• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于二硫鍵橋連構(gòu)建均一性抗體藥物偶聯(lián)物

    2021-10-27 08:25:00黃容陳紅莉姜標
    自然雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:二硫鍵酰亞胺有效載荷

    黃容,陳紅莉,姜標?

    ①上??萍即髮W 免疫化學研究所,上海 201210;②上??萍即髮W 物質(zhì)科學與技術(shù)學院,上海 201210

    1 抗體藥物偶聯(lián)物

    抗體藥物偶聯(lián)物(antibody-drug conjugates,ADCs)是生物制藥領(lǐng)域中發(fā)展最為迅速的一類生物大分子藥物,由腫瘤抗原特異性單抗、有效的細胞毒性分子(有效載荷)以及結(jié)合它們的連接子三個部分組成(圖1)[1-2]。ADCs的誕生是基于一種理想的前藥設(shè)計理念,希望將藥物分子和抗體二者的優(yōu)點結(jié)合起來,利用抗體的特異專一性,有效輸送高活性藥物分子到特定靶標,到達目標細胞時再將藥物分子釋放出來,限制與非目標細胞的作用,從而降低毒性,實現(xiàn)藥效。近年來隨著抗體技術(shù)、小分子毒素及偶聯(lián)技術(shù)的進步和突破,全球掀起了研發(fā)ADCs藥物的熱潮,美國FDA已先后批準了10款ADCs藥物上市(Mylotarg、Adcetris、Kadcyla、Besponsa、Padcev、Polivy、Enhertu、Trodelvy、Blenrep和Zynlonta)(圖2),目前還有80多個ADCs藥物處于臨床研究階段[3-8]。

    圖1 ADC藥物的結(jié)構(gòu)

    2 抗體藥物偶聯(lián)物的偶聯(lián)方法

    目前上市的ADCs都是通過對抗體氨基酸殘基直接進行化學修飾偶聯(lián)上細胞毒素而獲得的,主要分為兩類:一類是使用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯的活化羧基與抗體的賴氨酸殘基進行偶聯(lián),上市藥物Mylotarg、Kadcyla和Besponsa就是通過該方法制備得到的(圖2);另一類是通過使用巰基特異性試劑(如馬來酰亞胺)與半胱氨酸反應來合成的,上市藥Adcetris、Padcev、Polivy、Enhertu、Trodelvy、Blenrep和Zynlonta都是通過這種偶聯(lián)方法合成的(圖2)?;谫嚢彼崤悸?lián)所得的ADCs,通過肽圖已確定偶聯(lián)發(fā)生在重鏈和輕鏈上約40個不同的賴氨酸殘基上,從而可以產(chǎn)生超過100萬個不同的異構(gòu)體。因此該方法制得的ADCs均一性差。而基于抗體半胱氨酸的偶聯(lián),復雜程度相較而言有所降低??贵w本身并不含有半胱氨酸殘基,但它含有4對易于接近的鏈間硫-硫鍵,還原后可得到8個巰基。因此,當8個巰基全部偶聯(lián)上藥物分子時,所得ADCs均一性較好。而當藥物-抗體比例(drug-antibody ratio,DAR)控制在4左右或更低時,仍舊為多個不同修飾位點的混合物。不同載藥量、不同連接位置的混合物將會極大地影響藥物的質(zhì)量控制、藥代性質(zhì)和治療窗口[9]。因此,通過定位偶聯(lián)(確定的反應位點和偶聯(lián)數(shù)目)獲得均一性產(chǎn)物,在新一代ADCs的發(fā)展中尤為重要[10-12]。

    圖2 FDA批準上市的ADCs藥物

    近年來,隨著科學家們的不斷努力,多種偶聯(lián)技術(shù)被報道用于定位合成ADCs,以獲得DAR值均一性好、藥代動力學和安全性更佳的ADCs。隨著生物正交化學和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的發(fā)展,科學家們已經(jīng)開發(fā)了多種用于定點修飾抗體的方法,包括定點突變半胱氨酸殘基用于偶聯(lián)的THIOMAB技術(shù)[13]、引入非天然氨基酸的ncAAs技術(shù)[14-15]、引入硒半胱氨酸的selenomabs技術(shù)[16-18]、通過親和肽或小分子誘導的抗體選擇性修飾的AJICAP技術(shù)[19-21]等等。基于酶催化的抗體選擇性修飾也是一種常用的得到均一性ADCs的手段,如transglutaminases(mTG)介導的偶聯(lián)技術(shù)[22-23]、sortase介導的抗體結(jié)合(SMAC)技術(shù)[24-25]、遺傳編碼一段肽標簽用于進一步的酶促修飾的SMARTag技術(shù)等等[26-28]。另外,基于抗體糖基化的選擇性修飾也陸續(xù)被報道[29-30]。

    3 二硫鍵橋連技術(shù)

    相較而言,基于天然抗體的化學偶聯(lián)方法在成本和方便性方面更具競爭力。近幾年,利用抗體中的4對鏈間硫-硫鍵,先還原再橋連而發(fā)展的“ThioBridge”技術(shù)逐漸顯示其優(yōu)越性,包括:可以實現(xiàn)直接對天然抗體定位修飾、抗體適用性廣、DAR值可控、所得ADCs均一性高等[31-32]。該方法首先對抗體中的4對鏈間二硫鍵,用還原性化合物如三(2-羧乙基)膦 (TCEP) 進行還原,然后利用與半胱氨酸選擇性反應的試劑對抗體二硫鍵進行重新橋連的同時引入細胞毒性藥物。該方法不僅能夠保持原有二硫鍵的穩(wěn)定作用,并且可以控制每對二硫鍵只偶聯(lián)一個連接分子,從而實現(xiàn)定位偶聯(lián)。目前,研究較多的二硫鍵橋連試劑主要有雙砜(bissulfones)化合物、新一代馬來酰亞胺(NGMs)化合物和噠嗪二酮(PDs)類化合物等。近年來也涌現(xiàn)出許多其他的化合物,包括使用芳炔二丙腈(ADPN)、二乙烯基嘧啶(DVP)、二溴甲基雜環(huán)(C-Lock)、二氯丙酮或鉑(II)配合物、N-苯基雙乙烯基磺酰胺化合物和雙(乙烯基磺酰基)哌嗪(BVP)化合物等,用于抗體中二硫鍵的重新橋連。

