阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A對百草枯中毒大鼠肺纖維化的緩解作用

時 潔，劉 偉，周 蓮，劉衛(wèi)紅，耿曉康

(1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院西醫(yī)部藥劑科，湖北 恩施 445000；2.華潤武鋼總醫(yī)院放射科，湖北 武漢 430080；3.恩施州中心醫(yī)院婦兒醫(yī)院藥劑科，湖北 恩施 445000)

百草枯(1,1’-二甲基-4,4’-聯(lián)吡啶二氯化物)是一種非選擇性接觸性除草劑，對人類有劇毒，中毒后死亡率極高。肺是百草枯中毒的主要靶器官，肺損傷引起的呼吸衰竭是最常見的死亡原因[1]。患者往往同時出現(xiàn)肺泡破裂導致的肺氣腫和纖維化導致的肺不張，而使用呼吸機會加重病情[2]。

細胞外基質的組成和力學性質在肺纖維化的發(fā)展過程中發(fā)生了顯著改變，可誘導肺纖維化和肺不張[3]。肺纖維化和肺不張可能是百草枯中毒后機體維持肺泡結構完整的機制之一。當前并沒有針對百草枯中毒的特效藥，只能做一些血液凈化和對癥治療[4]。主流的抗炎和抗氧化藥物對百草枯中毒療效有限[5]，因此，尋找百草枯中毒的新機制是其治療的突破口。有研究認為，百草枯中毒會導致肺泡細胞的上皮—間質轉化樣細胞反應，以避免細胞死亡[6]。此外，百草枯中毒還可導致緊密連接的關鍵蛋白ZO-1等丟失[7]?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一類主要的細胞外基質降解酶，百草枯中毒后，MMP也被誘導表達[8]。肺泡細胞的上皮—間質轉化的激活、ZO-1等丟失和MMP的誘導可能與炎癥相互促進[9]，共同導致了肺泡結構的不穩(wěn)定性。抑制這種細胞外基質不穩(wěn)定性的改變，抑制炎癥，打破相互促進的循環(huán)，可能有利于百草枯中毒的治療。阿托伐他汀具有抑制MMP活性，改善百草枯所致肺損傷的作用[8]。免疫抑制劑環(huán)孢素A通過調節(jié)炎癥反應和MMP，可減輕移植中的氣道重塑和纖維化[9]，也能抑制百草枯導致的肺纖維化[10]。本研究通過探索阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A對百草枯中毒大鼠細胞外基質改變和炎癥及肺纖維化的療效，以期為臨床治療百草枯中毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

20%百草枯溶液(批號：SNA8F03206)購自江蘇南通的先正達南通農作物保護有限公司；阿托伐他汀(批號：H20133127，樂普醫(yī)藥)；環(huán)孢素A(批號：H10960122，中美華東制藥)；羥脯氨酸含量檢測試劑盒(批號：AKAM017C，北京盒子生工)；Masson’s染色試劑盒(批號：1.00485，Sigma，美國)；蘇木精/伊紅(HE，批號：C0105S)、TNF-α(批號：PT516)、IL-1β(批號：PI303)、IL-6(批號：PI328)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒、SOD(批號：S0086)、MDA(批號：S0131S)、GSH試劑盒(批號：S0073)、RIPA裂解液(批號：P0013C)、BCA蛋白定量試劑盒(批號：P0012)均購自上海碧云天；TGF-β(批號：3709)、Collagen Ⅰ(批號：91144)、E-cadherin(批號：14472)、Vimentin(批號：5741)、α-SMA(批號：19245)、β-actin(批號：4970)和山羊抗兔(批號：7074)均購自美國CST;MMP-9(批號：ab228402)、MMP-2(批號：ab92536)、Collagen Ⅲ(批號：ab6310)購自英國Abcam公司。

