組合抗體庫技術(shù)的研究進(jìn)展

強(qiáng)敏，施曉疌，張楚悅，馬培翔，楊光

上?？萍即髮W(xué) 免疫化學(xué)研究所，上海 201210

組合抗體庫（combinatorial antibody library）技術(shù)是現(xiàn)代免疫化學(xué)的重要組成部分[1-2]。它是一種構(gòu)建大容量、高多樣性的文庫，并利用生物進(jìn)化原理進(jìn)行優(yōu)化重組和淘篩的技術(shù)。其特征是通過組合策略獲得豐富的多樣性，將基因型和表型有機(jī)整合以實(shí)現(xiàn)表型的可復(fù)制，并在一個可篩選的體系中將符合所需表型的分子淘篩出來。這一技術(shù)可以從B細(xì)胞中克隆抗體重鏈和輕鏈的基因序列，在體外重組構(gòu)建抗體基因文庫，其多樣性高達(dá)1011～1012[3]。建立組合抗體庫的基本原理是模擬獲得性免疫系統(tǒng)的特征，通過基因重排和篩選的策略獲得適合的抗體。組合抗體庫的生物學(xué)特征包括：①可在試管中構(gòu)建多樣性達(dá)1011的合成免疫系統(tǒng)；②模擬天然免疫系統(tǒng)基因型與表型相聯(lián)系的復(fù)制系統(tǒng)；③減少傳統(tǒng)免疫抗體獲得時對活體動物的依賴；④規(guī)避免疫耐受問題，可獲得識別自身抗原的抗體；⑤包含供者終生完整抗體反應(yīng)的所有記錄；⑥可揭示一些罕見的特殊抗體譜。根據(jù)組合抗體庫的大小，通過核糖體載體、噬菌體載體、酵母載體、細(xì)菌載體、細(xì)胞載體等的表面展示抗體，其中噬菌體載體可展示的庫容量最大[4]。此外，將抗體分泌表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中、錨定在細(xì)胞膜上或滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上等技術(shù)，可以進(jìn)一步拓展組合庫的應(yīng)用范圍。根據(jù)表面展示抗體形式的不同，組合抗體庫分為Fab抗體庫、單鏈抗體（scFv）庫和納米抗體（nanobody）庫等。

細(xì)胞展示技術(shù)巧妙地將組合庫抗體的基因型與表型有機(jī)整合在一起，而細(xì)胞所承載的生物功能決定了可采用的篩選方法[5]。噬菌體庫的篩選原理是基于親和力進(jìn)行淘篩的。大多數(shù)情況下，研究人員希望篩選獲得的抗體也具有靶點(diǎn)調(diào)控功能。由于噬菌體的宿主大腸桿菌缺乏蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，而后者是發(fā)揮生物功能的關(guān)鍵之一，因此噬菌體系統(tǒng)可用的篩選策略受到限制。針對這一問題，科研人員對篩選體系進(jìn)行了改造：在哺乳動物細(xì)胞中同時表達(dá)功能報告系統(tǒng)，開發(fā)出基于單細(xì)胞自分泌[6-7]和基于細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的組合庫篩選體系[8-10]。組合抗體庫技術(shù)的發(fā)展歷程如圖1所示。

圖1 組合抗體庫技術(shù)的發(fā)展歷程

1 基于親和力的組合抗體庫篩選系統(tǒng)