    3.1 雙砜化合物

    1990年Bioconjugate Chemistry首次報道了將雙砜化合物用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的重新橋連,隨后隨著ADCs研究的興起與發(fā)展,該方法進一步應用到ADCs的合成中[33-34]。從反應機理來說,反應是先通過原位消除一個磺?;梢粋€α,β-不飽和羰基,進而與半胱氨酸殘基發(fā)生邁克爾(Michael)加成反應生成硫醚鍵。重復這個消除-加成過程使兩個半胱氨酸殘基通過一個三碳橋進行共價橋連。2014年,Badescu等人[35]首次將這一策略應用于ADCs的合成,他們報道了將一種雙砜試劑通過PEG24的鏈和一個可裂解的Val-Cit-PABC結(jié)構(gòu)連接到MMAE上,用于曲妥珠單抗二硫鍵的重新橋連(圖3)。用疏水作用色譜法(HIC)分析所得的ADCs,結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有78%的產(chǎn)物就是預期的DAR值為4的偶聯(lián)物。其余的組分由于連接子反應不足或反應過度,得到了10%的DAR值為3的偶聯(lián)物和11%的DAR值為5的偶聯(lián)物。ADCs在人血清白蛋白(HSA)的存在下,5天內(nèi)表現(xiàn)出極高的穩(wěn)定性,且在小鼠異種移植腫瘤模型中,以20 mg/kg的劑量給藥5次后,ADCs展現(xiàn)出比曲妥珠單抗更好的抗腫瘤活性。在Bryant等人[36]的后續(xù)研究中,對類似的抗HER2的曲妥珠單抗偶聯(lián)物(該ADCs含有較短的PEG6鏈)進行了藥效評估,并與已上市的HER2靶向ADC藥物T-DM1進行對比。在JIMT-1小鼠異種移植腫瘤模型中,兩個ADCs在5 mg/kg的劑量時展現(xiàn)了相似的活性,但是在10 mg/kg的劑量時雙砜橋連的ADC明顯比T-DM1更有效。

    圖3 使用雙砜化合物重新橋連抗體的鏈間二硫鍵產(chǎn)生均一的ADCs

    有假設(shè)認為可裂解的Val-Cit二肽結(jié)構(gòu)在血液循環(huán)中的提前降解會降低雙砜橋連的ADC的療效。眾所周知,連接子結(jié)構(gòu)(包括聚乙二醇片段)和偶聯(lián)位點會影響Val-Cit結(jié)構(gòu)在小鼠血漿中的穩(wěn)定性[37-38]。因此,Pabst等人[39]研究了PEG鏈對含有Val-Cit-PABC可裂解機制的雙砜偶聯(lián)ADCs的藥效和穩(wěn)定性的影響,發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi),帶有PEG支鏈或沒有PEG鏈的雙砜橋連ADCs明顯比帶有線性PEG鏈的雙砜橋連ADCs更穩(wěn)定。此外,與已上市的抗CD30的ADC Adcetris相比,帶有支鏈的ADC具有更好的穩(wěn)定性,且在CD30陽性的小鼠異種移植腫瘤模型中單劑量(1 mg/kg)治療后腫瘤完全消退,體內(nèi)療效很好(圖3)。

    Abzena公司向多家制藥公司授權(quán)其雙砜連接劑技術(shù),商標名ThioBridge。多個使用此技術(shù)的藥物已經(jīng)處在臨床前和臨床試驗的研究中。例如,OBI-999是由OBI制藥公司開發(fā)的ADC,是將MMAE有效載荷通過雙砜連接劑偶聯(lián)至人源抗Globo H抗體上而合成的(圖3)[40]?;谄渑R床前數(shù)據(jù),F(xiàn)DA授予該ADC治療胃癌和胰腺癌的孤兒藥資格。OBI目前正在招募局部晚期或轉(zhuǎn)移性實體腫瘤患者,包括胃癌、胰腺癌、食道癌和結(jié)直腸癌,進行I/II期臨床研究。另一個基于雙砜連接劑的ADC——HTI-1511,是由Halozyme公司開發(fā),由靶向EGFR的抗體與有效負載MMAE偶聯(lián)而得。該ADC在患者來源的小鼠異種移植腫瘤模型中顯示出有效的腫瘤生長抑制或退化,包括KRAS/BRAF突變的模型,該突變通常與EGFR靶向治療的耐藥性和不良預后有關(guān)[40]。此外,HTI-1511已被證明在靈長類動物模型中具有良好的耐受性。

    Pabst等人[39]最近發(fā)表了使用雙砜試劑重新橋連二硫鍵的詳細步驟,將有助于該試劑更廣泛地應用。通用的反應條件是非常溫和的,將還原的抗體與5~6當量的雙砜試劑在pH為7.5的緩沖液中在22 ℃下共同孵育16 h。約有75%~85%的抗體反應形成DAR值為4的偶聯(lián)物,通過HIC進一步純化后,可得到完全均一的DAR值為4的ADCs。OBI-999的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)數(shù)據(jù)表明,ADC是兩種異構(gòu)體的混合物,一種是所有的鏈間二硫鍵以原本的配對方式全部重新橋連的偶聯(lián)物,而另一種是“半抗體”偶聯(lián)物,即抗體重鏈鉸鏈區(qū)半胱氨酸之間形成了非原生的鏈內(nèi)二硫鍵橋連,而失去了原有的抗體重鏈之間的共價連接。目前尚不清楚這種異質(zhì)性是否會影響ADC的性能。