1.2 動物實驗

Wistar大鼠50只，體質量180～220 g，6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。每籠3只喂養(yǎng)于SPF動物房，環(huán)境條件：22 ℃，光照12 h/黑暗12 h，常規(guī)飲食，自由攝食和飲水，實驗前習慣1周。隨機分為對照(Control)組、模型(PQ)組、阿托伐他汀(PQ+STN)組、環(huán)孢素A(PQ+CsA)組、聯(lián)合用藥(PQ+STN+CsA)組，每組10只。Control組給予生理鹽水1 mL灌胃，其余4組單次給予單劑量百草枯20 mg/kg灌胃以染毒。然后，PQ組以生理鹽水1 mL灌胃，PQ+STN組、PQ+CsA組以及PQ+STN+CsA組分別以阿托伐他汀20 mg/kg[11]、環(huán)孢素A 10 mg/kg[12]以及阿托伐他汀20 mg/kg+環(huán)孢素A 10 mg/kg灌胃，每天1次。給藥7 d后，腹膜內注射3%戊巴比妥鈉600 μL，麻醉后立即處死。收集心內血液約4 mL，以5 000 r/min離心5 min后將血清儲存于-70 ℃。將每只大鼠的左肺放在冷凍的移液管中，于-70 ℃下保存，用以檢測組織蛋白表達。

1.3 肺濕重/干重比、羥脯氨酸含量測定及組織染色

濾紙充分吸干右上肺水分，測量濕重，充分干燥后測量干重，計算濕重/干重比。右后肺葉剪去部分組織調整重量至大致相等，剪碎，加6 mol/L鹽酸(1 g組織：100 mL鹽酸)，120 ℃孵育12 h，濾掉雜質。取1 mL濾液，氫氧化鈉調整pH值于6.5～7.0，加1 mL氯胺酮溶液(50 mmol/L)室溫孵育20 min，1 mL二甲基苯甲醛溶液(200 mL/L)60 ℃孵育20 min，采用多功能酶標儀(型號Varioskan LUX，賽默飛，上海)測量550 nm處吸光度值，以標準品濃度與吸光度值的標準曲線計算樣品羥脯氨酸含量。

將大鼠右副肺葉浸入10%的多聚甲醛緩沖液中固定后包埋在石蠟中。隨后將肺葉分離并矢狀切成5 μm厚的切片，進行HE和Masson’s染色。通過光學顯微鏡檢查切片，并評估肺組織損傷和纖維化。染色的每個樣本至少觀察來自不同部位的6片。

1.4 ELISA檢測肺組織IL-1β、TNF-α和IL-6含量

肺組織在液氮研磨，加少許生理鹽水獲得勻漿，10 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA試劑盒測量蛋白濃度并配平。使用ELISA試劑盒按說明書測定肺組織中的IL-1β、TNF-α和IL-6含量。

1.5 Western blot檢測TGF-β、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin和α-SMA等細胞移動能力相關蛋白的表達

肺組織加入RIPA裂解液在冰上研磨，10 000 r/min離心15 min，取上清。BCA試劑盒測量蛋白濃度并配平，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min。在10% SDS-PAGE膠上按一般要求電泳后，轉移至甲醇浸沒過的PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，一抗孵育過夜，二抗孵育1 h，前后均用TBST清洗3次。膜上滴加ECL顯色液，在高靈敏發(fā)光成像儀中拍照。條帶用Image J半定量。

1.6 肺組織SOD、MDA和還原型GSH測定

取1.5所得平衡后的溶液，根據說明書測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量。

1.7 統(tǒng)計學方法

定量和半定量數(shù)據用GraphPad Prism 6.0軟件統(tǒng)計并作圖。數(shù)據均采取雙側單因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s多重比較分析差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況

PQ組大鼠百草枯染毒后次日開始出現(xiàn)嗜睡，進食飲水減少，呼吸急促，口周、鼠尾及腳趾發(fā)紺，呼吸困難等癥狀；其他組大鼠在百草枯染毒3 d后開始出現(xiàn)以上癥狀，但相對較輕。未發(fā)現(xiàn)死亡及其他不適。

