時鐘基因Rev-erbα對心肌缺血再灌注損傷保護機制的研究進展

田浩，張藝，熊永紅，夏中元

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060)

心血管疾病是21世紀(jì)影響人類健康的首要問題，《中國心血管健康與疾病報告2019》[1]顯示：中國有大約3.3億心血管疾病患者，其中冠心病患者1 100萬。包括冠心病在內(nèi)的一系列缺血性心臟疾病的防治一直是臨床研究的重點?；謴?fù)血液循環(huán)是缺血性心肌病治療的關(guān)鍵，臨床上采取各種措施來疏通梗阻的血管，以保障心肌有效的血液供應(yīng)。然而心肌在恢復(fù)血供后往往會出現(xiàn)損傷加重的現(xiàn)象，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。目前，MIRI的發(fā)生機制仍未完全明確，普遍認(rèn)為再灌注時氧自由基爆發(fā)、鈣超載、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)能量代謝障礙、細胞自噬、細胞鐵死亡、炎癥、血管內(nèi)皮細胞功能障礙等是缺血再灌注損傷病理過程發(fā)生發(fā)展的重要原因[2]。近年來，時鐘基因Rev-erbα在MIRI中的相關(guān)保護機制研究逐漸增多[3-4]，因而人們對缺血性心臟疾病的防治也有了新的認(rèn)識。時鐘基因Rev-erbα是核受體超家族的成員，涉及許多生理和病理過程的調(diào)控，如睡眠障礙、能量代謝。近年來關(guān)于時鐘基因與人類疾病關(guān)系的研究不斷增多，據(jù)相關(guān)研究報道，時鐘基因Rev-erbα參與糖尿病心臟病、動脈粥樣硬化、心肌肥大等心血管疾病的病理生理進程[5-6]?，F(xiàn)就Rev-erbα在MIRI保護機制中的相關(guān)研究進展予以綜述，以期為缺血性心臟疾病的防治提供新思路。

1 晝夜節(jié)律與Rev-erbα

1.1晝夜節(jié)律 大多數(shù)生物通過光線、溫度和食物等來預(yù)測生存環(huán)境的日常變化，以獲得對其最佳的適應(yīng)性。在動物、植物、真菌和細菌中觀察到顯著的日常行為和生理節(jié)律，這些節(jié)律被稱為晝夜節(jié)律，是晝夜節(jié)律生物鐘的自主內(nèi)在計時系統(tǒng)的外在表現(xiàn)[7]。

晝夜節(jié)律計時系統(tǒng)由位于下丘腦視交叉上核的中樞生物鐘以及全身其他腦區(qū)和器官組織(包括肌肉、脂肪組織和肝臟)的外圍生物鐘組成[8]。視交叉上核包含大約20 000個神經(jīng)元，每個神經(jīng)元均被認(rèn)為包含一個細胞自主晝夜節(jié)律振蕩器。視交叉上核神經(jīng)元通過與視網(wǎng)膜的直接突觸連接來接收有關(guān)環(huán)境光強度的信息，從而使視交叉上核振蕩器的相位適應(yīng)光周期。此外，視交叉上核通過神經(jīng)、內(nèi)分泌、溫度和攝食行為等信號同步外圍生物鐘。

分子水平上，晝夜節(jié)律由兩個連鎖的轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋環(huán)產(chǎn)生，這兩個反饋環(huán)共同作用，從而產(chǎn)生24 h基因表達節(jié)律。核心轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋環(huán)由4種完整的時鐘蛋白驅(qū)動：兩種激動劑晝夜節(jié)律運動輸出周期故障(circadian locomotor output cycles kaput，Clock)和腦和肌肉芳香烴受體核轉(zhuǎn)運樣蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1，Bmal1)及兩種阻遏劑周期蛋白(period，Per)和隱花色素蛋白(cryptochrome，Cry)。Clock和Bmal1是堿性螺旋環(huán)-螺旋-周期蛋白-芳香烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白-類泛素蛋白相互作用基序結(jié)構(gòu)域中異二聚體復(fù)合物Clock/Bmal1的亞單位，復(fù)合物Clock/Bmal1通過與調(diào)控基因中的E-box元件結(jié)合來激活Per和Cry基因以及其他下游基因的轉(zhuǎn)錄[9]。Per和Cry蛋白在細胞質(zhì)中異二聚化，并轉(zhuǎn)移到細胞核中與Clock/Bmal1相互作用，從而抑制其進一步轉(zhuǎn)錄激活。當(dāng)Per和Cry蛋白通過泛素依賴性途徑降解時，它們對Clock/Bmal1的抑制被解除，循環(huán)以24 h周期再次開始[10]。第二個轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋環(huán)是通過視黃酸相關(guān)孤兒受體(α、β、γ)的轉(zhuǎn)錄激活和Rev-erbα/Rev-erbβ的抑制產(chǎn)生。轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋環(huán)驅(qū)動Bmal1轉(zhuǎn)錄的節(jié)律性變化，并導(dǎo)致Cry1基因表達延遲，從而使其與由Clock/Bmal1嚴(yán)格調(diào)控的基因相抵消[11]。協(xié)同、連鎖反饋回路的存在有助于保持準(zhǔn)確的晝夜節(jié)律時間，也有助于在晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄輸出中產(chǎn)生相位延遲。