    3.2 新一代馬來酰亞胺(next-generation maleimides,NGMs)化合物

    新一代馬來酰亞胺(NGMs)是一類用兩個鹵化物或硫代苯酚離去基團修飾的馬來酰亞胺試劑。將這種NGMs試劑用于二硫鍵重新橋連最早是由Smith等人[41]在2010年提出的,當時他們發(fā)現(xiàn)這些試劑可以通過連續(xù)的加成-消除反應有效地實現(xiàn)二硫鍵的重新橋連,在兩個半胱氨酸殘基之間插入一個雙碳橋。2014年,Schumacher等人[42]首次將這種方法應用在制備ADCs中。有報道稱,將還原的曲妥珠單抗與5當量的二溴馬來酰亞胺(dibromomaleimide,DBM)或二硫代苯酚馬來酰亞胺(dithiophenylmaleimide,DSPh)共孵育,在1 h之內(nèi)就可以將還原的二硫鍵全部重新橋連。這說明與傳統(tǒng)的馬來酰亞胺偶聯(lián)一樣,該反應具有很快的反應動力學。研究者指出,所產(chǎn)生的偶聯(lián)物是不均一的,同時存在天然重新橋連的“全抗體”偶聯(lián)物和非天然重新橋連的“半抗體”偶聯(lián)物。研究發(fā)現(xiàn)可以通過同時添加還原劑和連接劑,減少半抗體的形成,這表明減少還原半胱氨酸殘基的停留時間可以降低它們的錯配概率。該改進策略已被用于曲妥珠單抗與含有炔基支架的二硫代苯酚馬來酰亞胺試劑的偶聯(lián)反應中,隨后通過點擊化學反應連接上細胞毒素阿霉素分子,得到具有較好均一性的DAR值為4的ADCs(圖4)。

    和傳統(tǒng)的馬來酰亞胺一樣,NGMs在有游離硫醇存在時是不穩(wěn)定的,除非將其水解成馬來酸的形式[43]。Nunes等人[44]證明,含有NGMs的抗體偶聯(lián)物在pH為8.4的緩沖液中72 h后會完全水解,且得到的水解偶聯(lián)物在人血漿中7天內(nèi)仍完全穩(wěn)定。該水解策略被用于合成DAR值為4的ADC,將曲妥珠單抗與含有不可裂解的PEG12鏈和MMAE有效荷載的二硫代苯酚馬來酰亞胺連接子偶聯(lián)(圖4)。該ADC的體內(nèi)活性比未經(jīng)修飾的曲妥珠單抗更好,以20 mg/kg的劑量給藥三次可使小鼠的腫瘤完全消退[45]。

    圖4 使用新一代馬來酰亞胺化合物重新橋連抗體的鏈間二硫鍵產(chǎn)生均一的ADCs

    在此基礎(chǔ)上,研究人員比較了使用NGM構(gòu)建的ADC和通過馬來酰亞胺修飾半胱氨酸殘基得到的平均DAR值為4的不均一的ADCs的體內(nèi)穩(wěn)定性和有效性[46]。使用一種不可裂解的二溴馬來酰亞胺連接子將MMAF與曲妥珠單抗或抗CD98的抗體IGNX偶聯(lián),得到均一的DAR值為4的ADCs。在這兩個實例中,與它們對應的不均一的ADCs相比,NGM構(gòu)建的ADCs在小鼠體內(nèi)的循環(huán)半衰期顯著增加而且可使腫瘤持續(xù)消退。盡管這些結(jié)果是有前景的,但NGMs試劑的主要缺點是其需要72 h的水解來保證穩(wěn)定性。Morais等人[47]研究發(fā)現(xiàn)可通過增加馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)周圍的電子缺失和空間體積來加速水解過程。具體來說,在馬來酰亞胺環(huán)相鄰位置引入甘氨酸衍生結(jié)構(gòu)可將水解時間從72 h減少到1 h(圖4)。

    雖然大多數(shù)報道的NGMs構(gòu)建的ADCs使用的是不可裂解的連接子,但是,也有報道它們與組織蛋白酶可裂解連接子的聯(lián)合使用。Bryden等人[48]發(fā)現(xiàn)可以將Val-Ala和Val-Cit二肽結(jié)構(gòu)引入到NGMs連接子中,但是Val-Ala結(jié)構(gòu)的疏水性會顯著降低反應性,而使用Val-Cit-NGM連接子大約也只有50%的抗體能夠轉(zhuǎn)化成預期的DAR值為4的ADC。后來通過引入PEG鏈來解決疏水性的問題,可以分別得到具有這兩個二肽結(jié)構(gòu)的ADCs。近年來,科學家們還研究了不同取代模式對NGMs穩(wěn)定性和均一性的影響。例如,F(xiàn)orte等人[49]報道二碘馬來酰亞胺化合物比二溴馬來酰亞胺化合物穩(wěn)定。此外,F(xiàn)euillatre等人[50]報道和二溴馬來酰亞胺和二硫代苯酚馬來酰亞胺試劑相比,使用雜化硫溴馬來酰亞胺(TBMs)試劑可以得到具有更狹窄的DAR分布的更均一的ADCs。NGMs已被多次證明能夠產(chǎn)生具有高度均一性的ADCs。環(huán)水解的優(yōu)化顯著提高了這種方法的應用性,可合成具有較高血漿穩(wěn)定性的ADCs。NGMs連接子除了與MMAE和阿霉素等多種傳統(tǒng)有效載荷兼容外,最近研究證明它可以與PROTAC有效載荷偶聯(lián)生成新一代的ADCs,展示了其廣泛的適用性[51]。

