依達(dá)拉奉對(duì)視網(wǎng)膜脫離模型大鼠早期感光細(xì)胞自噬的調(diào)控作用

康紫薇 任秀瑜 張妍春 裴澄 張娜娜 夏益敏 楊菁茹

1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 710049；2西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院) 陜西省眼科醫(yī)院 西安市眼底病研究所 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣仁醫(yī)院眼科 710004；3西安交通大學(xué)癌癥研究所 710061；4西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)病理科 710004

視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層與色素上皮層之間的黏附力較弱，易發(fā)生視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment，RD)及視網(wǎng)膜下液潴留，是許多眼底疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性等發(fā)生和發(fā)展過程中常伴發(fā)的病理現(xiàn)象[1]。盡管目前通過手術(shù)治療可使90%以上的原發(fā)性RD解剖復(fù)位，但是術(shù)后大多數(shù)患者視功能丟失嚴(yán)重[2]。研究表明，感光細(xì)胞死亡是RD后視功能發(fā)生永久性損傷的主要原因，RD降低視網(wǎng)膜外層氧及營養(yǎng)供應(yīng)，使感光細(xì)胞層處于低氧狀態(tài)，產(chǎn)生大量氧自由基，進(jìn)而導(dǎo)致感光細(xì)胞凋亡[3-4]。然而，神經(jīng)上皮層與色素上皮層分離后并不立刻發(fā)生感光細(xì)胞的死亡，這就是臨床所謂的能保存RD患者有用視力的“窗口期”，這段時(shí)間機(jī)體內(nèi)促存活的分子通道被激活，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究證實(shí)RD能激活感光細(xì)胞自噬，減少感光細(xì)胞凋亡的發(fā)生[5-6]。然而，也有研究表明活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)也可以誘導(dǎo)自噬小體的形成，自噬可通過減少蛋白質(zhì)聚集物和清除受損細(xì)胞器來減輕氧化損傷[7-8]。RD后感光細(xì)胞發(fā)生自噬與ROS水平的相關(guān)性目前尚不清楚。依達(dá)拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)是一種有效的氧自由基清除劑，具有抗氧化和抗凋亡的作用[9-11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)依達(dá)拉奉能夠有效減少實(shí)驗(yàn)性RD感光細(xì)胞凋亡，阻止視網(wǎng)膜外核層厚度比例的下降，顯著降低活化caspase-3、caspase-8、caspase-9以及羰基蛋白水平[12]。然而，依達(dá)拉奉對(duì)RD模型中感光細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用目前尚不清楚。本研究擬使用依達(dá)拉奉減少早期RD模型大鼠眼內(nèi)氧自由基水平，觀察感光細(xì)胞自噬水平變化，探討依達(dá)拉奉是否通過調(diào)節(jié)自噬來抑制感光細(xì)胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量263～274 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度為25～27 ℃，相對(duì)濕度為55%～70%，12 h光照晝夜循環(huán)，通風(fēng)狀況良好。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每籠6只，給予自由飲水、攝食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及喂養(yǎng)遵循國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，動(dòng)物倫理經(jīng)西安市第四醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào)：2016016)。