1.2Rev-erbα Rev-erb亞家族包含兩個成員：Rev-erbα(也稱NR1D1)和Rev-erbβ(也稱NR1D2)[12]。Rev-erbα于1989年被發(fā)現(xiàn)，并定位到編碼另一個核受體甲狀腺激素受體α基因的反向鏈上，其結(jié)構(gòu)與甲狀腺激素受體和視黃酸受體最相似，但不結(jié)合甲狀腺激素或視黃酸。與配體調(diào)節(jié)的核受體相反，Rev-erbα缺少配體結(jié)合域C端激活螺旋-H12，因而是一種孤兒核受體[13]。Rev-erbα顯示出一個疏水區(qū)域，在該區(qū)域招募了如核受體共抑制因子的共阻遏物。Rev-erbα通過與核受體共抑制因子結(jié)合而發(fā)揮顯性轉(zhuǎn)錄沉默子的作用。因此，Rev-erbα常充當(dāng)轉(zhuǎn)錄的組成型阻遏物。

在哺乳動物中，Bmal1和Clock激活Cry和Per基因的轉(zhuǎn)錄。Per和Cry蛋白一旦達到臨界濃度就會通過翻譯后調(diào)節(jié)抑制自身的合成[14]。而Rev-erbα的轉(zhuǎn)錄被Bmal1-Clock異二聚體激活，同時也被Cry和Per蛋白抑制，導(dǎo)致Rev-erbα基因表達的晝夜節(jié)律振蕩。反過來，Rev-erbα抑制Bmal1和Clock基因的表達，反饋回路的正負(fù)分支也因此銜接起來。Rev-erbα反饋調(diào)節(jié)核心時鐘成分Bmal1的轉(zhuǎn)錄，以穩(wěn)定晝夜節(jié)律振蕩。此外，Rev-erbα在其他分子鐘調(diào)節(jié)器的節(jié)律方面也具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，包括Clock、Cry1、白細胞介素-3調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和神經(jīng)PAS域蛋白2等[15]。因此，Rev-erbα作為分子鐘的整合者，具有通過與多個基因的調(diào)控相互作用改變整體細胞振蕩的潛力。

2 Rev-erbα在MIRI中的作用

許多疾病的癥狀和發(fā)病模式在24 h內(nèi)并非隨機分布，往往伴有一定的晝夜節(jié)律性。Muller等[16]將血漿肌酸激酶水平首次升高的時間作為客觀確定心肌梗死的發(fā)作時間，觀察發(fā)現(xiàn)與23:00相比，9：00點心肌梗死的發(fā)作頻率增加了3倍，證實了心肌梗死發(fā)作晝夜節(jié)律的存在。據(jù)報道，在動物實驗[17]和臨床試驗[18]中，晝夜節(jié)律可調(diào)節(jié)心肌細胞對缺血再灌注損傷的耐受性。在睡眠-覺醒轉(zhuǎn)換時通過抑制 Rev-erbα活性可以賦予心肌缺氧-復(fù)氧耐受性，改善MIRI[18]。近年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應(yīng)[4]、自噬[19]、氧化應(yīng)激[20]以及代謝[3]等機制方面通過調(diào)控時鐘基因Rev-erbα可起到一定的心肌保護作用。藥物和缺血預(yù)處理是目前治療MIRI的主要方法。雖已證實了各種缺血預(yù)處理手段的安全性，但由于臨床效果不同，還需進一步臨床試驗[21]。目前臨床上使用的藥物大多是針對MIRI的發(fā)生機制，減輕炎癥反應(yīng)，減少氧自由基、自噬及改善內(nèi)皮功能等[22]。因此，探索時鐘基因Rev-erbα與MIRI之間的潛在聯(lián)系可為缺血性心臟疾病的治療提供新方向。

2.1Rev-erbα與炎癥反應(yīng) 心肌細胞缺血壞死觸發(fā)強烈的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，其功能是清除受損心肌中死亡的細胞，并為激活修復(fù)過程奠定基礎(chǔ)。及時抑制炎癥反應(yīng)并在空間上遏制炎癥反應(yīng)對防止損傷的擴大尤為必要，過度活躍甚至失調(diào)的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致心肌細胞死亡[23]。