    3.3 噠嗪二酮(pyridazinediones,PDs)類化合物

    Chudasama等人[52]最初將噠嗪二酮(PDs)類化合物作為一種巰基可裂解的連接子用于多肽偶聯(lián)和前藥開發(fā)。與NGMs類似,PDs具有兩個離去基團,通過連續(xù)的加成-消除反應與半胱氨酸殘基發(fā)生反應,在兩個殘基之間插入一個雙碳橋。雖然形成的連接可以被其他的游離硫基切斷,但通常需要較高濃度的硫基,且許多研究已經(jīng)證明了PD衍生偶聯(lián)物在人血漿中具有很好的穩(wěn)定性。2017年,Robinson等人[45]使用PD連接子將含有組織蛋白酶可裂解或不可裂解的MMAE有效載荷偶聯(lián)到抗HER2的抗體上,合成了DAR值為4的ADCs。質(zhì)譜和HIC分析顯示,其中90%的偶聯(lián)物的DAR值為4,僅有3%的DAR值為3的偶聯(lián)物和7%的DAR值為5的偶聯(lián)物。這兩種ADCs對抗原陽性細胞系都有很強的殺傷力,可裂解ADC的活性比不可裂解ADC強100倍。兩種ADCs在小鼠模型中均有效且耐受性良好。

    因為PD試劑環(huán)上的兩個氮都可作為正交反應的支架,所以可將其用于生成雙功能偶聯(lián)物。2015年,Maruani等人[53]利用這一特性,用一個含有末端炔烴和一個張力炔烴的二溴噠嗪二酮連接子修飾曲妥珠單抗。隨后通過正交CuAAC或SPAAC反應與阿霉素有效載荷和熒光分子進行偶聯(lián),產(chǎn)生了含有四個細胞毒性有效載荷和四個熒光分子的DAR值為4的ADCs(圖5)。盡管經(jīng)過雙重修飾,但ADC仍保持對靶標抗原的高親和力,并在體外對抗原陽性細胞株仍具有高度選擇性。使用PD試劑在抗體上添加第二個功能性部分的特性也被用來增強所連有效載荷的親水性[54]。通過PD試劑將DM1有效載荷和PEG6或PEG26鏈與還原的曲妥珠單抗反應,可產(chǎn)生較為均一的DAR值為4的ADCs(圖5)。兩種ADCs在體內(nèi)均顯示出與T-DM1類似的活性,并在小鼠異種移植模型中,以10 mg/kg劑量給藥2次后,可使腫瘤完全消退。

    圖5 使用噠嗪二酮類化合物重新橋連抗體的鏈間二硫鍵產(chǎn)生均一的ADCs

    雖然常規(guī)的PD連接子與每個二硫鍵反應可生成DAR值為4的ADCs,但Lee等人[55]利用PD連接子支架的第二個功能化載體連接兩個試劑,從而創(chuàng)建一個化合物可以與四個半胱氨酸殘基反應的連接子。這種方式適用于連接一個單一的炔烴支架,合成帶有兩個有效載荷的抗體藥物偶聯(lián)物。這個概念已被成功用于合成均一的DAR值為2的阿霉素ADCs。在另一個研究中,將樹突狀結(jié)構(gòu)引入至二溴噠嗪二酮試劑中,將4個基于卟啉的光敏劑載荷附著在每個PD樹突狀分子上,可以合成DAR值為16的均一的曲妥珠單抗-ADC[56]。該ADC在抗原陽性細胞系中,在光照下表現(xiàn)出良好的細胞活性,而在黑暗中無任何活性,從而證明了PD連接子與光敏劑載荷的相容性。PD連接劑的進一步功能化偶聯(lián)主要通過CuAAC或SPAAC反應來實現(xiàn),但是也可以使用其他類型的點擊化學。例如,Marquard等人[57]最近報道合成了一種含有反式環(huán)辛烯(TCO)功能化支架的二溴噠嗪二酮試劑。這種PD-TCO試劑可成功地與三個IgG1抗體(曲妥珠單抗、西妥昔單抗和利妥昔單抗)偶聯(lián),并進一步與含四嗪的熒光分子反應。所得的三個熒光偶聯(lián)物均一性好,偶聯(lián)效率高。值得注意的是,即使是利妥昔單抗,已知通過傳統(tǒng)的NHS酯化學方法修飾后蛋白大約損失90%,而經(jīng)PD-TCO修飾后有83%的偶聯(lián)產(chǎn)率。這表明,對容易聚集的抗體進行偶聯(lián)時,二硫鍵重新橋連比隨機賴氨酸修飾具有更明顯的優(yōu)勢。

    就反應動力學和產(chǎn)物均一性而言,PDs和NGMs一樣,都是最好的二硫鍵重新橋連試劑之一。此外,PDs試劑的“plug-and-play”特性允許其通過生物正交化學實現(xiàn)多種不同載荷的靈活功能化,這對合成雙功能的ADCs來說是很有吸引力的。

    3.4 其他二硫鍵橋連試劑

    基于雙砜、NGMs和PDs化合物的大量工作清楚地證明了使用二硫鍵重新橋連策略生成均一ADCs的可行性和實用性。近年來,化學家們開發(fā)了各種各樣新的二硫鍵橋連試劑。C-Lock是由Concortis Biotherapeutics公司開發(fā)的專利技術(shù),使用二溴甲基雜環(huán)類化合物,如二溴甲基喹喔啉作為二硫鍵重新橋連的試劑(圖6A)。2013年,Sorrento Therapeutics公司使用C-Lock技術(shù)開發(fā)了抗體藥物偶聯(lián)物STI-6129,由一個duostatin有效載荷和一個靶向CD38的抗體偶聯(lián)而成,用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤。STI-6129在臨床前研究中表現(xiàn)出良好的活性,最近已進入I期臨床試驗,用于治療復發(fā)或難治性系統(tǒng)性AL淀粉樣變性。Zova Biotherapeutics公司也應用C-Lock技術(shù)開發(fā)了一款ADC藥物ZV0508,由二溴甲基喹喔啉連接子將duostatin有效載荷與靶向5T4癌胎糖蛋白的抗體偶聯(lián)而成[58]。HIC分析顯示,在僅與5摩爾當量的連接子孵育后,約有90%的抗體轉(zhuǎn)化為DAR值為4的ADC。但是,與用其他二硫鍵重新橋連技術(shù)開發(fā)的ADCs一樣,經(jīng)CE-SDS分析發(fā)現(xiàn)使用C-Lock技術(shù)開發(fā)的ADC也是全抗體和半抗體組成的混合物。然而,在臨床前的體內(nèi)研究中,與使用馬來酰亞胺偶聯(lián)產(chǎn)生的類似ADC相比,ZV0508表現(xiàn)出更加出色的耐受性和有效性。