1.1.2主要試劑及儀器 總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)測試盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、5倍蛋白上樣緩沖液、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Millipore公司)；兔抗自噬相關(guān)基因4B(autophagy related gene 4B，Atg4B)抗體(A2981，美國Sigma公司)；兔抗微管相關(guān)蛋白質(zhì)1輕鏈3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B)抗體(#2775S，美國CST公司)；兔抗超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)抗體(ab16831)、兔抗核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)抗體(ab31163)(英國Abcam公司)；鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(NC010)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(EK020)、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(EK010)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒及ECL發(fā)光檢測試劑盒(西安壯志生物科技有限公司)；caspase-3抗體(74T2)、預(yù)染蛋白Marker、BCA定量試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠(17 mg/ml)(美國博士倫公司)；鹽酸氯丙嗪(吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司)；復(fù)方托吡卡胺滴眼液(日本參天制藥株式會(huì)社)；眼用平衡鹽溶液(H20171363，美國Alcon公司)。瓊脂凝膠電泳裝置(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf公司)；化學(xué)發(fā)光儀(上海天能科技有限公司)；30G針頭(美國BD公司)；解剖顯微鏡(EZ4HD)、石蠟切片機(jī)(RM2016)(德國Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(BX51，日本Olympus公司)；33G微量動(dòng)物注射器(瑞士Hamilton公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠RD模型的建立及分組處理 取51只大鼠進(jìn)行RD模型建立，另取24只大鼠作為PBS注射組。均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼。采用鹽酸氯丙嗪(0.03 ml/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，PBS注射組大鼠玻璃體腔內(nèi)注射眼用平衡鹽溶液15 μl。RD造模大鼠復(fù)方托吡卡胺滴眼液擴(kuò)瞳后，取30G針頭于顳上角鞏緣后4 mm進(jìn)入玻璃體腔，在鼻側(cè)視網(wǎng)膜避開血管造孔，用微量進(jìn)樣針向視網(wǎng)膜下推注質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%透明質(zhì)酸鈉15 μl，盡量擴(kuò)大RD面積，行前房穿刺放出少量房水至角膜透明。剔除晶狀體意外損傷、眼內(nèi)大量出血的大鼠。采用隨機(jī)數(shù)字法將造模成功大鼠隨機(jī)分為RD模型組和依達(dá)拉奉治療組。造模后每日擴(kuò)瞳后使用瞳孔筆及直接檢眼鏡觀察角膜、晶狀體及眼底情況。造模后依達(dá)拉奉治療組大鼠腹腔內(nèi)注射依達(dá)拉奉3 mg/kg，2次/d，PBS注射組及RD模型組大鼠腹腔內(nèi)注射等容量0.9%氯化鈉溶液。各組于造模后1、3、7 d任意選取8只大鼠過量麻醉法處死并取材。

1.2.2眼內(nèi)液中T-SOD活性、MDA含量測定 各組不同時(shí)間點(diǎn)取8只大鼠，30G針頭行右眼前房穿刺并抽取眼內(nèi)液。將各組中每2只大鼠的眼內(nèi)液混勻在一起，成為1個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，共4個(gè)樣本。取10 μl眼內(nèi)液，按T-SOD試劑盒說明書操作，采用BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀測量各組波長550 nm處吸光度(A)值，計(jì)算各組眼內(nèi)液中T-SOD活力值。另取10 μl眼內(nèi)液，按照MDA試劑盒說明書操作，測量各組波長532 nm處A值，計(jì)算各組眼內(nèi)液中MDA含量。

1.2.3Western blot法檢測視網(wǎng)膜組織中各抗氧化、凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 各組不同時(shí)間點(diǎn)分別處死4只大鼠，于手術(shù)顯微鏡下分離取出右眼視網(wǎng)膜，顯微剪剪碎組織，加入含有PMSF的預(yù)冷RIPA裂解液450 μl，4 ℃條件下1 200×g離心10 min，取上清；采用BCA定量試劑盒測定上清液中蛋白質(zhì)量濃度；將蛋白樣品質(zhì)量濃度調(diào)整為2 μg/μl，與蛋白上樣緩沖液混合后，100 ℃水浴5 min使蛋白變性；每孔上樣量為10 μl，采用SDS-PAGE對(duì)蛋白樣品進(jìn)行電泳分離；采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖鹽+吐溫(Tris-HCl+Tween，TBST)溶液洗膜3次，每次5 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，TBST溶液洗膜3次，分別加入相應(yīng)Atg4(1∶ 1 000)、LC3B(1∶ 1 000)、SOD2(1∶ 5 000)、Nrf2(1∶ 500)、caspase-3(1∶ 500)、β-actin(1∶ 5 000)抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的IgG抗體(1∶ 2 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；使用ECL和化學(xué)發(fā)光儀顯色并拍照，ImageJ軟件分析蛋白灰度值，以β-actin為內(nèi)參蛋白，計(jì)算各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4TUNEL法標(biāo)記視網(wǎng)膜切片凋亡細(xì)胞 各組不同時(shí)間點(diǎn)分別處死4只大鼠，取右眼全眼球進(jìn)行石蠟包埋，沿眼球矢狀位方向行4 μm厚石蠟切片；將石蠟切片常規(guī)脫蠟處理后滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K，37 ℃作用30 min，PBS洗滌3次，每次3 min；滴加體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液室溫下避光孵育20 min，PBS洗滌3次，每次3 min；滴加生物素標(biāo)記液37 ℃避光孵育1.5 h，PBS洗滌1次，每次3 min；滴加反應(yīng)終止標(biāo)記液，室溫下孵育10 min，PBS洗滌3次，每次3 min；滴加Streptavidin-HRP工作液37 ℃濕盒中孵育40 min，PBS洗滌3次，每次3 min；DAB顯色液孵育35 min，蘇木素染色30 s，脫水，透明，樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞并拍照；采用Image-pro plus圖像分析軟件對(duì)外核層陽性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算其占總感光細(xì)胞數(shù)的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示，采用Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊。各組不同時(shí)間點(diǎn)T-SOD活力值、MDA含量以及各蛋白相對(duì)表達(dá)量總體差異比較采用兩因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗(yàn)。RD模型組與依達(dá)拉奉治療組不同時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞比率總體差異比較采用兩因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RD造模情況