2.2 肺組織損傷和纖維化

HE染色結果顯示，與Control組比較，PQ組肺泡壁變厚、免疫細胞聚集、肺泡破裂；Masson’s染色顯示肺組織明顯纖維化。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組均可一定程度抑制百草枯導致的肺泡壁變厚、炎性細胞浸潤和肺泡破裂等肺損傷的表現(xiàn)(圖1a)，減輕肺纖維化(圖1b)，其中PQ+STN+CsA組與PQ組的差異最顯著。與Control組比較，PQ組肺濕重/干重比升高(P<0.05)、肺羥脯氨酸含量增加(P<0.01)。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組大鼠肺濕重/干重比及肺羥脯氨酸含量均降低(P<0.05)，見圖1c、d。說明阿托伐他汀和環(huán)孢素A能減輕百草枯染毒大鼠的肺纖維化，且兩藥共用效果更佳。

a：肺組織HE染色(×40)；b：肺組織Masson’s染色(×400)；c：右上肺濕重/干重比；d：右后肺葉羥脯氨酸含量 *：與Control組比較，P<0.05，#：與Control組比較，P<0.01；△：與PQ組比較，P<0.05；▲：與PQ組比較，P<0.01

2.3 肺部炎癥因子

與Control組比較，PQ組TNF-α、IL-1β和IL-6升高(P<0.01)。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組均能降低百草枯誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。說明阿托伐他汀和環(huán)孢素A均能減輕百草枯誘導的肺部炎癥。

a：肺組織TNF-α表達量；b：肺組織IL-1β表達量；c：肺組織IL-6表達量 #：與Control組比較，P<0.01；△：與PQ組比較，P<0.05；▲：與PQ組比較，P<0.01

2.4 肺氧化應激反應

與Control組比較，PQ組MDA增加(P<0.01)，SOD和GSH降低(P<0.01)。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組均能增加百草枯誘導的SOD和GSH，降低MDA，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。說明阿托伐他汀和環(huán)孢素A均能減輕百草枯誘導的氧化應激反應。

a：肺組織SOD含量；b：肺組織MDA含量；c：肺組織GSH含量 #：與Control組比較，P<0.01；△：與PQ組比較，P<0.05；▲：與PQ組比較，P<0.01

2.5 肺纖維化標志物

與Control組比較，PQ組TGF-β、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ升高(P<0.01)。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組均能降低百草枯誘導的TGF-β、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。表明阿托伐他汀和環(huán)孢素A可抑制百草枯誘導的肺纖維化。

a：Western blot檢測3種蛋白的表達；b：TGF-β相對表達量；c：Collagen Ⅰ相對表達量；d：Collagen Ⅲ相對表達量 #：與Control組比較，P<0.01；△：與PQ組比較，P<0.05；▲：與PQ組比較，P<0.01

2.6 肺細胞移動性標志蛋白表達

與Control組比較，PQ組MMP-2、MMP-9、Vimentin和α-SMA升高(P<0.01)，E-cadherin降低(P<0.01)。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組MMP-2和MMP-9表達明顯降低(P<0.05)，見圖5a～c。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組不同程度抑制Vimentin和α-SMA表達，激活E-cadherin表達，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5a、d～f。表明聯(lián)合用藥能有效抑制細胞移動性標志蛋白的高表達。

a：細胞移動性相關蛋白的表達；b：MMP-2相對表達量；c：MMP-9相對表達量；d：Vimentin相對表達量；e：E-cadherin相對表達量；f：α-SMA相對表達量 #：與Control組比較，P<0.01；△：與PQ組比較，P<0.05；▲：與PQ組比較，P<0.01

3 討論

肺纖維化導致肺不張和呼吸衰竭是百草枯中毒患者最致命的病理狀況[13]，而當前尚無有效應對措施，病情稍重患者病死率接近100%[2]。在以往的研究中，阿托伐他汀和環(huán)孢素A等藥物均表現(xiàn)出對百草枯中毒患者肺纖維化的防治作用[11-12]。阿托伐他汀與環(huán)孢素A均可不同程度減輕百草枯誘導的肺組織損傷和纖維化，減輕氧化應激反應，降低纖維化與細胞移動性標志蛋白的表達，且阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A具有更好的療效。本研究聯(lián)用阿托伐他汀與環(huán)孢素A，嘗試抑制細胞外基質不穩(wěn)定性的改變及炎癥，以打破炎癥與細胞外基質不穩(wěn)定性的相互促進，治療百草枯中毒大鼠。