基于親和力的組合抗體篩選系統(tǒng)包括噬菌體展示抗體庫和酵母表面展示抗體庫。噬菌體展示抗體庫是體外篩選特定抗原高親和力抗體最常用的技術(shù)（圖2）。其原理為：從免疫個體或健康個體的B淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增全套抗體的重鏈和輕鏈mRNA或RNA文庫，經(jīng)噬菌體表面展示系統(tǒng)表達(dá)后形成噬菌體文庫，即噬菌體抗體庫（phage antibody library）。1985年George P.Smith[11]首次描述噬菌體展示技術(shù)，并證實(shí)絲狀噬菌體可用于展示多肽。1989年Richard A.Lerner實(shí)驗(yàn)室報道首個噬菌體展示抗體庫，構(gòu)建了展示于λ噬菌體表面的鼠源組合Fab抗體庫，其多樣性與小鼠的天然免疫系統(tǒng)相當(dāng)甚至更高，并從中鑒定出功能性抗體[12]。1990年Gregory Winter實(shí)驗(yàn)室報道了一個基于scFv的噬菌體展示庫，也證實(shí)從噬菌體群體中篩選出抗體的可行性[13]。噬菌體抗體庫可用于結(jié)合被固定的抗原做篩選，篩選富集的噬菌體經(jīng)測序可獲得對應(yīng)的抗體序列。因?yàn)槭删w顆粒的尺寸較小且高度可溶 （1013個/mL），所以噬菌體庫的多樣性可達(dá)1011，這有利于在體外篩選全人源序列的抗體。目前已有超過70種噬菌體來源的抗體進(jìn)入臨床研究，14種已獲批準(zhǔn)[14]。如今在獲美國食品及藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)的100多種抗體中，包括銷售額最高的阿達(dá)木單抗等，至少有11種是通過組合抗體庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)的（表1）[5]。2018年，組合抗體庫技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎。

表1 FDA批準(zhǔn)的來源于組合抗體庫的抗體類藥物[5]

圖2 基于親和力的篩選原理圖

噬菌體庫篩選得到的治療性抗體可用于癌癥、炎癥、感染及免疫性疾病的治療[14]，這些抗體靶向的是針對細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞信號通路、病毒信號通路或GPCR等細(xì)胞膜和胞外的蛋白。此外，也有關(guān)于胞內(nèi)表達(dá)抗體篩選的技術(shù)和基于細(xì)胞膜呈遞抗原的技術(shù)被報道[4,28]。

離子通道是多種神經(jīng)性、心血管性、代謝性疾病，以及癌癥和免疫調(diào)節(jié)的重要藥物靶點(diǎn)，它在可興奮性組織和非興奮性組織中都發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這類靶點(diǎn)的生物藥以功能性的毒素肽和抗體為主，它們識別與作用的位點(diǎn)是離子通道的胞外區(qū)域[29]。但是，篩選對離子通道亞型具有選擇性和特異性的藥物很有挑戰(zhàn)。通過技術(shù)的優(yōu)化，噬菌體組合抗體庫技術(shù)針對酸敏感離子通道1a（acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a）及連接蛋白26（connexin 26,Cx26）成功篩選到了高特異性的抗體。

酸敏感離子通道（ASICs）是受質(zhì)子調(diào)控的一類非電壓敏感型陽離子通道，其中ASIC1a是缺血性卒中治療的一個極有潛力的靶點(diǎn)[30]。Qiang等[31]通過表達(dá)人源ASIC1a的膜蛋白并將其組裝至納米磷脂盤（nanodisc）中獲得模擬該離子通道保持天然構(gòu)象的hASIC1a-nanodisc復(fù)合物，以此為抗原進(jìn)行噬菌體庫的抗體篩選。使用多樣性達(dá)1011的全人源噬菌體抗體庫進(jìn)行了3輪篩選，獲得數(shù)條富集的scFv抗體序列，其中ASC06抗體具有特異性識別細(xì)胞表面表達(dá)的ASIC1a的特點(diǎn)。細(xì)胞水平的研究顯示，該ASC06-IgG抗體可濃度依賴地抑制ASIC1a通道的電流，且能挽救酸中毒引起的細(xì)胞死亡。對腦中動脈阻塞模型小鼠，缺血1小時再灌注2小時后注射ASC06-IgG，可使小鼠的腦梗死體積顯著下降（約42%）。ASC06-IgG顯示出強(qiáng)效的神經(jīng)保護(hù)作用。制備ASIC1a與ASC06抗體的復(fù)合物時，負(fù)染電鏡結(jié)果顯示該抗體以1:1的計量比結(jié)合在一個ASIC1a亞基上，即每個三聚體組成的ASIC1a通道上可結(jié)合3個ASC06抗體，這與其他毒素肽的結(jié)合模式類似[31]。此抗體具有良好的應(yīng)用前景。