造模過程中2眼在視網(wǎng)膜造孔時(shí)大量出血，1眼晶狀體損傷，剔除這3只大鼠，其余48只制備RD模型眼于手術(shù)顯微鏡下觀察鼻側(cè)視網(wǎng)膜均高度隆起至晶狀體后，RD范圍>60%(圖1)，鼻下方近赤道部視網(wǎng)膜裂孔大小為1/2～1視盤直徑，其中1眼視網(wǎng)膜表面少量出血，但不影響眼底觀察。所有實(shí)驗(yàn)眼在實(shí)驗(yàn)觀察期間，結(jié)膜囊內(nèi)未見異常分泌物，球結(jié)膜稍充血，角膜均透明，前房清亮，玻璃體無明顯混濁。實(shí)驗(yàn)期間各模型鼠鼻側(cè)視網(wǎng)膜灰白色隆起持續(xù)存在。

圖1 PBS注射組與RD模型組大鼠眼底及組織病理圖 A：手術(shù)顯微鏡下觀察顯示，PBS注射組大鼠視網(wǎng)膜平伏，血管走行正常 B：眼球石蠟切片病理學(xué)觀察顯示，PBS注射組大鼠神經(jīng)上皮層與色素上皮層貼附良好(HE ×40，標(biāo)尺=200 μm) C：手術(shù)顯微鏡下觀察顯示，RD模型組大鼠鼻側(cè)視網(wǎng)膜灰白色高度隆起伴裂孔旁少量出血 D：眼球石蠟切片病理學(xué)觀察顯示，RD模型組大鼠視網(wǎng)膜脫離，視網(wǎng)膜高度隆起至晶狀體后表面(HE ×40，標(biāo)尺=200 μm) 紅三角所指為神經(jīng)上皮層，紅箭所指為色素上皮層；*為視網(wǎng)膜隆起最高處，黑箭所指為視網(wǎng)膜脫離邊緣，黑三角所指為造孔處Figure 1 Fundus and histopathology findings of rats in the PBS injection group and RD model group A:Normal retina was observed and vessel ran normally in rat of the PBS injection group under the operation microscope B:The neurepithelium layer (red triangle) and the pigment epithelium layer (red arrow) of the paraffin section attached well in the PBS injection group (HE ×40，bar=200 μm) C:Nasal retina elevated highly with little hemorrhage besides the artificial hole was observed in rats of the RD model group under the operation microscope D:The retinal neurepithelium layer (red triangle) detached from the retinal pigment epithelial layer (red arrow) and part of RNL reaching the posterior surface of the lens were observed in the paraffin section of the RD model group (HE ×40，bar=200 μm) * showed the highest site of elevated retina；black arrow showed the edge of retinal detachment；black triangle indicated the artificial hole