    同時,諾華公司報道了將1,3-二鹵代丙酮試劑如1,3-二氯丙酮或1,3-二溴丙酮用于抗體的二硫鍵重新橋連。在所得的偶聯(lián)物中,每一對半胱氨酸通過一個含有活性酮的三碳鏈連接。這種酮可以進一步與含羥胺修飾的有效載荷反應形成肟連接(圖6B)。在一個應用中,這種方法被用于構(gòu)建DAR值為3.8的抗HER2的ADC。在另一個應用中,引入的酮與含有兩個羥胺基團的連接子-有效載荷反應連接,從而構(gòu)建了含有MMAF的DAR值為1.8的抗HER2的ADC。質(zhì)譜和SDSPAGE分析顯示這兩種ADCs高度均一,約90%的抗體轉(zhuǎn)化為目標偶聯(lián)物,且形成了較少的半抗體。

    Invictus Oncology公司則開發(fā)了一種鉑(II)試劑用于二硫鍵的重新橋連(圖6C)[59]。先將拓撲異構(gòu)酶抑制劑喜樹堿連接到一種二價胺配體上,該配體隨后與氯化鉑(II)絡(luò)合,從而得到了一種基于鉑(II)的連接子-有效載荷偶聯(lián)物。該連接子-有效載荷偶聯(lián)物可與還原的曲妥珠單抗、利妥昔單抗或西妥昔單抗反應,得到DAR值為8的ADCs。與類似的馬來酰亞胺偶聯(lián)物相比,這些ADCs表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和均一性,但是也觀察到大量半抗體的生成。隨后驗證了西妥昔單抗-ADC體內(nèi)外的生物活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ADCs的活性僅略高于未修飾的西妥昔單抗,這可能是選擇了不合適的有效載荷或釋放機制導致的,而不是連接子的問題。

    Koniev等人[60]在2018年開發(fā)了一種芳炔二丙腈(ADPN)試劑可用于二硫鍵的重新橋連并將其應用于ADCs中(圖6D)。這項工作的靈感來自先前的研究發(fā)現(xiàn)——單芳炔丙腈鍵可與半胱氨酸殘基形成非常穩(wěn)定的鍵合[61]。為了將其轉(zhuǎn)化為一種二硫鍵重新橋連的策略,對ADPN的三種區(qū)域異構(gòu)體進行了比較。研究發(fā)現(xiàn),間位ADPNs比鄰位或?qū)ξ籄DPNs有更高的轉(zhuǎn)化率,但得到的偶聯(lián)物也是全抗體和半抗體的混合物。間位ADPN連接子隨后被用于構(gòu)建含有MMAE和β-半乳糖苷酶可裂解連接子的曲妥珠單抗-ADCs中。質(zhì)譜分析顯示約50%的抗體轉(zhuǎn)化為理想的DAR值為4的偶聯(lián)物,同時存在大量的DAR值為3和DAR值為5的偶聯(lián)物。在體外藥效評估中,ADC顯示出與T-DM1相當?shù)募毎拘浴?/p>

    圖6 其他用于抗體二硫鍵重新橋連的方法:(A)二溴甲基喹喔啉;(B)1,3-二氯丙酮;(C)鉑(II)試劑;(D)芳炔二丙腈;(E)二乙烯基嘧啶

    2019年,Walsh等人[62]報道了將二乙烯基嘧啶(DVP)試劑作為新型二硫鍵重新橋連試劑用于構(gòu)建ADCs。與間位ADPNs類似,DVPs可以通過兩個連續(xù)的邁克爾加成反應進行二硫鍵的重新橋連,在兩個半胱氨酸殘基之間插入一個靈活的七碳橋(圖6E)。這種方法被用于合成了幾個DAR值為4的曲妥珠單抗靶向的ADCs,這些ADCs由組織蛋白酶可裂解連接子、硫酸酯酶可裂解連接子或不可裂解的連接子和MMAE、hemiasterlin或阿霉素等有效載荷構(gòu)成[62-64]。在這些偶聯(lián)物中,均觀察到大約90%的抗體轉(zhuǎn)化為理想的DAR值為4的偶聯(lián)物,但也都是全抗體和半抗體的混合物。這些偶聯(lián)物在人血漿中顯示出很好的穩(wěn)定性,在體外也展現(xiàn)出很強的細胞毒性和選擇性。最近,雙功能DVP連接子的開發(fā)進一步擴大了該方法的應用范圍[65]。該連接子可在曲妥珠單抗上同時偶聯(lián)上MMAE細胞毒性藥物和熒光分子,實現(xiàn)抗體的雙重功能化,且不對抗體或載荷的活性產(chǎn)生任何影響。二乙烯基三嗪試劑也被證明在使用接近化學計量的試劑時就可以有效地進行二硫鍵的重新橋連,構(gòu)建負載為4的抗體偶聯(lián)物[66]。