連接蛋白（connexin,Cx）是組成細(xì)胞間隙連接通道（gap junction channel,GJC）的關(guān)鍵蛋白之一[32]，它的錯義點(diǎn)突變會形成泄露的半通道（hemi channel,HC），引起角膜炎-魚鱗病-耳聾（KID）綜合征等疾病[33-34]。Xu等[35]針對Cx26進(jìn)行了抗體篩選，他們以人源Cx26蛋白胞外第一段環(huán)形結(jié)構(gòu)域多肽為抗原，使用噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選，獲得了特異結(jié)合細(xì)胞表面Cx26的scFv-Fc抗體AbEC1.1。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該抗體是一種完全可逆的Cx26 HCs抑制劑，且不影響GJCs的功能。更重要的是，該抗體能有效抑制Cx26 HCs突變體（G45E、D50N）引起的病理性過度活躍[35]。晶體結(jié)構(gòu)顯示該抗體會組裝為雙鏈抗體（diabody）。使用分子動力學(xué)模擬和半通道電流記錄的組合，進(jìn)一步鑒定了該抗體的表位，即兩個AbEC1.1形成的雙鏈抗體結(jié)合在一個Cx半通道的頂部，像蓋子一樣阻塞該半通道的孔道并抑制其開放，能減緩因其泄露引起的表型。研究還發(fā)現(xiàn)該抗體還可特異結(jié)合與Cx26具有相似第一段環(huán)形胞外域的Cx30，且抑制Cx30 A88V的半通道泄露和ATP過度釋放，并減輕Cx30 A88V突變小鼠（人類Clouston綜合征模型）的皮脂腺增大、皮膚過度增生等異常癥狀[36]。

除了新抗體的篩選，抗體的親和力成熟是基于親和力篩選系統(tǒng)的另一項(xiàng)重要應(yīng)用?？贵w和抗原結(jié)合的強(qiáng)度稱為親和力，它可以用解離常數(shù)KD進(jìn)行表征。親和力是評價抗體性質(zhì)的重要參數(shù)。在生物個體內(nèi)，抗體對抗原的高親和力意味著強(qiáng)有力的識別，可更高效地激活免疫系統(tǒng)，清除病原體。體內(nèi)B細(xì)胞作為獲得性免疫的重要部分，在首次接觸一種病原抗原后會產(chǎn)生一定量的抗原特異性IgM和IgG類型抗體，而一段時間后當(dāng)相同抗原的二次免疫發(fā)生時，相應(yīng)B細(xì)胞基因組上的抗體序列將發(fā)生體細(xì)胞高頻突變，并且這些細(xì)胞在二級淋巴器官生發(fā)中心進(jìn)行高親和力突變克隆的克隆選擇，保留并擴(kuò)增親和力更好的B細(xì)胞克隆，完成抗體的體內(nèi)親和力成熟，親和力往往可以達(dá)到數(shù)個數(shù)量級的提升。最后這些被選擇的細(xì)胞將進(jìn)一步分化成為漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞。

對于抗體藥物而言，親和力特征是直接影響藥效、穩(wěn)定性甚至安全性的一個重要參數(shù)。通常情況下，人們希望獲得的抗體候選藥物具有高親和力，因此，高親和力抗體往往具有更大的成藥潛能。進(jìn)入臨床研究階段的抗體候選藥物的親和力大多已經(jīng)強(qiáng)于納摩爾級別，如靶向TNFα的adalimumab的KD為30 pmol/L、靶向PD-1的pembrolizumab的KD為27 pmol/L、靶向IL-5的mepolizumab的KD約為100 pmol/L等。初篩抗體親和力不高時，需要額外的方法和步驟對所獲抗體進(jìn)行優(yōu)化，此步驟被稱為抗體的體外親和力成熟。

抗體體外親和力成熟的基本原理是模仿抗體的體內(nèi)親和力成熟過程。對于已知抗體，利用點(diǎn)突變（定點(diǎn)突變和隨機(jī)誘變）、CDR區(qū)重組、鏈替換以及DNA重組等方法，在已有序列上進(jìn)行多樣性擴(kuò)增建成二級庫，篩選獲取更優(yōu)親和力的候選抗體[37]。親和力成熟的篩選方法，基本原理是優(yōu)化抗體和抗原相互作用時的動力學(xué)特征，主要是對抗體的解離速率進(jìn)行優(yōu)化。通過增加解離孵育時間、降低抗原結(jié)合濃度、引入抗原競爭性結(jié)合物等方法或者幾種方法的組合，從已結(jié)合的抗體中篩選出結(jié)合強(qiáng)度更好的抗體[38]。

