談生物試題中的PCR衍生技術(shù)高考考查要點

郭勝超

摘? ? 要：PCR技術(shù)已被廣泛應用于生物的很多領(lǐng)域，也是命制生物高考試題的重要素材來源。本文從高中生物試題的角度，分析介紹PCR衍生技術(shù)的原理、步驟和應用，旨在引導廣大教師和學生關(guān)心和關(guān)注日新月異的生物科技發(fā)展，提高學生的生物學核心素養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：PCR;引物;擴增;考查載體

PCR是多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction）的縮寫，該技術(shù)是由穆里斯（K.Mullis）等人于1988年發(fā)明的。現(xiàn)已被廣泛應用于法醫(yī)鑒定、環(huán)境監(jiān)測、分子克隆、基因序列分析、考古學等重要領(lǐng)域。PCR技術(shù)促進了分子生物學、遺傳學、生物化學等學科的發(fā)展，也是高考評價體系中考查載體的重要來源。目前PCR的衍生技術(shù)種類繁多（見表1），本文針對常見的PCR技術(shù)在命制高中生物試題中的應用進行了整理和分析。

例1? 新冠疫情的快速控制，離不開政府的科學決策和我國對新冠病毒（RNA病毒）的快速檢測能力。熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測樣本中DNA含量，其原理是：在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針，當TaqDNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接受到熒光信號，即每擴增一次，就有一個熒光分子生成（如圖1）。隨著PCR的進行，熒光信號的強度也等比例增加，可通過熒光強度的變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖（如圖2）。Ct值（循環(huán)閾值）的含義為：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。下列說法不正確的是（C）

A.檢測新冠病毒時，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶將新冠病毒RNA轉(zhuǎn)化為cDNA

B.PCR的每個循環(huán)包括變性、復性和延伸3個階段

C.Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險性越高

D.圖2出現(xiàn)平臺期的最可能原因是反應體系中的引物、探針數(shù)量一定

1.逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（RT-PCR）

新冠病毒屬于RNA病毒，在例1的檢測中涉及到逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)。其步驟如圖3所示：（1）逆轉(zhuǎn)錄過程需要加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物P1和原料，將新冠病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。（2）再以cDNA為模板，利用引物P2合成目的基因片段。（3）利用引物P1和P2對目的片段進行PCR擴增。進行上述操作，選用的模板RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。

考查載體：逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)可用于獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)等，還可以用來分析不同組織細胞，或是相同組織細胞在不同發(fā)育階段中mRNA表達情況。

2.熒光定量PCR（RTFQ-PCR）

例1中的熒光定量PCR技術(shù)是一種在DNA擴增反應中，利用熒光探針（熒光染料或熒光標記的特異性的DNA單鏈，它的兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，如圖2所示）對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，結(jié)合相應的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，推測待測樣品濃度的方法。每擴增一次，就有一個熒光分子生成。根據(jù)題干信息可知，待檢測樣本中的病毒越多，每次消耗的熒光探針就越多，發(fā)出的熒光越強，達到設定熒光閾值所需的循環(huán)數(shù)就越小，即Ct值越小。在PCR過程中為了保證檢測結(jié)果的準確性，一般要達到或超過閾值時才能確診。當PCR擴增到一定輪次，加入的探針或引物消耗殆盡，熒光強度將達到最大值，即出現(xiàn)圖2中“平臺期”。

考查載體：熒光定量PCR可用于人和動物疾病的診斷、食品中微生物的達標檢測、分子生物學中的定量研究等領(lǐng)域。

例2（2020年江蘇高考題節(jié)選）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如下圖（以EcoR I酶切為例），請據(jù)圖回答問題：

（3）若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是②④（從引物①②③④中選擇，填編號）。

3.反向PCR技術(shù)（Inverse PCR）

例2主要考查了反向PCR技術(shù)的應用。常規(guī)的PCR技術(shù)是直接擴增兩引物之間的已知DNA片段，而該技術(shù)是利用擴增引物向相反方向擴增未知DNA序列（如圖4），從而實現(xiàn)對未知序列進行分析和研究的目的。因此上述試題中要選擇②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'和④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'作為引物。