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)眼內(nèi)液中T-SOD活力及MDA含量比較

各組不同時(shí)間點(diǎn)眼內(nèi)液中MDA含量及T-SOD活力總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MDA：F分組=385.513，P<0.01；F時(shí)間=13.021，P<0.01.T-SOD：F分組=48.865，P<0.01；F時(shí)間=7.700，P=0.003)。造模后各時(shí)間點(diǎn)RD模型組眼內(nèi)液中MDA含量較PBS注射組明顯升高，T-SOD活力值較PBS注射組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；造模后各時(shí)間點(diǎn)依達(dá)拉奉治療組眼內(nèi)液中MDA含量較RD模型組均明顯下降，較PBS注射組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；造模后各時(shí)間點(diǎn)依達(dá)拉奉治療組T-SOD活力值均較RD模型組明顯升高，較PBS注射組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；各組隨造模后時(shí)間延長，眼內(nèi)液中T-SOD活力值和MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(表1)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)眼內(nèi)液中T-SOD活力值和MDA含量比較(mean±SD)Table 1 Comparison of T-SOD activity and MDA content in intraocular fluid at various time points among the three groups (mean±SD)組別樣本量造模后不同時(shí)間點(diǎn)T-SOD活力值[mmol/(min·L)]造模后不同時(shí)間點(diǎn)MDA含量(mmol/ml)1d3d7d1d3d7dPBS注射組4309.81±0.55323.03±2.94294.60±4.865.31±1.086.00±0.425.47±0.99RD模型組4101.59±3.83a215.65±6.37a205.03±5.15a16.34±1.86a19.82±1.80a17.88±0.74a依達(dá)拉奉治療組4261.54±8.48ab294.67±7.23ab227.87±7.03ab7.12±1.47ab9.32±1.12ab8.69±0.56ab 注:T-SOD:F分組=48.865,P<0.01;F時(shí)間=7.700,P=0.003.MDA:F分組=385.513,P<0.01;F時(shí)間=13.021,P<0.01.與各自時(shí)間點(diǎn)PBS注射組比較,aP<0.05;與各自時(shí)間點(diǎn)RD模型組相比,bP<0.05(兩因素方差分析,Tukey檢驗(yàn)) T-SOD:總超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛;PBS:磷酸鹽緩沖鹽溶液;RD:視網(wǎng)膜脫離 Note:T-SOD:Fgroup=48.865,P<0.01;Ftime=7.700,P=0.003.MDA:Fgroup=385.513,P<0.01;Ftime=13.021,P<0.01.Compared with the PBS injection group at corresponding time points,aP<0.05;compared with the RD model group at corresponding time points,bP<0.05 (Two-way ANOVA,Tukey test) T-SOD:total superoxide dismutase;MDA:malondialdehyde;PBS:phosphate buffer saline;RD:retinal detachment

2.3 各組視網(wǎng)膜組織中抗氧化蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

各組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織中SOD2、Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SOD2：F分組=33.717，P<0.01；F時(shí)間=11.745，P<0.01.Nrf2：F分組=37.329，P<0.01；F時(shí)間=27.002，P<0.01)。造模后各時(shí)間點(diǎn)RD模型組SOD2、Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于PBS注射組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；造模后1、3、7 d依達(dá)拉奉治療組SOD2相對(duì)表達(dá)量較RD模型組明顯升高，造模后1、3 d依達(dá)拉奉治療組Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量較RD模型組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖2，表2)。

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織中SOD2和Nrf2蛋白表達(dá)電泳圖 1：PBS注射組；2：RD模型組；3：依達(dá)拉奉治療組 SOD：超氧化物歧化酶；β-actin：β肌動(dòng)蛋白；Nrf：核因子E2相關(guān)因子Figure 2 Electropherograms of SOD2 and Nrf2 protein in retinal tissue at different time points in each group 1:PBS injection group；2:RD model group；3:edaravone treatment group SOD:superoxide dismutase；Nrf:nuclear factor E2-related factor