體外親和力成熟使用較多的是酵母展示及淘篩技術(shù)[39-40]。酵母相較于噬菌體，擁有更接近于哺乳動物細(xì)胞的蛋白翻譯后修飾機(jī)制，而這對于親和力可能產(chǎn)生重要影響。酵母展示的Fab抗體更接近于天然抗體，可有效解決一些情況下scFv庫篩選獲得的抗體轉(zhuǎn)化成全長IgG后的效力損失問題[41]。此外，酵母尺寸遠(yuǎn)大于噬菌體，可利用流式細(xì)胞儀分選，篩選過程便能可視化地區(qū)分不同強(qiáng)度結(jié)合狀態(tài)的克隆，并任意設(shè)置篩選閾值，非常有利于親和力成熟的篩選。

Shi等[42]在對噬菌體組合抗體庫篩選后獲得了抑制CXC基序趨化因子受體2（CXC-motif chemokine receptor 2,CXCR2）的候選抗體，然而在面對體內(nèi)CXCR2高親和力（納摩爾級別KD值）、且局部高濃度的天然配體IL-8時，此抑制劑親和力不足，使得無法有效競爭IL-8，從而使其不具備足夠的藥物開發(fā)潛力。因此，他們在抗體表位識別中起到關(guān)鍵作用的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3（H-CDR3）進(jìn)行隨機(jī)突變，篩選酵母展示的突變文庫。為了不使突變程度過大而遠(yuǎn)離設(shè)定靶點(diǎn)的識別，研究人員采用基于核酸序列的每個堿基30%隨機(jī)突變概率，最終獲得皮摩爾級別親和力的抑制型抗體，在動物體內(nèi)的炎癥模型驗(yàn)證中顯示出極強(qiáng)的中性粒細(xì)胞抑制功能和炎癥消退功能。

Tao等[43]利用噬菌體庫對瘦素受體（LepR）篩選靶向抗體，初篩獲得兩個具有激動劑功能的scFv抗體。雖然具有新型的激動劑模式，然而它們對LepR的激活能力弱于它的天然配體（瘦素），因此使用酵母展示突變庫篩選的方法優(yōu)化候選抗體親和力。他們設(shè)計了一種基于氨基酸序列的隨機(jī)飽和點(diǎn)突變策略，首先控制突變范圍為重鏈CDR3區(qū)域隨機(jī)的4個氨基酸殘基，然后每個密碼子采用NNK突變策略，從而實(shí)現(xiàn)向20個氨基酸密碼子的飽和突變，可產(chǎn)生2×107變體多樣性，最終成功地獲得了7個親和力大幅提高的突變體，在磷酸化報告系統(tǒng)試驗(yàn)和受體信號相關(guān)的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中均展現(xiàn)出優(yōu)于天然配體（瘦素）的性質(zhì)。

在可成藥靶點(diǎn)中，尤其是對于通常不能跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗體藥物而言，膜受體如GPCR、離子通道、膜受體酪氨酸激酶、各種轉(zhuǎn)運(yùn)受體等占據(jù)著重要的位置。在抗體親和力成熟的過程中，任何影響抗體-抗原相互作用的干擾因素都不可忽視，例如線性表位和靶點(diǎn)天然構(gòu)象間的差異。因此，膜受體相對復(fù)雜的胞外域結(jié)構(gòu)、配體結(jié)合的多樣性，不僅給有效的抗原純化帶來了困難，而且純化的抗原與天然抗原的差異也成為其功能性抗體親和力成熟中一大干擾因素[44-45]。針對這個問題，Yang等[9]開發(fā)了基于酵母-細(xì)胞相互作用的親和力成熟體系，利用酵母展示Fab抗體庫，對表達(dá)在細(xì)胞表面的受體成功地進(jìn)行了親和力成熟。與對于全細(xì)胞展示的抗原篩選方法不同的是，Yang等的策略結(jié)合了細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的特性，并利用流式細(xì)胞分選技術(shù)，在已有結(jié)合的群體中差異性地篩出高親和力抗體，有效地解決了非特異性的問題[46-47]。