在進行反向PCR技術(shù)時，先選擇已知序列內(nèi)部沒有切點的限制性內(nèi)切核酸酶對該段DNA進行酶切，然后用DNA連接酶使帶有黏性末端的靶序列環(huán)化連接，再根據(jù)已知序列設計一對反向的引物進行PCR，最后擴增出已知序列上游和下游的未知序列。

考查載體：反向PCR技術(shù)還可用于已知序列的上、下游未知序列的測定，還可用來制備未知序列的探針。

例3大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR反應即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴增的大引物，過程如圖5所示。下列敘述正確的是（不定項選擇）（BD ）

A.第一輪PCR過程中復性所用的溫度與第二輪PCR復性的溫度是一樣的。

B.PCR擴增的定點誘變產(chǎn)物通常需要連接到載體分子上才能表達出相應的性狀，該定點誘變產(chǎn)物需具備啟動子、終止子等結(jié)構(gòu)才能進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。

C.第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產(chǎn)物DNA的兩條鏈。

D.將某功能蛋白的第17位Cys（UGU）改造成Ser（UCU），屬于蛋白質(zhì)工程。

4.編碼基因的特異性定點突變

編碼基因的特異性定點突變是指通過PCR等方法，插入、去除或替換個別核苷酸，最終獲得突變的基因。定點突變技術(shù)的類型很多，例3中是借助大引物進行PCR定點突變，大致步驟是（如圖6）：（1）先合成一段含突變核苷酸的DNA引物P1，并將其雜交到目的基因的DNA單鏈上，引物上的個別突變核苷酸不會影響其與DNA單鏈結(jié)合。（2）利用突變引物P1與側(cè)翼引物P2，通過第一階段的PCR擴增出如圖所示的DNA分子。（3）利用第一階段的PCR產(chǎn)物的單鏈作為引物，配合側(cè)翼引物P3，通過第二階段的PCR擴增出突變基因。精確設計引物是成功的關(guān)鍵，該方法操作簡單，突變的成功率較高。

考查載體：編碼基因的特異性定點突變常用于蛋白質(zhì)工程，通過基因定點突變改變編碼基因的堿基序列，最終實現(xiàn)對蛋白質(zhì)分子中某活性部位的1個或幾個氨基酸殘基序列的改變。

5.融合PCR技術(shù)

PCR技術(shù)除了可以實現(xiàn)編碼基因的特異性定點突變，還可以通過PCR的方法實現(xiàn)兩個基因的融合，即融合PCR技術(shù)。以圖7為例，要實現(xiàn)基因A和B的融合，需要先設計的P2引物含有基因B片段的一部分，P3引物含有基因A片段的一部分。通過PCR擴增就能分別得到含有B基因片段序列的A基因和含有A基因片段序列的B基因。然后分別取基因A、B的PCR產(chǎn)物單鏈搭連，互為引物，進行PCR擴增，得到融合基因A-B。最后加入引物P1和P4進行PCR，得到多個融合基因A-B的拷貝。

考查載體：隨著技術(shù)的發(fā)展，融合PCR技術(shù)逐步應用于基因敲除、基因標記、基因內(nèi)部點突變、兩種基因融合等領(lǐng)域。

PCR的衍生技術(shù)還有很多，這里不再贅述。隨著新課程改革的深入推進，高考試題的命制越來越體現(xiàn)時代性和創(chuàng)新性，緊密結(jié)合科學技術(shù)前沿理論和工程技術(shù)領(lǐng)域，綜合考查學生的學科核心素養(yǎng)。建議教師多收集與教材知識聯(lián)系密切的生物科技素材，簡化整理后介紹給學生，培養(yǎng)學生快速獲取相關(guān)的生物學信息和知識遷移的能力。

■ 編輯/魏繼軍