    我們實驗室也發(fā)展了兩種試劑可用于多肽和蛋白質(zhì)的二硫鍵重新橋連并將其應用于ADCs的制備中。一類是苯環(huán)類雙乙烯基磺酰胺連接子(圖7A)[67-68],乙烯基磺酰胺可與半胱氨酸發(fā)生邁克爾加成反應,在優(yōu)化的條件下,可實現(xiàn)多肽二硫鍵的重新橋連。隨后選用不同的連接方式在苯環(huán)上引入炔基活性支架,設(shè)計合成了三個不同的連接子(兩個通過給電子基團引入,一個通過吸電子基團引入)。實驗發(fā)現(xiàn),苯環(huán)上包含給電子基團的N-苯基雙乙烯基磺酰胺連接子可以重新橋連抗體的二硫鍵以構(gòu)建均一的DAR值為4的ADCs。ADCs在體外展現(xiàn)了很好的抗原選擇性細胞毒性,在體內(nèi)也顯示出顯著的抗腫瘤活性,并且具有較好的耐受性。另一類是雙(乙烯基磺酰基)哌嗪(BVP)連接子(圖7B)[69],可以選擇性地重新橋連抗體Fab區(qū)域的二硫鍵,并構(gòu)建DAR值為2的ADCs且不出現(xiàn)二硫鍵的錯配。這一試劑首次實現(xiàn)了利用橋連試劑對抗體Fab區(qū)域二硫鍵進行選擇性的修飾,從而避免了半抗的形成。使用BVP連接子將MMAE與曲妥珠單抗偶聯(lián)可獲得有效的ADCs。偶聯(lián)物保留了與原抗一樣的受體親和力和內(nèi)在化效率。同時,研究還證明了ADCs在體外細胞毒性中的高活性和抗原選擇性,并且發(fā)現(xiàn)它們與T-DM1相比在某種程度上具有更寬的治療窗口。我們還開發(fā)了康普瑞?。–A4)作為新型有效載荷(圖7B)[70],基于BVP連接子的二硫鍵重新橋連,將CA4衍生的藥物-連接子偶聯(lián)物與靶向EGFR的抗體西妥昔單抗偶聯(lián),生成較為均一的抗體藥物偶聯(lián)物。所得的抗體藥物偶聯(lián)物均保持與原抗相當?shù)挠H和力和內(nèi)吞作用,且展現(xiàn)出很好的體外活性,在EGFR陽性異種移植腫瘤模型中顯示出顯著的抗腫瘤活性。

    圖7 苯環(huán)類雙乙烯基環(huán)酰胺化合物(A)和雙(乙烯基磺?;┻哙海˙)用于抗體二硫鍵重新橋連

    4 總結(jié)和展望

    抗體藥物偶聯(lián)物是近年來腫瘤靶向治療研究領(lǐng)域內(nèi)的熱門方向。它汲取了傳統(tǒng)抗癌化學小分子藥物和生物抗體藥物的優(yōu)點,又最大程度上減弱了這兩種單一藥物的缺點,可以實現(xiàn)精準治療。影響ADCs臨床成功的因素有很多,包括抗體的選擇、異質(zhì)性和靶點抗原表達水平、有效載荷效力和作用機制、偶聯(lián)策略以及可裂解和不可裂解連接子的選擇等,因此開發(fā)療效好、毒性低的ADCs仍面臨較大的挑戰(zhàn)。其中,連接子部分決定了ADCs中有效載荷的數(shù)量和位置,從而影響ADCs的藥代動力學、藥物釋放速率、生物活性和治療窗口,在ADCs設(shè)計中起著至關(guān)重要的作用。與現(xiàn)有的需要抗體改造的方法相比,基于天然抗體的化學位點特異性修飾有更快的可操作性和有效性。二硫鍵的重新橋連策略已被多次證明在構(gòu)建均一性ADCs中有著顯著的優(yōu)勢。目前諸多的二硫鍵橋連新方法尚未被用于臨床研究中,所得的ADCs大多還處于臨床前的研究中,研究者們正在努力將這些方法真正應用于臨床研究中,使ADCs藥物在腫瘤領(lǐng)域及其他領(lǐng)域進一步大放光彩。