抗體親和力成熟的篩選過程不僅可用于優(yōu)化抗體的親和力，基于篩選設(shè)計的選擇方向，同樣可以用抗體識別選擇性的優(yōu)化。例如，在抗體初始的篩選過程中，出于治療應(yīng)用的目的往往選擇人源受體作為篩選抗原，使得所獲抗體可能具有種屬特異性。但這可能對于之后驗(yàn)證抗體效果的動物實(shí)驗(yàn)帶來困擾。對于已經(jīng)獲得的特異性識別人源抗原的抗體，可構(gòu)建突變的酵母展示抗體庫，用人源靶點(diǎn)和鼠源靶點(diǎn)進(jìn)行交叉篩選，最終獲得可交叉識別人和鼠靶點(diǎn)的新抗體，如LepR激動型抗體和CXCR2抑制性抗體，為之后的臨床前動物研究鋪平道路[43]。值得注意的是，這樣的方法能夠同時在抗體的特異性和親和力方面獲得優(yōu)化。

2 基于細(xì)胞自分泌的組合抗體庫篩選系統(tǒng)

由于噬菌體宿主大腸桿菌的局限性，為了拓展功能抗體的篩選策略，部分課題組將靶抗原和對應(yīng)其功能的報告系統(tǒng)同時表達(dá)在同一株細(xì)胞中，用于抗體篩選。例如，為了使陽性篩選表型與相應(yīng)抗體的基因型相偶聯(lián)，Lerner等[6]創(chuàng)立了一套細(xì)胞自分泌篩選系統(tǒng)（圖3），即用上述帶有靶點(diǎn)報告系統(tǒng)的細(xì)胞展示抗體庫，展示的抗體作用于自身細(xì)胞上的靶點(diǎn)，產(chǎn)生陽性信號的細(xì)胞被分選富集并獲取胞內(nèi)相應(yīng)抗體的DNA序列，這一體系的原理類似于細(xì)胞分泌的因子作用于自身受體的自分泌效應(yīng)。

自分泌篩選系統(tǒng)的主要目的是直接篩選功能性抗體。Tao等[43]根據(jù)LepR的胞內(nèi)段可以介導(dǎo)瘦素激活受體后引起的JAK-STAT信號通路響應(yīng)的原理， 構(gòu)建了STAT3磷酸化激活響應(yīng)激活報告系統(tǒng)，包括GFP、luciferase和β-lactamase，再通過轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)等方法構(gòu)建了此報告系統(tǒng)和LepR過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)篩選細(xì)胞株[43]。另外，研究人員還構(gòu)建了長程響應(yīng)LepR激活的增殖相關(guān)聯(lián)的Ba/F3篩選細(xì)胞系。接著他們采用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，將LepR預(yù)富集的抗體庫展示在這些構(gòu)建好的功能篩選細(xì)胞上，結(jié)合FACS技術(shù)和增殖篩選方法，篩選獲得了具有激動劑功能的抗體。最后，研究人員在體外各種信號檢測模型中鑒定了抗體的功能，并在肥胖小鼠的體內(nèi)模型中，驗(yàn)證了此抗體通過激活LepR產(chǎn)生節(jié)食、代謝調(diào)控的減肥功能。

Xie等[6,48-49]利用自分泌功能篩選，針對粒細(xì)胞集落刺激因子受體（GCSF-R）也成功篩選獲得了激動型抗體。更有意思的是，他們發(fā)現(xiàn)此激動型抗體可以促使人骨髓造血干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞的分化，展現(xiàn)了通過功能篩選獲得抗體，可能具有天然配體所不具備的受體多效性激活能力。這種情況同樣在利用功能篩選系統(tǒng)獲得的促血小板生成因子受體（TPO-R）的激動型抗體上出現(xiàn)，其可以誘導(dǎo)急性髓系白血病病人的癌細(xì)胞向自然殺傷性細(xì)胞（NK cell）分化，并反過來殺傷其他白血病細(xì)胞[50]。針對紅細(xì)胞生成素受體（EPO-R）建立自分泌篩選系統(tǒng)，篩選其激動劑，最終成功獲得激動型抗體[51]。這些功能都是受體相應(yīng)的天然配體所沒有的，展現(xiàn)了功能性抗體篩選在臨床上拓展應(yīng)用的巨大價值。