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織中SOD2及Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of SOD2 and Nrf2 protein relative expression levels in retina at various time points among the three groups (mean±SD)組別樣本量造模后不同時(shí)間點(diǎn)SOD2蛋白相對(duì)表達(dá)量造模后不同時(shí)間點(diǎn)Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量1d3d7d1d3d7dPBS注射組40.96±0.020.97±0.030.96±0.030.98±0.020.99±0.030.81±0.03RD模型組41.21±0.10a1.53±0.14a1.20±0.11a1.23±0.10a1.34±0.09a0.97±0.08a依達(dá)拉奉治療組41.49±0.10ab2.34±0.08ab1.43±0.14ab1.49±0.08ab1.88±0.06ab1.05±0.05a 注:SOD2:F分組=33.717,P<0.01;F時(shí)間=11.745,P<0.01.Nrf2:F分組=37.329,P<0.01;F時(shí)間=27.002,P<0.01.與各自時(shí)間點(diǎn)PBS注射組相比,aP<0.05;與各自時(shí)間點(diǎn)RD模型組相比,bP<0.05(兩因素方差分析,Tukey檢驗(yàn)) SOD:超氧化物歧化酶;Nrf:核因子E2相關(guān)因子;PBS:磷酸鹽緩沖液;RD:視網(wǎng)膜脫離 Note:SOD2:Fgroup=33.717,P<0.01;Ftime=11.745,P<0.01.Nrf2:Fgroup=37.329,P<0.01;Ftime=27.002,P<0.01.Compared with the PBS injection group at corresponding time points,aP<0.05;compared with the RD group at corresponding time points,bP<0.05 (Two-way ANO-VA,Tukey test) SOD:superoxide dismutase;Nrf:nuclear factor E2-related factor;PBS:phosphate buffer saline;RD:retinal detachment

2.4 各組視網(wǎng)膜組織中自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

PBS組、RD模型組和依達(dá)拉奉治療組在不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ與Atg4蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ：F分組=9.620，P=0.001；F時(shí)間=20.831，P<0.001.Atg4：F分組=9.061，P=0.001；F時(shí)間=18.505，P<0.001)。造模后1 d和3 d PBS注射組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和Atg4相對(duì)表達(dá)量均明顯低于RD模型組和依達(dá)拉奉治療組，造模后3 d RD模型組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和Atg4相對(duì)表達(dá)量均明顯低于依達(dá)拉奉治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；造模后7 d各組間LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和Atg4相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(圖3，表3)。

圖3 各組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和Atg4蛋白表達(dá)電泳圖 1：PBS注射組；2：RD模型組；3：依達(dá)拉奉治療組 LC：微管相關(guān)蛋白質(zhì)1輕鏈；β-actin：β肌動(dòng)蛋白；Atg：自噬相關(guān)基因Figure 3 Electropherograms of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ and Atg4 protein expression in retinal tissue at various time points in each group 1:PBS injection group；2:RD model group；3:edaravone treatment group LC:microtubule-associated protein 1 light chain；Atg:autophagy related gene

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ及Atg4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 3 Comparison of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ and Atg4 protein relative expression levels in retina at various time points among the three groups (mean ± SD)組別樣本量造模后不同時(shí)間點(diǎn)LC3B-Ⅱ/LC3B-I蛋白相對(duì)表達(dá)量造模后不同時(shí)間點(diǎn)Atg4蛋白相對(duì)表達(dá)量1d3d7d1d3d7dPBS注射組40.80±0.040.94±0.061.03±0.060.97±0.091.05±0.060.98±0.06RD模型組41.02±0.06a1.88±0.15a1.03±0.081.14±0.13a1.28±0.12a0.94±0.02依達(dá)拉奉治療組40.98±0.05a2.18±0.10ab1.15±0.061.10±0.16a1.59±0.10ab1.02±0.06 注:LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ:F分組=9.620,P=0.001;F時(shí)間=20.831,P<0.01.Atg4:F分組=9.061,P=0.001;F時(shí)間=18.505,P<0.01.與各自時(shí)間點(diǎn)PBS注射組相比,aP<0.05;與各自時(shí)間點(diǎn)RD模型組相比,bP<0.05(兩因素方差分析,Tukey檢驗(yàn)) LC:微管相關(guān)蛋白質(zhì)1輕鏈;Atg:自噬相關(guān)基因;PBS:磷酸鹽緩沖鹽溶液;RD:視網(wǎng)膜脫離 Note:LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ:Fgroup=9.620,P=0.001;Ftime=20.831,P<0.01.Atg4:Fgroup=9.061,P=0.001;Ftime=18.505,P<0.01. Com-pared with the PBS injection group at corresponding time points,aP<0.05;compared with the RD model group at corresponding time points,bP<0.05 (Two-way ANOVA,Tukey test) LC:microtubule-associated protein 1 light chain;Atg:autophagy related gene;PBS:phosphate buffer saline;RD:retinal detachment