    猜你喜歡
    二硫鍵酰亞胺有效載荷
    二硫鍵影響GH11木聚糖酶穩(wěn)定性研究進展
    理念牽引 機制創(chuàng)新 人才驅(qū)動 做有效載荷創(chuàng)新發(fā)展領(lǐng)跑者
    基于質(zhì)譜技術(shù)的二硫鍵定位分析方法研究進展
    液相色譜質(zhì)譜對重組人生長激素-Fc(CHO 細胞)二硫鍵連接的確認
    面向有效載荷數(shù)字化研制的標準化工作轉(zhuǎn)型初探
    衛(wèi)星有效載荷研制流程的策劃與推進
    改性雙馬來酰亞胺樹脂預浸料性能研究
    雙馬來酰亞胺對丙烯酸酯結(jié)構(gòu)膠的改性研究
    中國塑料(2017年2期)2017-05-17 06:13:21
    二硫鍵在蛋白質(zhì)中的作用及其氧化改性研究進展
    中國飼料(2016年17期)2016-12-01 08:08:19
    EG/DMMP阻燃聚氨酯-酰亞胺泡沫塑料的研究
    中國塑料(2015年6期)2015-11-13 03:02:49
    国产精品女同一区二区软件 | 99精品在免费线老司机午夜| 美女被艹到高潮喷水动态| 日韩欧美在线乱码| 欧美最新免费一区二区三区| 精品人妻视频免费看| 五月玫瑰六月丁香| 桃红色精品国产亚洲av| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 免费观看在线日韩| 国产三级中文精品| 日韩强制内射视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 99精品在免费线老司机午夜| 可以在线观看毛片的网站| 99热这里只有是精品50| 波多野结衣巨乳人妻| 久久人妻av系列| 成人亚洲精品av一区二区| 特大巨黑吊av在线直播| 男人和女人高潮做爰伦理| 嫩草影院入口| 99久久无色码亚洲精品果冻| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲成人久久爱视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产 一区精品| 九九热线精品视视频播放| 亚洲av免费高清在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产成人aa在线观看| 男女那种视频在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 深夜a级毛片| 十八禁网站免费在线| 久久午夜福利片| 久久草成人影院| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日韩强制内射视频| 天美传媒精品一区二区| 午夜老司机福利剧场| 国产精品人妻久久久影院| 亚州av有码| 草草在线视频免费看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 国产亚洲91精品色在线| 久久久久久久午夜电影| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产成人av教育| 性欧美人与动物交配| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 成人精品一区二区免费| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久香蕉精品热| 国产亚洲精品久久久com| 午夜福利视频1000在线观看| 久久久国产成人免费| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人欧美大片| 亚洲中文日韩欧美视频| 波野结衣二区三区在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲av不卡在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 午夜福利在线在线| 免费观看人在逋| 久久久国产成人精品二区| 特级一级黄色大片| 精品人妻视频免费看| 俄罗斯特黄特色一大片| 中文字幕免费在线视频6| a级一级毛片免费在线观看| 日韩欧美 国产精品| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲国产色片| 人人妻人人看人人澡| 亚洲 国产 在线| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲无线观看免费| 最好的美女福利视频网| 国产精品女同一区二区软件 | 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产精品成人综合色| 91麻豆av在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲黑人精品在线| 又爽又黄a免费视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 搡老岳熟女国产| 亚洲av第一区精品v没综合| 啦啦啦啦在线视频资源| 黄色配什么色好看| 久久久久久伊人网av| 亚洲五月天丁香| 久久久久久久久久久丰满 | 免费大片18禁| 无人区码免费观看不卡| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产成人a区在线观看| av福利片在线观看| 久久精品影院6| 成人性生交大片免费视频hd| 日韩欧美在线乱码| 男人舔女人下体高潮全视频| 日本一二三区视频观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品一区二区三区人妻视频| 国产私拍福利视频在线观看| 国产精华一区二区三区| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品综合久久久久久久免费| 中文字幕熟女人妻在线| 精品久久久久久成人av| 久久精品91蜜桃| 丰满的人妻完整版| 最后的刺客免费高清国语| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美+日韩+精品| 精品久久久久久,| 亚洲av熟女| 色尼玛亚洲综合影院| 在线观看免费视频日本深夜| 精品午夜福利在线看| 国产精华一区二区三区| netflix在线观看网站| 国产精品福利在线免费观看| 一区二区三区四区激情视频 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲av熟女| 内地一区二区视频在线| 1000部很黄的大片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 热99re8久久精品国产| 久久久久久久久中文| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲电影在线观看av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| av福利片在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 色综合站精品国产| 午夜精品在线福利| 久久久国产成人精品二区| 久久久精品大字幕| 国产精品亚洲美女久久久| 国产高潮美女av| 成人国产麻豆网| 天堂√8在线中文| 午夜福利在线观看吧| 国产视频内射| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美区成人在线视频| 成人三级黄色视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 中国美女看黄片| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 少妇的逼好多水| videossex国产| 午夜福利成人在线免费观看| 全区人妻精品视频| 亚洲av免费在线观看| 午夜激情福利司机影院| 久久香蕉精品热| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品久久久久久成人av| 午夜免费成人在线视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产午夜福利久久久久久| 日韩欧美三级三区| 午夜精品在线福利| 黄色欧美视频在线观看| 少妇丰满av| 1024手机看黄色片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 天堂√8在线中文| 91麻豆av在线| 免费在线观看影片大全网站| 毛片一级片免费看久久久久 | www.色视频.com| 热99re8久久精品国产| h日本视频在线播放| 免费高清视频大片| 成人av在线播放网站| 国内精品久久久久精免费| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 欧美zozozo另类| 亚洲在线自拍视频| 美女大奶头视频| 免费观看的影片在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 日日撸夜夜添| 亚洲av不卡在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 岛国在线免费视频观看| 中文字幕久久专区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 欧美国产日韩亚洲一区| 99久久九九国产精品国产免费| 美女大奶头视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费观看精品视频网站| 国产真实伦视频高清在线观看 | 特级一级黄色大片| 美女免费视频网站| 嫩草影院新地址| 国产成人av教育| 免费看光身美女| 亚洲美女搞黄在线观看 | 嫁个100分男人电影在线观看| www.www免费av| 国产人妻一区二区三区在| 最新在线观看一区二区三区| 性色avwww在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 中文字幕av在线有码专区| 午夜福利在线在线| 国模一区二区三区四区视频| 无人区码免费观看不卡| 国产单亲对白刺激| 看片在线看免费视频| 网址你懂的国产日韩在线| 精品一区二区三区人妻视频| 成人国产麻豆网| 长腿黑丝高跟| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美黑人巨大hd| 国产人妻一区二区三区在| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产探花在线观看一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 身体一侧抽搐| 国产真实伦视频高清在线观看 | 日韩 亚洲 欧美在线| 成人美女网站在线观看视频| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人精品一区二区免费| av在线观看视频网站免费| 精品免费久久久久久久清纯| 九九爱精品视频在线观看| 波多野结衣高清无吗| 免费大片18禁| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久久久久久午夜电影| 嫩草影院入口| 可以在线观看的亚洲视频| 99热这里只有精品一区| 国产精品一区二区免费欧美| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日本黄色视频三级网站网址| 国产 一区精品| 香蕉av资源在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成人特级av手机在线观看| 亚洲av熟女| 国产高清视频在线观看网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美日韩黄片免| 波野结衣二区三区在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 观看美女的网站| 亚洲av不卡在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜日韩欧美国产| 搞女人的毛片| 赤兔流量卡办理| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲av成人精品一区久久| 一个人看视频在线观看www免费| 日本成人三级电影网站| 欧美bdsm另类| 18禁在线播放成人免费| 韩国av在线不卡| 国产精品98久久久久久宅男小说| 色综合站精品国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产毛片a区久久久久| 国产精品福利在线免费观看| 男女之事视频高清在线观看| 少妇的逼水好多| 国产精品无大码| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲三级黄色毛片| 五月伊人婷婷丁香| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 