功能篩選的另一個優(yōu)勢是，可以進(jìn)行靶點(diǎn)未知的非偏向性功能篩選。為獲取具有誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化能力的功能性抗體，Lerner實(shí)驗(yàn)室研究人員以幼紅細(xì)胞系TF1為篩選細(xì)胞，慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)展示抗體庫，并在凝膠克隆形成實(shí)驗(yàn)中根據(jù)細(xì)胞形態(tài)篩選找到可以使細(xì)胞克隆分化至樹突狀細(xì)胞的功能性抗體，經(jīng)鑒定其靶點(diǎn)為細(xì)胞整合素[52]。值得注意的是，在此篩選工作前并未預(yù)設(shè)抗體功能和靶點(diǎn)，是完全非偏向性的篩選，此方式適用于新靶點(diǎn)和新功能的篩選。在實(shí)驗(yàn)室另一個抗病毒作用抗體的篩選工作中，研究人員同樣在未預(yù)設(shè)靶點(diǎn)的情況下，篩選得到可以保護(hù)HeLa-H1細(xì)胞免受鼻病毒感染致死的功能抗體，隨后鑒定其靶點(diǎn)為病毒的3C蛋白酶[53]。該工作證明此靶點(diǎn)作為抗病毒藥物靶點(diǎn)的可行性和重要性，另外還展現(xiàn)了此方法直接將靶點(diǎn)驗(yàn)證和藥物篩選合二為一的應(yīng)用潛能。2017年，同樣運(yùn)用這種非偏向性自分泌功能篩選系統(tǒng)，Lerner實(shí)驗(yàn)室和合作者共同報道了能夠替代轉(zhuǎn)錄因子Sox2誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞重編程至iPS細(xì)胞的功能性抗體，隨后鑒定其靶點(diǎn)為細(xì)胞表面蛋白Basp1[54]。此工作不僅提供了新的重編程相關(guān)靶點(diǎn)，也將重編程誘導(dǎo)從細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子向細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)變進(jìn)了一步，具有重要的學(xué)術(shù)和應(yīng)用雙重價值。

3 基于細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的組合抗體庫篩選系統(tǒng)

細(xì)胞相互作用是生物功能的基礎(chǔ)，而細(xì)胞相互作用的基礎(chǔ)就是蛋白與蛋白的相互作用。新型的免疫細(xì)胞藥物，正是通過免疫細(xì)胞表面的受體和腫瘤細(xì)胞表面的配體結(jié)合進(jìn)行識別，因此利用細(xì)胞-細(xì)胞相互作用進(jìn)行免疫細(xì)胞藥物的篩選將極大地推動新型免疫細(xì)胞藥物的開發(fā)。嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）免疫療法是免疫細(xì)胞療法中較為成功、使用較為廣泛的療法。臨床試驗(yàn)中，針對B細(xì)胞表面抗原CD19的CAR-T用于治療血液瘤產(chǎn)生了顯著的療效[55-56]，靶向成熟B細(xì)胞抗原（BCMA）的CAR-T療法也對多發(fā)性骨髓瘤產(chǎn)生了顯著的療效[57]。2017年8月30日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)首個CAR-T療法Kymriah上市，用于治療難治或復(fù)發(fā)的急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）。截至2021年4月，全球已經(jīng)有5款CAR-T產(chǎn)品上市。但是，CAR-T治療仍然存在著一些問題，例如on-target/off-tumor毒性、細(xì)胞因子風(fēng)暴（CRS）、神經(jīng)毒性等[58]。

在整個CAR-T免疫療法中，嵌合抗原受體（CAR）是一個非常重要的組成部分。CAR是表達(dá)在T細(xì)胞膜上模塊化的融合蛋白，用于識別抗原，通常是由胞外識別區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)，包括CD3ζ和共刺激分子（例如CD28、CD137等）組成[59]。胞外識別區(qū)識別腫瘤細(xì)胞表面的抗原，引導(dǎo)T細(xì)胞識別腫瘤靶細(xì)胞，常用單鏈抗體（scFv）作為胞外識別區(qū)。腫瘤表面抗原分腫瘤特異性抗原（TSA）和腫瘤相關(guān)抗原（TAA），TSA非常少，絕大部分可用抗原為TAA。TAA在正常組織細(xì)胞中也有表達(dá)，這就使T細(xì)胞會對正常的組織細(xì)胞進(jìn)行殺傷，從而產(chǎn)生on-target/off-tumor的脫靶效應(yīng)[60]。例如，針對腎細(xì)胞癌的第一代碳酸酐酶Ⅸ（CAⅨ）的CAR-T治療中，由于CAⅨ在正常胃黏膜、小腸細(xì)胞上低表達(dá)，脫靶效應(yīng)引起自身免疫性膽管炎和嚴(yán)重的肝損傷[61]。