缺血再灌注的缺血期與基因表達的轉(zhuǎn)錄控制顯著改變有關(guān)。由于需要氧作為輔助因子，缺血可引起氧敏感脯氨酰羥化酶的抑制。脯氨酰羥化酶的抑制導(dǎo)致核因子κB的活化，有助于限制細胞凋亡[24]。核因子κB的經(jīng)典途徑能夠調(diào)節(jié)炎癥，協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)和組織穩(wěn)態(tài)。其中IκB激酶β途徑與脯氨酰羥化酶-缺氧誘導(dǎo)因子途徑的成員相互作用，將炎癥與缺氧聯(lián)系起來[25]。對炎性腸病小鼠模型的研究表明，腸炎癥中脯氨酰羥化酶可調(diào)節(jié)核因子κB介導(dǎo)的抗凋亡作用[26]。此外，腸缺血再灌注時腸上皮細胞中的核因子κB被激活，進而增加腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生，但同時減弱腸上皮細胞凋亡。一項關(guān)于血管平滑肌細胞的研究表明，Rev-erbα可增強腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的核因子κB的激活，進而上調(diào)炎癥標(biāo)志物(如白細胞介素-6、環(huán)加氧酶-2)的表達[27]，可見Rev-erbα與核因子κB通路之間存在調(diào)節(jié)關(guān)系。因此，通過介導(dǎo)時鐘基因Rev-erbα及其相關(guān)免疫反應(yīng)，抑制細胞凋亡有望成為MIRI的治療策略。

2.2Rev-erbα與細胞自噬 自噬普遍存在于缺血、功能衰竭和衰老的心肌中，可以回收受損的細胞器，提供細胞營養(yǎng)，維持基礎(chǔ)體內(nèi)平衡[28]。自噬是指機體通過特定機制調(diào)節(jié)細胞內(nèi)成分的有序降解和再生循環(huán)，并以雙層膜結(jié)構(gòu)包裹部分胞質(zhì)和細胞器的自噬小體為特異性指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，自噬激活現(xiàn)象存在于心肌梗死后存活的心肌細胞中，透射顯微鏡下可觀察到自噬小體[29]。而應(yīng)用哺乳動物雷帕霉素增強自噬水平后，心肌重塑減輕，心臟功能恢復(fù)。

自噬在MIRI中處于關(guān)鍵地位[30]。心肌缺血期時，自噬水平的增強使細胞內(nèi)受損細胞器得到清理，這可能是機體在心肌缺血過程中的一種自我保護；而再灌注期時，自噬水平過度激活，誘發(fā)細胞程序性死亡，從而加重心肌損傷。因此，自噬在MIRI的不同時期發(fā)揮不同的作用。而Pastore和Ballabio[31]發(fā)現(xiàn)伴隨Rev-erbα的敲除，自噬基因和自噬流量的表達增強。據(jù)報道，經(jīng)過Rev-erbα激動劑SR9009處理后，自噬相關(guān)基因表達減少，證實Rev-erbα的激活可以通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)通路來保護腸道屏障功能[32]。同樣，Shen等[19]也發(fā)現(xiàn)SR9009治療小細胞肺癌的作用是通過Rev-erbα依賴的自噬抑制介導(dǎo)。以上研究表明，時鐘基因Rev-erbα參與調(diào)控細胞自噬，提示可通過調(diào)控Rev-erbα的表達水平，減少細胞過度自噬，改善MIRI。

Song等[34]發(fā)現(xiàn)將大鼠及其后代暴露于環(huán)境空氣顆粒會導(dǎo)致Rev-erbα表達水平降低，同時肺組織和全身氧化應(yīng)激水平顯著升高。此外，Sengupta等[20]研究表明，Rev-erbα通過增強線粒體功能維持細胞代謝來控制細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而提高機體對氧化應(yīng)激的耐受性。同時Rev-erbα的穩(wěn)定化可以增加線粒體活性氧類，而線粒體活性氧類對細胞具有保護作用，與缺血再灌注損傷密切相關(guān)[35]。綜上，Rev-erbα在抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，推測可以時鐘基因Rev-erbα作為靶點來對抗氧化應(yīng)激，改善MIRI。