2.5 各組視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況比較

各組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織中caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=31.314，P<0.01；F時(shí)間=10.460，P=0.001)。其中，造模后各時(shí)間點(diǎn)RD模型組視網(wǎng)膜組織中caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均較PBS注射組和依達(dá)拉奉治療組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖4，表4)。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)各組視網(wǎng)膜組織中caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖 1：PBS注射組；2：RD模型組；3：依達(dá)拉奉治療組 β-actin：β肌動(dòng)蛋白Figure 4 Electropherograms of caspase-3 expression in retinal tissue at various time points in each group 1:PBS injection group；2:RD model group；3:edaravone treatment group

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織中caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 4 Comparison of caspase-3 protein relative expression levels in retina tissue at various time points among the three groups (mean±SD)組別樣本量造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織中caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量1d3d7dPBS注射組41.10±0.081.06±0.080.95±0.09RD模型組41.76±0.13a2.89±0.12a1.60±0.19a依達(dá)拉奉治療組41.47±0.11ab1.64±0.05ab1.28±0.15ab 注:F分組=31.314,P<0.01;F時(shí)間=10.460,P=0.001.與各自時(shí)間點(diǎn)PBS注射組相比,aP<0.05;與各自時(shí)間點(diǎn)RD模型組相比,bP<0.05(兩因素方差分析,Tukey檢驗(yàn)) PBS:磷酸鹽緩沖鹽溶液;RD:視網(wǎng)膜脫離 Note:Fgroup=31.314,P<0.01;Ftime=10.460,P=0.001.Compared with the PBS injection group at corresponding time points,aP<0.05;compared with the RD model group at corresponding time points,bP<0.05 (Two-way ANOVA,Tukey test) PBS:phosphate buffer saline;RD:retinal detachment

石蠟切片TUNEL染色結(jié)果顯示，造模后各時(shí)間點(diǎn)RD模型組及依達(dá)拉奉治療組外核層均見TUNEL陽性標(biāo)記細(xì)胞，PBS注射組外核層未見TUNEL陽性標(biāo)記細(xì)胞。各組不同時(shí)間點(diǎn)外核層TUNEL陽性細(xì)胞率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=60.783，P<0.01；F時(shí)間=64.381，P<0.01)，其中RD模型組造模后各時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞率均明顯高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)依達(dá)拉奉治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖5，表5)。

表5 各組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜外核層TUENL陽性細(xì)胞率比較(mean±SD)Table 5 Comparison of ratio of TUENL-positive cells in the retinal outer nuclear layer at various time points among the three groups (mean±SD)組別樣本量造模后不同時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞率1d3d7dRD模型組40.26±0.030.45±0.040.35±0.04依達(dá)拉奉治療組40.13±0.03a0.34±0.04a0.26±0.04a 注:F分組=60.783,P<0.01;F時(shí)間=64.381,P<0.01.與各自時(shí)間點(diǎn)RD模型組比較,aP<0.05(兩因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) RD:視網(wǎng)膜脫離 Note:Fgroup=60.783,P<0.01;Ftime=64.381,P<0.01.Compared with the RD model group at corresponding time points,aP<0.05 (Two-way ANOVA,LSD-t test) RD:retinal detachment