成人性生交大片免费视频hd| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 男女啪啪激烈高潮av片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 91久久精品国产一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 亚洲色图av天堂| 国国产精品蜜臀av免费| av在线老鸭窝| 此物有八面人人有两片| 日本 欧美在线| 国产精品国产高清国产av| 欧美精品国产亚洲| aaaaa片日本免费| av天堂中文字幕网| 欧美zozozo另类| 欧美最黄视频在线播放免费| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 联通29元200g的流量卡| 亚洲av美国av| 国产单亲对白刺激| 不卡一级毛片| 夜夜爽天天搞| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品人妻久久久影院| 国产麻豆成人av免费视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 嫩草影院新地址| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久久久大精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产一区二区在线观看日韩| 男人的好看免费观看在线视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 在线观看一区二区三区| 日本在线视频免费播放| 日本与韩国留学比较| 夜夜爽天天搞| av天堂中文字幕网| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品一区二区三区人妻视频| 久久午夜亚洲精品久久| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 十八禁网站免费在线| 色视频www国产| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 免费观看人在逋| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩欧美在线二视频| 久久热精品热| 午夜亚洲福利在线播放| 免费看光身美女| 欧美精品国产亚洲| 精品日产1卡2卡| 搡老岳熟女国产| 久9热在线精品视频| 国产精品亚洲美女久久久| 有码 亚洲区| 成人av在线播放网站| 看片在线看免费视频| 亚洲真实伦在线观看| a在线观看视频网站| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久99热这里只有精品18| av女优亚洲男人天堂| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲欧美日韩东京热| 国产一区二区激情短视频| 99久国产av精品| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国内精品宾馆在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 超碰av人人做人人爽久久| 国产高清三级在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 极品教师在线视频| 22中文网久久字幕| 岛国在线免费视频观看| 亚洲av二区三区四区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜a级毛片| 日韩 亚洲 欧美在线| 免费av不卡在线播放| 精品乱码久久久久久99久播| 久久人妻av系列| 日本色播在线视频| 欧美激情在线99| 亚洲av五月六月丁香网| 日日撸夜夜添| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成人美女网站在线观看视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 夜夜爽天天搞| av.在线天堂| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲国产精品合色在线| videossex国产| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 波野结衣二区三区在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产综合懂色| 日韩精品有码人妻一区| xxxwww97欧美| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国内精品久久久久久久电影| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| bbb黄色大片| 永久网站在线| 精品人妻熟女av久视频| 熟女电影av网| 国产欧美日韩一区二区精品| 动漫黄色视频在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 999久久久精品免费观看国产| 嫩草影院入口| 永久网站在线| 欧美在线一区亚洲| av天堂中文字幕网| 淫秽高清视频在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 午夜福利在线观看吧| 欧美精品啪啪一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久久久久久久久黄片| 亚洲avbb在线观看| 久久国产乱子免费精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产一区二区三区av在线 | 国产av不卡久久| 国产伦精品一区二区三区四那| 我的女老师完整版在线观看| 内地一区二区视频在线| 色吧在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 久久人人精品亚洲av| 欧美高清性xxxxhd video| 成人av一区二区三区在线看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产 一区精品| 观看美女的网站| 中文字幕高清在线视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲熟妇熟女久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品日韩av在线免费观看| 成人综合一区亚洲| 亚洲av中文av极速乱 | 国产黄片美女视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美最新免费一区二区三区| 岛国在线免费视频观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲内射少妇av| 亚洲三级黄色毛片| 我的女老师完整版在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 久久精品影院6| 久久国产精品人妻蜜桃| 一进一出好大好爽视频| 看片在线看免费视频| 床上黄色一级片| 国产色爽女视频免费观看| 长腿黑丝高跟| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲专区国产一区二区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | a级一级毛片免费在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产三级在线视频| 99热这里只有精品一区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久99热6这里只有精品| 午夜a级毛片| 亚洲欧美精品综合久久99| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 热99在线观看视频| 久久久久性生活片| 国产男靠女视频免费网站| 无人区码免费观看不卡| 日韩精品青青久久久久久| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲午夜理论影院| av在线天堂中文字幕| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久精品国产清高在天天线| 九九爱精品视频在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 91狼人影院| 我要看日韩黄色一级片| 免费在线观看日本一区| 我要搜黄色片| 内射极品少妇av片p| 日日撸夜夜添| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 一进一出好大好爽视频| 免费av观看视频| 亚洲内射少妇av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 黄色视频,在线免费观看| 国产探花在线观看一区二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲国产欧美人成| 在线免费观看不下载黄p国产 | 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 免费大片18禁| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 美女免费视频网站| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲18禁久久av| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久久久久久久久黄片| 国产av麻豆久久久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 成年人黄色毛片网站| 999久久久精品免费观看国产| 最近在线观看免费完整版| 国产男靠女视频免费网站| 又爽又黄无遮挡网站| 一级a爱片免费观看的视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美黑人巨大hd| 国产毛片a区久久久久| 精品免费久久久久久久清纯| 国产高清视频在线播放一区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 我的女老师完整版在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 窝窝影院91人妻| 亚洲精品影视一区二区三区av| 波野结衣二区三区在线| 日韩亚洲欧美综合| 1000部很黄的大片| 1024手机看黄色片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产精品久久久久久久久免| 午夜福利在线在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品女同一区二区软件 | 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 一本一本综合久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产亚洲精品久久久com| 国产真实伦视频高清在线观看 | 精品福利观看| 国产成人aa在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 色尼玛亚洲综合影院| 日韩欧美三级三区| 亚洲欧美激情综合另类| 国产成年人精品一区二区| 男女那种视频在线观看| 久久6这里有精品| 99热精品在线国产| 99久久无色码亚洲精品果冻| 午夜免费成人在线视频| 国产单亲对白刺激| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲精品影视一区二区三区av| av天堂中文字幕网| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美日韩综合久久久久久 | 乱系列少妇在线播放| 国产一区二区在线观看日韩| 中文字幕高清在线视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲 国产 在线| av在线老鸭窝| 五月玫瑰六月丁香| 一个人看的www免费观看视频| 欧美成人a在线观看| 日本五十路高清| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产成人福利小说| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 婷婷六月久久综合丁香| 男女那种视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产91精品成人一区二区三区|