針對脫靶問題，Ma等[8]開發(fā)了一個利用細(xì)胞間相互作用進(jìn)行篩選的組合CAR細(xì)胞庫（CCC）策略（圖4）。該CCC文庫在細(xì)胞中整合了以單鏈抗體庫為基礎(chǔ)的CAR文庫，細(xì)胞攜帶有報告基因，可通過細(xì)胞間的相互作用直接進(jìn)行CAR篩選。在該研究中，通過CCC分別與CD38低表達(dá)的正常細(xì)胞和CD38高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞孵育進(jìn)行負(fù)向和正向差異化篩選，獲得多條有效CAR序列，其中包括優(yōu)選序列CAR-RP02。雖然CARRP02的親和力弱于傳統(tǒng)方法得到的CAR-028，但是裝載了CAR-RP02的CAR-T細(xì)胞無論是在對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷還是細(xì)胞因子分泌等方面均優(yōu)于CAR-028。CAR-RP02具有更低的脫靶效應(yīng)，當(dāng)RP02-CAR-T細(xì)胞和028-CAR-T細(xì)胞分別與低表達(dá)CD38的正常細(xì)胞共孵育后，RP02-CAR-T細(xì)胞基本被CD38低表達(dá)的正常細(xì)胞激活，且不殺傷這些細(xì)胞；而高親和力的028-CAR-T細(xì)胞清除了大部分的CD38低表達(dá)的正常細(xì)胞。通過CD38的mRNA定量研究發(fā)現(xiàn)，RP02和028區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的關(guān)鍵因素是CD38在細(xì)胞中的表達(dá)量。結(jié)構(gòu)表征進(jìn)一步證明RP02在CD38上的結(jié)合靶位亦不同于028。所構(gòu)建的RP02-CAR-T細(xì)胞在小鼠的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)中顯示良好的治療效果。該研究為解決CAR-T開發(fā)過程中所面臨的特異性靶點(diǎn)不足、無法區(qū)分腫瘤/正常細(xì)胞所造成的脫靶效應(yīng)，以及免疫細(xì)胞治療中的免疫耐受問題提供了一種新的解決方案。

圖4 基于細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的篩選原理圖

除了單一的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，組合庫還可以在更為復(fù)雜的體系中發(fā)揮作用。Zheng等[10]對噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行改良，他們利用微液滴構(gòu)建了一個小的生態(tài)系統(tǒng)庫，每個液滴中都含有一個展示抗體的噬菌體和報告細(xì)胞，如果抗體具有功能性，報告細(xì)胞將表達(dá)熒光，再通過分選、測序等方法得到候選抗體。這一系統(tǒng)首次證實(shí)，組合庫可用于復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)的功能篩選。

4 總結(jié)和展望

組合抗體庫技術(shù)針對特定靶標(biāo)，構(gòu)建大容量、高多樣性的文庫進(jìn)行淘篩，已成為一種重要的藥物發(fā)現(xiàn)手段。隨著新型藥物形式的出現(xiàn)，組合庫技術(shù)也需要不斷改進(jìn)。目前組合庫技術(shù)已經(jīng)從噬菌體文庫、酵母表面展示文庫發(fā)展到哺乳動物細(xì)胞表面展示文庫。由于展示系統(tǒng)的宿主復(fù)雜性的提高，能模擬的生物學(xué)功能更復(fù)雜，所能篩選的藥物的種類也更多，因此這些高級的宿主未來能夠承載藥物形式更復(fù)雜的文庫。從篩選策略上看，組合庫從抗體和抗原的親和力篩選，發(fā)展到單一細(xì)胞的自分泌篩選系統(tǒng)、細(xì)胞-細(xì)胞互作的篩選系統(tǒng)和迷你生態(tài)系統(tǒng)的篩選系統(tǒng)，這些篩選系統(tǒng)將在實(shí)體瘤等更為復(fù)雜的疾病的藥物開發(fā)中發(fā)揮更重要的作用。