圖5 各組造模后3 d眼球石蠟切片TUNEL染色圖( ×400，標(biāo)尺=20 μm) PBS注射組未見明顯陽性細(xì)胞，RD模型組感光細(xì)胞層散在較多細(xì)胞核呈棕色著染的陽性細(xì)胞，依達(dá)拉奉治療組陽性細(xì)胞散在，陽性細(xì)胞數(shù)量較RD模型組減少 箭頭所指為TUNEL染色陽性細(xì)胞 A：PBS注射組 B：RD模型組 C：依達(dá)拉奉治療組Figure 5 TUNEL staining findings in paraffin sections at 3 days after modeling(×400，bar=20 μm) No obvious TUNEL-positive cells were observed in the PBS injection group，and more TUNEL-positive cells with brown staining of nuclei were scattered in the photoreceptor cell layer in the RD model group，and the number of TUNEL-positive cells was reduced in the edaravone treatment group than that in the RD model group Arrow pointed to TUNEL-staining positive cells A:PBS injection group B:RD model group C:edaravone treatment group

3 討論

細(xì)胞自噬是Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡途徑，包括啟動(dòng)、自噬體形成、溶酶體產(chǎn)生、自噬體溶酶體融合和降解等過程。在胞內(nèi)或胞外壓力應(yīng)激條件下，多種基因和蛋白質(zhì)復(fù)合物可介導(dǎo)自噬發(fā)生，將受損、衰老的細(xì)胞器或異常的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體并降解，從而實(shí)現(xiàn)生命活動(dòng)物質(zhì)基礎(chǔ)的補(bǔ)給、正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的維持以及不利因素的清除。作為維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制，自噬在細(xì)胞生長、饑餓、低氧適應(yīng)、腫瘤抑制、衰老及先天和后天免疫中起著重要作用[13]。自噬與許多眼部疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，包括角膜營養(yǎng)不良、白內(nèi)障、青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性及RD[14-19]。Remé等[20]最早利用透射電子顯微鏡記錄了感光細(xì)胞自噬，并認(rèn)為自噬在生理狀態(tài)下對(duì)視覺周期蛋白和細(xì)胞器降解發(fā)揮重要作用；而在病理狀態(tài)下，自噬對(duì)感光細(xì)胞的作用比較復(fù)雜，包括保護(hù)性和創(chuàng)傷性2種作用。在體研究已經(jīng)證實(shí)自噬對(duì)視網(wǎng)膜光損傷具有保護(hù)作用[21]。Besirli等[5]報(bào)道了大鼠RD造模后Atg5及LC3-Ⅱ表達(dá)水平升高，感光細(xì)胞自噬增強(qiáng)，而應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤或敲除Atg5基因后RD模型鼠感光細(xì)胞丟失更嚴(yán)重，caspase-8表達(dá)明顯增加。Liu等[22]研究表明，在缺氧環(huán)境下，抑制感光細(xì)胞自噬會(huì)增加細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞活性。以上研究證實(shí)，在病理狀態(tài)下，感光細(xì)胞可以通過自噬抑制細(xì)胞凋亡。而Kunchithapautham等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的感光細(xì)胞凋亡過程中凋亡和自噬的標(biāo)記基因共同表達(dá)，抑制自噬活性可減少凋亡，提示自噬通過觸發(fā)凋亡參與感光細(xì)胞的死亡。本研究推測適度的自噬可發(fā)揮保護(hù)感光細(xì)胞、抑制凋亡發(fā)生的作用，但過度自噬可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

依達(dá)拉奉作為新型抗氧化劑已應(yīng)用于腦損傷、肺損傷、缺血性心肌疾病以及脈絡(luò)膜新生血管、RD的研究中[12,24-27]。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，依達(dá)拉奉在體內(nèi)代謝迅速，半衰期短[28]，Roh等[12]研究發(fā)現(xiàn)給予依達(dá)拉奉10 mg/kg每天1次腹腔內(nèi)注射會(huì)引起視網(wǎng)膜毒性反應(yīng)，而3 mg/kg每天1次腹腔內(nèi)注射則無明顯抑制感光細(xì)胞凋亡的作用。在脈絡(luò)膜新生血管動(dòng)物模型的研究中，給予每天2次腹腔內(nèi)注射依達(dá)拉奉3 mg/kg取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[27]。分析依達(dá)拉奉相關(guān)研究及臨床應(yīng)用，推測每天2次的注射頻次符合依達(dá)拉奉的代謝特點(diǎn)，安全性更高，故本研究采用此種給藥劑量和頻次。