當前認為百草枯的毒理機制主要是誘導線粒體產生大量活性氧物質(reactive oxygen specie，ROS)，誘導細胞凋亡[4,14]。百草枯與肺泡細胞吸收的天然多胺具有結構相似性，因此百草枯會濃縮在I型和Ⅱ型肺泡細胞中，導致肺中百草枯的濃度比血漿中高10～20倍，引起氧化還原循環(huán)并產生大量的活性氧[3]。一些能夠降低ROS的療法往往也能延緩病程。如在大鼠中，阿司匹林可以改善線粒體動力學，減少ROS生成，進而降低百草枯的毒性[15]。而在臨床上，自由基清除藥物依達拉奉雖然能有效延緩病程，但是并不能改變疾病轉歸[3]，可見單純的抗氧化難以發(fā)揮足夠的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀和環(huán)孢素A均能降低MDA，升高SOD和GSH，提示其能一定程度抑制ROS產生，且二者共同作用后效果更明顯?？紤]到阿托伐他汀和環(huán)孢素A并不具有直接的抗氧化能力，其抑制ROS的效果可能是通過對病程的抑制間接產生的。

ROS導致炎癥反應并與其相互促進，進而加重病情[4]。百草枯能激活炎性免疫細胞，分泌炎癥因子，促進炎癥反應，增加細胞外基質的不穩(wěn)定性。因此免疫缺陷的大鼠百草枯中毒的癥狀相對較輕[16]。對于百草枯中毒所致炎癥，免疫抑制可能是較好抗炎的選擇[17]。環(huán)孢素A是一種較為常用的免疫抑制劑，以往研究顯示其能抑制百草枯中毒導致的炎癥反應[10]。本研究結果也表明環(huán)孢素A可以抑制百草枯導致的炎癥反應，同時阿托伐他汀也能一定程度抑制百草枯誘導的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達，二者共用效果更明顯。

百草枯中毒后，會誘導上皮—間質轉化樣細胞反應，從而阻止肺上皮細胞凋亡[6]，此外，百草枯中毒還會導致緊密連接破壞[7]，MMP表達增加[8]。分析其原因可能是細胞移動性增加，導致肺泡結構不穩(wěn)定而致。肺纖維化可能是這種細胞外基質改變造成的肺泡破裂傾向的某種負反饋調節(jié)機制導致。一方面，TGF-β常鑲嵌于細胞外基質，在細胞外基質受損時釋放，激活炎癥，是誘導肺纖維化的重要調節(jié)蛋白[5]；Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ往往存在于皮膚等組織中，在肺組織中較少。纖維化發(fā)生時，肺部Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ會異常沉積[18]，TGF-β、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ在肺中的表達提示肺細胞外基質改變。百草枯升高了TGF-β、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達，而阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A能有效降低其表達。另一方面，MMP-2和MMP-9是調控細胞外基質降解以及細胞移動性的關鍵酶，二者可被多種百草枯中毒的解救藥物抑制[8]。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可抑制MMP-2和MMP-9，使細胞外基質更為穩(wěn)定，能降低肺泡破裂的可能性，減弱纖維化相關病理進程；炎癥的過度激活本身也會導致MMP激活及細胞外基質降解，導致肺纖維化，這可能是脂多糖之類的致炎因子誘導肺纖維化的機制[19]。抑制MMP也能減少炎癥的過度激活，進而延緩病情。上述研究與本研究共同表明，抑制肺泡破裂傾向進而抑制纖維化，可能是阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A發(fā)揮藥效的關鍵機制。

綜上，阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A可從多角度降低百草枯中毒所致肺纖維化程度，其作用機制包括抑制炎癥、氧化應激和降低細胞移動性。本研究的不足之處在于，環(huán)孢素A是典型的肝藥酶抑制劑，會延長阿托伐他汀體內清除的周期[20]，因此，阿托伐他汀的劑量難于把握，本研究僅僅給出一個免疫抑制劑和他汀類聯(lián)用可能更有利于治療肺纖維化的提示，具體何種藥物組合以及劑量效果更佳更安全，有待大量研究進一步證實。