2.4Rev-erbα與代謝異常 能量代謝障礙被認(rèn)為是缺血再灌注損傷發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，而線粒體被視為細胞的動力源，以ATP的形式產(chǎn)生能量。因此，線粒體數(shù)量和功能的改變與能量代謝有直接聯(lián)系。Rev-erbα以代謝物血紅素為內(nèi)源性配體，可參與線粒體呼吸和細胞氧化還原平衡，且在聯(lián)系新陳代謝與晝夜節(jié)律中扮演重要角色[36]。因此，Rev-erbα可作為細胞代謝狀態(tài)的傳感器，將生物時鐘與代謝平衡密切聯(lián)系起來。當(dāng)心肌細胞缺氧時，心肌能量代謝發(fā)生改變，糖酵解產(chǎn)生的ATP逐漸成為維持心肌細胞存活的唯一能量來源，但糖酵解產(chǎn)生的ATP遠不能滿足心肌細胞的需求，同時過度的脂肪酸β氧化使得耗氧增加，最終加重心肌細胞損傷。

據(jù)報道，Rev-erbα的穩(wěn)定化可以增強成纖維細胞的線粒體呼吸[20]。相反，過表達的Rev-erbα能以血紅素依賴性的方式限制肝癌細胞中線粒體的呼吸作用。Woldt等[37]發(fā)現(xiàn)，體外Rev-erbα的過表達增加了線粒體的數(shù)量，而體內(nèi)肌肉中Rev-erbα的過表達或藥理激活增加了運動能力。以上研究表明，Rev-erbα在調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量和功能中起重要作用。因此，Rev-erbα可能通過調(diào)節(jié)能量代謝影響MIRI的重要過程，但具體機制仍未闡明。

2.5Rev-erbα與其他 纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是纖維蛋白溶解的主要抑制劑，可在脂肪組織中表達，并呈現(xiàn)晝夜表達模式。研究表明，Rev-erbα通過PAI-1啟動子中的兩個Rev-erbα結(jié)合位點抑制人PAI-1基因表達[38]。PAI-1轉(zhuǎn)基因小鼠會出現(xiàn)自發(fā)性的年齡依賴性冠狀動脈血栓形成[39]。有證據(jù)表明，PAI-1水平的升高可能促進動脈粥樣硬化血栓形成的發(fā)展[40]。因此，通過調(diào)控Rev-erbα可以改善心血管凝血功能。

心肌缺血再灌注時，大量的活性氧類由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，且抗氧化活性也大大降低，當(dāng)大量的活性氧類超過內(nèi)皮細胞的防御系統(tǒng)能力可導(dǎo)致心肌細胞損傷。一氧化氮是一種由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的強大擴血管物質(zhì)，且具有抑制血小板和白細胞黏附、限制平滑肌細胞增殖的作用，因此在MIRI中具有重要保護作用。血管內(nèi)皮一氧化氮依賴性血管舒張功能下降可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞更易受氧自由基的損害，從而加重MIRI易損性。有研究表明，Rev-erbα是一氧化氮的直接靶點，且其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制可被一氧化氮逆轉(zhuǎn)[41]。嚙齒類動物的肺動脈高壓模型證明，一氧化碳誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生一氧化氮，并最終促進正常動脈和血管大小的恢復(fù)[42]。另一項研究表明，一氧化碳可增加缺血再灌注損傷時大鼠心臟組織中蛋白激酶B的表達[43]。蛋白激酶B是一種對細胞存活和代謝至關(guān)重要的絲氨酸-蘇氨酸激酶，而蛋白激酶B的磷酸化與Rev-erbα表達呈負(fù)相關(guān)[6]，因此推測Rev-erbα與雙原子氣體一氧化碳和一氧化氮之間形成了調(diào)控環(huán)路，通過改善血管的舒張功能影響MIRI。綜上，當(dāng)時鐘基因Rev-erbα受到干擾時可能會引發(fā)內(nèi)皮功能障礙和血栓形成的狀態(tài)，最終加重MIRI。

3 小 結(jié)

晝夜節(jié)律的紊亂與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中時鐘基因Rev-erbα是晝夜節(jié)律的一個重要組成部分。Rev-erbα在多個組織中表現(xiàn)出強烈的晝夜節(jié)律振蕩，且在代謝、免疫、炎癥等方面有重要影響，因此成為近年的研究熱點。目前MIRI的病理機制仍未完全闡明，且缺乏有效的防治措施，而通過調(diào)節(jié)時鐘基因Rev-erbα在氧化應(yīng)激、細胞自噬、炎癥反應(yīng)等方面的作用，可以限制MIRI的易損性增加，進而起到一定的心臟保護作用。事實上，在某些情況下調(diào)節(jié)Rev-erbα也可以導(dǎo)致其他疾病病情的改善，如阿爾茨海默病、高同型半胱氨酸血癥和高膽固醇血癥等[44-46]。因此，未來時鐘基因有望作為一個新的干預(yù)靶點，成為一種安全性高和成本低廉的治療選擇。