ROS可攻擊生物膜中的多種不飽和脂肪酸，形成MDA等脂質(zhì)過氧化物，繼而引起細(xì)胞損傷，因此測量MDA含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞損傷程度。SOD可以清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，因而SOD活性也可間接反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力。Nrf2通過與抗氧化反應(yīng)元件相互作用，參與活性氧化劑基因的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用[29]；同時(shí)，Nrf2可以通過調(diào)控p62基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與自噬過程中蛋白質(zhì)的降解[30]。LC3B是自噬體復(fù)合體的一個(gè)重要組成部分，當(dāng)自噬被激活時(shí)，非活性形式的LC3B-Ⅰ將轉(zhuǎn)化為LC3B-Ⅱ，形成自噬體[31]。Atg4參與自噬體膜的生成和調(diào)節(jié)，將LC3剪切成LC3-Ⅰ[32]。故本研究以SOD2和Nrf2作為抗氧化蛋白，以LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和Atg4作為自噬相關(guān)蛋白對(duì)RD模型大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行檢測。

在本研究中，RD模型組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ及Atg4的表達(dá)水平于造模后3 d達(dá)高峰，并于造模后7 d表達(dá)下降，與Chinskey等[19]的研究結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步證實(shí)，與RD模型組比較，依達(dá)拉奉治療組眼內(nèi)液中T-SOD活性顯著升高、MDA含量顯著降低，同時(shí)視網(wǎng)膜組織中SOD2及Nrf2的蛋白水平升高，表明3 mg/kg依達(dá)拉奉每天2次腹腔內(nèi)注射可以提高視網(wǎng)膜的抗氧化能力，降低眼內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，在RD造模后7 d，與RD模型組相比，依達(dá)拉奉組眼內(nèi)液中T-SOD活性增加、MDA含量下降、視網(wǎng)膜組織中SOD2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，RD模型組與依達(dá)拉奉組Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示依達(dá)拉奉在造模后7 d內(nèi)能較好地改善眼內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。與RD模型組比較，依達(dá)拉奉組大鼠視網(wǎng)膜組織中caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量、外核層TUNEL陽性細(xì)胞率均顯著降低，尤其在RD后1 d、3 d時(shí)降低更明顯；同時(shí)，依達(dá)拉奉治療組視網(wǎng)膜組織中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ及Atg4蛋白水平較RD模型組升高，在造模后3 d差異顯著，但造模后7 d時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抗氧化劑依達(dá)拉奉能夠誘導(dǎo)RD造模后視網(wǎng)膜自噬，該作用可能與其抑制感光細(xì)胞凋亡相關(guān)，尤其在RD早期作用更為明顯，隨著RD時(shí)間的進(jìn)一步延長，視網(wǎng)膜組織缺氧加重，依達(dá)拉奉不足以對(duì)抗視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平降低。

綜上可知，在實(shí)驗(yàn)性RD早期，使用氧自由基清除劑依達(dá)拉奉能夠降低視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷，提高RD后自噬水平并減少感光細(xì)胞凋亡發(fā)生，提示ROS水平可能是該過程中自噬與凋亡發(fā)生轉(zhuǎn)換的相關(guān)因素之一，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究仍存在一些不足，如未能對(duì)視網(wǎng)膜ROS水平進(jìn)行直接觀察，同時(shí)也未進(jìn)一步使用自噬抑制劑或促進(jìn)劑進(jìn)行干預(yù)，未對(duì)ROS在RD過程中感光細(xì)胞自噬與凋亡發(fā)生的調(diào)控作用進(jìn)行更為深入的研究，后續(xù)將進(jìn)一步細(xì)化研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突