(yīng)與其分解代謝水平的增加密切相關(guān)[27-28]。因此，抑制炎癥反應(yīng)可能有助于預(yù)防NP細(xì)胞分解代謝和改善IDD。TLR信號通路的激活被證明可以增強(qiáng)炎癥介質(zhì)(如TNF-α、IL-1和IL-6)的表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[29]。TLR4在骨關(guān)節(jié)炎以及IDD過程中過表達(dá)，在退變過程中起重要作用[30]。同樣，體內(nèi)外研究表明，促進(jìn)炎癥因子(iNOS以及COX-2等)的釋放可減少NP細(xì)胞ECM的含量，后者可通過增加TLR4的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[31-32]。配體與TLR4結(jié)合觸發(fā)信號級聯(lián)，促進(jìn)NF-κB信號激活，從而增加炎性細(xì)胞因子和降解酶的表達(dá)。LPS作為一種TLR4的特異性配體，可通過激活TLR4信號通路，促進(jìn)小鼠和人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞collagenⅡ和aggrecan的降解[33]。在相關(guān)模型中，抑制TLR4可間接抑制NF-κB通路，減少iNOS以及COX-2的轉(zhuǎn)錄，從而減少NO、PGE2、IL-6和TNF-α的釋放[34]。IL-1β可促進(jìn)NP細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和基質(zhì)降解酶的釋放[35]。先前的研究表明，IL-1β在NP細(xì)胞中顯著上調(diào)，提示IL-1β在IDD過程中可能起關(guān)鍵作用[7]。在本研究中，IL-1β可顯著提高人NP細(xì)胞TLR4水平，激活NF-κB信號通路。IL-1β通過上調(diào)基質(zhì)降解酶促進(jìn)ECM蛋白降解。然而，Dio可減弱IL-1β刺激的人NP細(xì)胞TLR4/NF-κB通路的激活，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解。研究表明，Dio對多種疾病具有抗炎作用，如Dio可通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88信號通路，顯著抑制IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB p65的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)[12]，其還可通過抑制NF-κB途徑抑制TNF-α激活的血管細(xì)胞黏附分子-1和內(nèi)皮脂肪酶的表達(dá)[36]。本研究結(jié)果也顯示，Dio可抑制IL-1β觸發(fā)的炎癥因子(TNF-α、IL-6、NO和PGE2)的釋放，該效應(yīng)可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來實(shí)現(xiàn)。

綜上，本研究顯示TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能與Dio抑制IL-β激活的NP細(xì)胞炎癥反應(yīng)和分解代謝有關(guān)，Dio可抑制IL-1β觸發(fā)的炎癥因子(TNF-α、IL-6、NO和PGE2)的釋放。本研究結(jié)果為Dio的藥理作用及機(jī)制提供了初步證據(jù)，為臨床治療IDD提供了新的可能。